微小RNA-199a-5p保护大鼠脑缺血后血-脑屏障完整性

目的探讨微小RNA(miR)-199a-5p保护脑缺血后血-脑屏障(BBB)完整性的机制。方法通过SPF级成年雄性SD大鼠建立永久性大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,48只大鼠随机分为假手术组、模型组、MCAO+miR-199a-5p组和MCAO+miR-199a-5p阴性对照组,每组12只。应用Ludmila Belayev 12分评分法评估大鼠的神经行为学表现;采用Evans蓝染色检测脑缺血后BBB的完整性;免疫荧光染色检测脑缺血后细胞凋亡;Western blotting技术检测claudin-5、磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基2(PIK3R2)、p-Akt、Akt和血管内皮生长因子(VEGF)-A的蛋白表达;利用Real-time PCR检测脑缺血半暗带、梗死区miR-199a-5p、claudin-5及VEGF-A表达水平。结果MiR-199a-5p mimic干预增强MCAO大鼠本体感觉和运动能力。MiR-199a-5p降低脑缺血后PIK3R2的表达,激活Akt信号通路,并增加缺血半暗带中claudin-5和VEGF-A的表达。此外,miR-199a-5p减轻了脑缺血后的炎症。MiR-199a-5p降低脑缺血后BBB渗透性,减少神经细胞凋亡。结论MiR-199a-5p可降低缺血性脑卒中后PIK3R2的表达,激活Akt信号通路,降低炎性细胞因子的表达,减轻缺血性脑卒中对BBB的破坏。

晚期结直肠癌患者血清微小RNA-199b和微小RNA-203水平检测及其预后预测价值分析

目的:检测晚期结直肠癌患者血清微小RNA(miR)-199b和miR-203水平,分析其对患者预后的预测价值。方法:选择Ⅳ期结直肠癌患者92例为结直肠癌组,选择结直肠炎患者92例为对照组。采用逆转录聚合酶链式反应检测两组血清miR-199b及miR-203水平并进行比较。根据结直肠癌患者12个月随访结果分为病死组和生存组,分析晚期结直肠癌患者预后的影响因素,评价血清miR-199b及miR-203对晚期结直肠癌患者预后的预测价值,并进行生存分析。结果:结直肠癌组血清miR-199b、miR-203低于对照组(均P<0.05)。92例Ⅳ期结直肠癌患者中病死36例,纳入病死组,其余患者纳入生存组。病死组血清基质金属蛋白酶-14(MMP-14)、趋化因子受体4(CXCR4)水平高于生存组,血清miR-199b、miR-203低于生存组(均P<0.05)。MMP-14和CXCR4是晚期结直肠癌患者病死的风险因素,miR-199b和miR-203是晚期结直肠癌患者病死的保护因素(均P<0.05)。miR-199b与MMP-14、CXCR4呈负相关(r=-0.403、-0.458,均P<0.05),miR-203与MMP-14、CXCR4呈负相关(r=-0.461、-0.479,均P<0.05)。血清miR-199b、miR-203对晚期结直肠癌患者病死均有一定预测价值,且两项联合优于单项(均P<0.05)。血清miR-199b和miR-203高表达组生存率高于低表达组(均P<0.05)。结论:晚期结直肠癌患者血清miR-199b、miR-203水平降低,对患者预后具有良好的预测价值,且两项联合预测价值更高。

血清微小RNA-199a-3p、E盒结合锌指蛋白1水平对急性冠状动脉综合征患者经皮冠状动脉介入术后预后的预测价值

目的探讨微小RNA-199a-3p(miR-199a-3p)、E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)对急性冠状动脉综合征(ACS)患者经皮冠状动脉介入(PCI)术后预后的预测价值。方法选取2021年5月至2022年5月秦皇岛市第二医院接收的行PCI术治疗的113例ACS患者为观察组,根据观察组患者PCI术后1年内是否发生主要不良心血管事件(MACE),分为MACE组26例和非MACE组87例,同期健康体检者106例为对照组。检测血清miR-199a-3p、ZEB1水平,比较MACE组和非MACE组临床资料,Pearson分析患者血清miR-199a-3p和ZEB1水平相关性,多因素Logistic分析影响ACS患者PCI术后发生MACE的影响因素,ROC曲线分析血清miR-199a-3p、ZEB1对ACS患者PCI术后发生MACE的预测价值。结果与对照组相比,观察组血清miR-199a-3p水平较低,ZEB1水平较高(t=13.709、25.641,P<0.05);在ACS患者中miR-199a-3p与ZEB1呈负相关(r=-0.421,P<0.05);ACS患者PCI术后较PCI术前血清miR-199a-3p水平高,ZEB1水平低(t=4.820、6.040,P<0.05);MACE组与非MACE组高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、左心室射血分数、miR-199a-3p、ZEB1比较,差异有统计学意义(t=3.310、2.717、3.947、7.068、6.544,P<0.05);LDL-C、ZEB1水平是ACS患者PCI术后MACE的危险因素,左心室射血分数、HDL-C、miR-199a-3p水平是ACS患者PCI术后MACE的保护因素;miR-199a-3p、ZEB1联合预测ACS患者PCI术后MACE的曲线下面积为0.947,优于单独预测(Z=1.970、2.791,P<0.05)。结论ACS患者血清中miR-199a-3p、ZEB1水平呈负相关,两者均对ACS患者PCI术后MACE有预测价值,两者联合的预测价值更高。

微小RNA-199a-5p对非小细胞肺癌紫杉醇耐药性的影响及其机制

目的 探讨微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞紫杉醇(PTX)耐药性的影响及其机制。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)分析人NSCLC细胞株A549和耐药NSCLC细胞株A549/PTX中miR-199a-5p相对表达水平;采用细胞增殖试剂盒(CCK-8)分析A549和A549/PTX细胞对PTX的耐药性;双荧光素酶实验验证miR-199a-5p与热休克因子-1(HSF-1)的靶向关系。采用CCK-8和TUNEL分别检测细胞增殖、凋亡情况;采用Western blotting检测细胞中HSF-1、热休克蛋白(HSP)90、HSP60、P-糖蛋白(P-gp)蛋白表达水平。结果 A549/PTX细胞对PTX的耐药性显著高于A549细胞(P<0.05),且A549/PTX细胞对PTX的半数抑制浓度(IC_(50))高于A549细胞。耐药细胞株A549/PTX中miR-199a-5p表达显著下调,HSF-1 mRNA显著上调(P<0.05)。在耐药细胞株A549/PTX中miR-199a-5p负靶向调控HSF-1表达(P<0.05)。在A549/PTX细胞中过表达miR-199a-5p或抑制HSF-1可降低PTX的IC_(50)值,促进细胞凋亡,下调HSF-1、HSP90、HSP60和P-gp蛋白水平(P<0.05);而过表达HSF-1则可在一定程度上逆转上调miR-199a-5p对A549/PTX细胞的影响(P<0.05)。结论 miR-199a-5p通过抑制HSF-1减弱NSCLC细胞PTX耐药性。

微小RNA-199a和微小RNA-21与急性心肌梗死患者经皮冠状动脉介入术后心肌损伤的关系研究

目的探讨血清微小RNA(miRNA)-199a、miRNA-21与急性心肌梗死(AMI)患者经皮冠状动脉介入(PCI)术后出现心肌损伤的关系。方法选取2018年6月至2020年6月本院收治的157例经PCI治疗的AMI患者作为研究对象,根据PCI术后效果分为心肌损伤组(心肌损伤患者,n=53)和心肌未损伤组(心肌未损伤患者,n=104)。所有患者均检测miRNA-199a、miRNA-21、肌钙蛋白(cTnⅠ)及肌酸激酶同工酶(CKMB)水平,比较两组治疗前后miR-199a、miRNA-21、cTnⅠ、CKMB水平,采用ROC分析miRNA-199a、miRNA-21表达水平对心肌损伤的预测价值,Pearson相关分析miRNA-199a、miRNA-21表达水平与治疗前cTnⅠ、CKMB水平相关性。结果治疗后,心肌损伤组miRNA-199a、miRNA-21表达水平均高于治疗前,心肌未损伤组miRNA-199a表达水平低于治疗前,miRNA-21与治疗前比较差异无统计学意义,且心肌损伤组miRNA-199a、miRNA-21表达水平均高于心肌未损伤组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后,心肌损伤组cTnⅠ、CKMB水平与治疗前比较差异无统计学意义,心肌未损伤组cTnⅠ、CKMB水平均低于治疗前,且心肌损伤组cTnⅠ、CKMB水平均高于心肌未损伤组,差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,miRNA-199a联合miRNA-21预测心肌损伤的AUC大于二者单独预测,特异度、灵敏度均高于二者单独预测。结论miRNA-199a联合miRNA-21在AMI治疗后心肌损伤患者具有高表达水平,可作为预测PCI治疗后心肌损伤的新指标。

急性缺血性脑卒中患者血清微小RNA-20b、微小RNA-199a水平与神经功能缺损程度及侧支循环形成的关系

目的探讨急性缺血性脑卒中(AIS)患者血清微小RNA(miRNA)-20b、miRNA-199a水平与神经功能缺损程度及侧支循环形成的关系。方法选择126例AIS患者为观察组,根据脑侧支循环形成情况进一步分为一级侧支循环组(45例)、二级侧支循环组(41例)、三级侧支循环组(40例),另选取126例健康体检者为对照组。采用实时定量PCR法检测两组研究对象血清miRNA-20b、miRNA-199a的相对表达水平,采用酶联免疫吸附试验检测3组AIS患者血清缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)水平,采用中国卒中量表(CSS)评估患者入院时神经功能缺损程度。比较观察组和对照组的血清miRNA-20b、miRNA-199a水平,3组AIS患者血清miRNA-20b、miRNA-199a、HIF-1α、VEGF水平及CSS评分,分析AIS患者血清miRNA-20b、miRNA-199a水平与CSS评分、HIF-1α、VEGF水平的相关性。结果观察组血清miRNA-20b、miRNA-199a的相对表达水平均高于对照组(均P<0.05)。随着侧支循环级数增加,AIS患者的CSS评分、血清miRNA-20b、miRNA-199a水平降低,血清HIF-1α、VEGF水平升高(P<0.05)。AIS患者的血清miRNA-20b水平与miRNA-199a水平呈正相关,且血清miRNA-20b水平、miRNA-199a水平均分别与CSS评分呈正相关,与血清HIF-1α、VEGF水平呈负相关(均P<0.05)。结论AIS患者血清miRNA-20b、miRNA-199a水平呈高表达,两者与AIS患者神经功能缺损程度呈正相关,并可能通过降低HIF-1α、VEGF表达水平,减少侧支循环的形成。

微小RNA-199对胃癌细胞增殖和迁移的影响

目的检测微小RNA(miR)-199在胃癌组织以及胃癌细胞株的表达,探讨miR-199对胃癌细胞增殖和迁移的影响。方法采用逆转录-聚合酶链反应技术检测miR-199在51例胃癌组织和配对癌旁组织以及胃癌细胞株和正常胃黏膜上皮细胞GES-1中的表达,建立miR-199过表达或低表达的胃癌细胞株,采用细胞增殖实验、细胞迁移实验、蛋白免疫印迹技术检测胃癌细胞的增殖、迁移能力的变化及其相关机制。结果 miR-199在胃癌组织中的相对表达量显著低于配对的癌旁组织,差异有统计学意义(0.2635±0.0303比1.6700±0.9613,t=13.95,P<0.001);在胃癌细胞株AGS(0.81,t=9.13,P<0.001)、SGC-7901(0.83,t=8.88,P<0.001)、MKN28(0.58,t=10.80,P<0.001)、KATO-Ⅲ(0.60,t=10.31,P<0.001)、MKN-45(0.27,t=13.10,P<0.001)中的相对表达量显著低于正常胃黏膜上皮细胞GES-1(2.1),差异有统计学意义;在胃癌细胞株MKN-45中,高表达miR-199组细胞的增殖能力、迁移能力较对照组胃癌细胞显著降低,差异有统计学意义(731±13比345±18,t=24.90,P<0.001);在胃癌细胞KATO-Ⅲ中,低表达miR-199组细胞的增殖能力、迁移能力较对照组胃癌细胞显著增强,差异有统计学意义(257±16比657±8,t=32.59,P<0.001)。双荧光素酶报告实验显示miR-199可以直接作用于TBL1XR1的3’非翻译区,调控TBL1XR1的表达。Western blot结果显示高表达miR-199后,TBL1XR1表达水平降低。结论 miR-199在胃癌组织中呈低表达,可能与胃癌细胞的增殖和迁移能力有关,miR-199的作用可能是通过调控TBL1XR1实现的。

微小RNA-199b-3p靶向调控SOX6的表达及其对结肠癌细胞SW620增殖和凋亡的影响

目的探讨微小RNA-199b-3p(miR-199b-3p)靶向调控SOX6的表达及其对结肠癌细胞SW620增殖及凋亡的影响。方法采用Lipofectamine脂质体法将miR-199b-3p抑制剂及阴性对照(NC)转染至SW620细胞并分为抑制剂组和NC组,同时以未转染的SW620细胞作对照。采用实时荧光定量PCR(QPCR)法检测3组miR-199b-3p的表达以评价转染效果,MTT法和AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术检测转染后的增殖活性及凋亡率,QPCR和Western blotting检测各组凋亡相关基因(Bax和caspase-3)及SOX6的mRNA和蛋白水平,构建含有野生型及突变型SOX6-3’UTR的荧光报告基因质粒并采用双荧光素酶报告实验验证miR-199b-3p对SOX6的靶向调控作用。结果 QPCR检测显示,转染48 h后抑制剂组的miR-199b-3p的表达水平为0.526±0.034,低于未转染组的1.009±0.064和NC组的0.960±0.057,差异有统计学意义(P<0.05);与其余两组相比,抑制剂组转染24、48、72 h后的SW620细胞的增殖活性均降低(P<0.05);抑制剂组的凋亡率为(37.533±1.459)%,高于未转染组的(6.101±0.663)%和NC组的(8.753±1.061)%,差异均有统计学意义(P<0.05);抑制剂组SW620细胞的SOX6、Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表达水平均高于未转染组和NC组,差异均有统计学意义(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验表明miR-199b-3p可显著抑制野生型SOX6-3’UTR的荧光荧光素酶活性,而对突变型质粒转染细胞的荧光素酶活性并无影响。结论 miR-199b-3p可靶向调控SOX6的表达,且下调miR-199b-3p表达可抑制SW620细胞的增殖并诱导凋亡,为结肠癌的治疗提供潜在的分子治疗靶点。

金丝桃苷下调微小RNA-199a对脂多糖诱导的人肺泡上皮细胞的影响

目的探讨金丝桃苷对脂多糖(LPS)诱导的人肺泡上皮细胞(HPAEpiC)的影响及分子机制。方法将HPAEpiC分为对照组、模型组、金丝桃苷低、中、高剂量药物组、anti-miR-NC组、anti-miR-199a组、高剂量药物组+miR-NC组、高剂量药物组+miR-199a组。四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-199a表达水平;蛋白质印迹(Western blotting)法检测裂解的半胱天冬蛋白酶3(Cleaved-caspase3)、半胱天冬蛋白酶3前体(pro-caspase3)的蛋白表达。结果金丝桃苷处理后,LPS诱导的HPAEpiC中细胞OD值升高,金丝桃苷低、中、高剂量药物组OD值分别为(0.49±0.02)、(0.60±0.03)、(0.72±0.03),G0/G1期细胞所占比例降低,S期细胞所占比例升高,细胞凋亡率降低,TNF-α、IL-1β水平降低,miR-199a表达水平降低,Cleaved-caspase3表达水平降低,pro-caspase3表达水平升高,且呈剂量依赖性(P<0.05);抑制miR-199a表达可抑制LPS诱导的HPAEpiC细胞凋亡和炎症因子的释放。且miR-199a过表达逆转了金丝桃苷提取物对LPS诱导的HPAEpiC细胞凋亡和炎症因子的作用。结论金丝桃苷可能通过下调miR-199a抑制LPS诱导的HPAEpiC细胞凋亡和炎症反应。

微小RNA-199a-5p通过靶向SIRT1促进心肌纤维化相关基因表达

目的:研究微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)对心肌成纤维细胞中纤维化相关基因表达的调控作用及其可能作用的靶基因。方法:原代分离并体外培养成体C57BL/6小鼠心肌成纤维细胞;双萤光素酶报告基因实验检测miR-199a-5p与潜在靶基因沉默信息调节因子1(SIRT1)3’端非翻译区(3’-UTR)的结合作用;实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和Western blot法分别检测SIRT1以及纤维化标志物胶原蛋白(Col)1a1、Col3a1和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA和蛋白表达。结果:在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的小鼠心肌成纤维细胞中,Col1a1、Col3a1和α-SMA的表达增强,miR-199a-5p表达上调。在心肌成纤维细胞中过表达miR-199a-5p可以增强Col1a1、Col3a1和α-SMA的表达。双萤光素酶报告基因实验显示miR-199a-5p与SIRT1 3’-UTR有结合作用。RT-q PCR和Western blot结果证实miR-199a-5p可在转录水平抑制SIRT1表达。过表达miR-199a-5p和沉默SIRT1均能一致性促进心肌成纤维细胞中Col1a1、Col3a1和α-SMA的表达。抑制AngⅡ诱导的小鼠心肌成纤维细胞中NF-κB激活,可显著降低miR-199a-5p表达。结论:SIRT1是miR-199a-5p的作用靶基因,并介导miR-199a-5p促进纤维化标志物Col1a1、Col3a1和α-SMA的表达。

微小RNA-199a靶向调控沉默信息调节因子1对脑梗死大鼠神经元凋亡的影响

目的探讨微小RNA-199a(miR-199a)对脑梗死大鼠神经元凋亡的影响及对沉默信息调节因子1(SIRT1)的调控作用。方法构建脑梗死大鼠实验模型,将60只大鼠随机分为假手术组、脑梗死组、miR-199a抑制组、miR-199a阴性对照组、miR-199a抑制+SIRT1抑制组,每组12只。通过神经行为学评估判断大鼠神经功能变化,采用苏木精-伊红(HE)染色法观察各组大鼠脑组织神经元病理变化,采用流式细胞术检测脑皮质神经元凋亡情况,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测各组脑组织中miR-199a、SIRT1 mRNA表达水平,并通过蛋白质印迹法(Western blot)检测各组脑组织SIRT1、活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3)蛋白表达量。采用双荧光素酶报告基因系统验证miR-199a和SIRT1的靶向调控关系。结果与假手术组相比,脑梗死组大鼠脑组织出现变性、神经元坏死情况,神经元凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表达量、神经学评分和miR-199a表达量升高,SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05);与miR-199a阴性对照组相比,miR-199a抑制组神经元坏死程度减弱,脑组织结构逐渐恢复,神经元凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表达量、神经学评分和miR-199a表达量降低,SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05);与miR-199a抑制组相比,miR-199a抑制+SIRT1抑制组神经元坏死及脑组织变性程度加剧,神经元凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表达量和神经学评分升高,SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05);miR-199a阴性对照组以上指标与脑梗死组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-199a可与野生型SIRT13′-UTR特异性结合,两者具有靶向调控关系。结论抑制miR-199a表达可靶向上调SIRT1表达水平,缓解脑梗死大鼠神经元凋亡,改善神经功能。

微小RNA-199a-5p调控Klotho表达对体外脑缺血再灌注大鼠氧-葡萄糖剥夺/再灌注诱导的肾上腺嗜铬瘤细胞损伤的保护作用

目的探究抑制微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)表达对体外脑缺血再灌注(I/R)损伤大鼠模型氧-葡萄糖剥夺/再灌注(OGD/R)诱导的肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)损伤的保护作用,并进一步探讨Klotho在该过程中的作用。方法将PC12细胞分为Control组、OGD/R组、miR-NC inhibitor组、miR-199a-5p inhibitor组、miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1组和miR-199a-5p inhibitor+shRNA-Klotho组。RT-qPCR或蛋白质印迹法(Western blotting)确定各组PC12细胞转染效率;胆囊收缩素/缩胆囊素八肽(CCK-8)和流式细胞术确定各组PC12细胞活力和凋亡率;试剂盒测量各组PC12细胞中活性氧(ROS)释放量、丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组PC12细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和白细胞介素-6(IL-6)水平;双荧光素酶报告基因实验检测miR-199a-5p与Klotho靶向关系。结果在OGD/R诱导的PC12细胞中,miR-199a-5p表达增高,Klotho表达降低;细胞活力降低,凋亡率增高;ROS释放量和MDA含量以及TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6水平升高,SOD和GSH-Px活性降低(P<0.05)。转染miR-199a-5p抑制物减弱了OGD/R的诱导PC12细胞活力下降和细胞凋亡率增高;削弱了暴露于OGD/R的PC12细胞中ROS释放量和MDA含量以及TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6水平,并提高了SOD与GSH-Px活性(P<0.05),而miR-199a-5p抑制物对OGD/R诱导PC12细胞的这些作用可被敲低的Klotho逆转(P<0.05)。另外,miR-199a-5p负靶向调控Klotho表达(P<0.05)。结论抑制miR-199a-5p通过靶向Klotho减轻氧化应激和炎症反应来改善OGD/R诱导的PC12细胞损伤。

微小RNA-199b-5p在甲状腺乳头状癌中的表达及意义

目的探讨微小RNA-199b-5p（ microRNA-199b-5p，miR-199b-5p）在甲状腺乳头状癌（ papil-lary thyroid carcinoma ，PTC）中的表达及与临床特征之间的关系。方法提取36例PTC及其癌旁正常甲状腺组织标本的总RNA，采用逆转录实时定量聚合酶链反应（ quantitative real-time polymerase chain reac-tion，qRT-PCR）方法检测miR-199b-5p的表达情况，并分析其与包膜侵犯、淋巴结转移等临床特征之间的关系。结果 miR-199b-5p的表达与PTC的淋巴结转移状态（χ2＝9.20，P＝0.01）、包膜侵犯（U＝36.00， P＝0.047）相关，而与其他临床特征之间均无相关性（年龄、性别、肿瘤直径、癌灶数量， U 值分别为151.00、87.00、64.00、87.00，P＞0.05）；ROC曲线分析显示，miR-199b-5p诊断PTC患者的特异性和敏感性分别为82.1％和72.7％。结论 miR-199b-5p在PTC中的异常表达可能与PTC的发生、发展及侵袭性有关。

姜黄素介导微小RNA-199a-3p基因对前列腺癌细胞的影响

目的探讨姜黄素调控微小RNA-199a-3p(miR-199a-3p)的表达对前列腺癌C4-2细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法(1)将体外培养的前列腺癌C4-2细胞分为4组:空白组(无药物干预)和低、中、高3个剂量实验组(20,40,80μmol·L^-1姜黄素干预),选取对C4-2细胞的增殖抑制最明显姜黄素浓度用于以下实验。(2)将体外培养的前列腺癌C4-2细胞分为3组:空白对照组(仅加入脂质体)、第1转染组和第2转染组,第1转染组、第2转染组分别转染阴性对照物与miR-199a-3p抑制物后再加入姜黄素40μmol·L^-1处理。用溴化噻唑蓝四氮唑法检测细胞增殖水平,以Transwell法检测细胞迁移和侵袭水平,以实时荧光定量-PCR法检测miR-199a-3p基因表达(2﹣△△Ct值),以蛋白质印迹法检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、Wnt/β-catenin通路β-catenin、Cyclin D1和c-Myc蛋白表达(灰度值的比值)。结果(1)空白组和低、中、高3个剂量实验组干预72 h的细胞增殖率分别为(1.76±0.31)%,(1.52±0.27)%,(0.78±0.16)%和(0.95±0.19)%,低、中、高3个剂量实验组与空白组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05),其中40μmol·L^-1姜黄素对C4-2细胞的增殖抑制最明显,故选用该浓度做后续实验。空白组和中剂量实验组的细胞迁移数目分别为(165.48±27.83)和(68.42±16.67)个;这2组的细胞增殖数目分别为(104.62±21.64)和(43.58±10.91)个;这2组的miR-199a-3p基因表达量分别为1.03±0.12和3.91±0.29,中剂量实验组与空白组比较,以上指标的差异均有统计学意义(均P<0.05)。(2)空白对照组、第1转染组和第2转染组在转染72 h的细胞增殖率分别为(0.95±0.19)%,(0.95±0.27)%和(1.66±0.41)%;这3组的细胞迁移数目分别为(62.45±12.11),(71.52±15.12)和(138.46±39.49)个;这3组的细胞侵袭数目分别为(34.49±8.43),(39.34±9.46)和(81.49±24.16)个;这3组的MMP-2表达分别为0.46±0.11,0.45±0.13和0.76±0.17;这3组的MMP-9表达分别为0.36±0.11,0.38±0.12和0.59±0.15;这3组的β-catenin表达分别为0.53±0.13,0.49±0.16和0.71±0.17;这3组的Cyclin D1表达分别为0.26±0.09,0.29±0.11和0.69±0.15;这3组的c-Myc表达分别为0.21±0.06,0.22±0.07和0.56±0.12。以上指标:第2转染组与空白对照组比较,或第2转染组与第1转染组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论姜黄素可上调miR-199a-3p基因的表达,从而抑制前列腺癌C4-2细胞的增殖、迁移和侵袭。

恩替卡韦通过微小RNA-199a-5p抑制乙型肝炎病毒复制的机制研究

目的 研究恩替卡韦(ETV)通过微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)抑制乙型肝炎病毒复制的机制。方法 将HepG2.2.15细胞标记为空白对照组;根据恩替卡韦浓度的不同将细胞分为低剂量实验组(10μmol·L^(-1)ETV)、中剂量实验组(20μmol·L^(-1)ETV)、高剂量实验组(30μmol·L^(-1)ETV);miR-199a-5p, anti-miR-199a-5p、anti-miR-con、miR-con转染至HepG2.2.15细胞,分别标记为miR-199a-5p组、anti-miR-199a-5p组、anti-miR-con组、miR-con组,转染后anti-miR-199a-5p组、anti-miR-con组继续用30μmol·L^(-1)的ETV进行培养,分别标记为ETV+anti-miR-199a-5p组、ETV+anti-miR-con组。蛋白质印迹法检测各组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)蛋白表达水平,实时荧光定量聚合酶链反应法检测HepG2.2.15细胞中miR-199a-5p的表达情况,以酶联免疫吸附法检测HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg、乙型肝炎e抗原(HBeAg)表达量。结果 空白对照组、高剂量实验组、ETV+anti-miR-con组、ETV+anti-miR-199a-5p组细胞HBsAg蛋白表达水平分别为0.77±0.06,0.25±0.03,0.24±0.04和0.71±0.07;HBeAg蛋白表达水平分别为0.87±0.08,0.33±0.03,0.35±0.04和0.72±0.06;HBV DNA含量分别为(412 541.22±349.13),(201 211.33±200.45),(211 034.25±189.97)和(303 321.21±250.27)U·mL^(-1);HBsAg含量分别为(16.32±1.44),(4.12±0.38),(3.99±0.54)和(11.38±1.26)U·mL^(-1);HBeAg含量分别为(9.07±0.77),(3.49±0.33),(3.52±0.49)和(7.89±0.61)S·CO^(-1);以上指标,空白对照组与高剂量实验组比较,高剂量实验组与ETV+anti-miR-199a-5p组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 恩替卡韦通过miR-199a-5p抑制乙型肝炎病毒的复制。

微小RNA-199R-3p及磷酸肌醇3激酶-蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白在结肠癌的表达及临床意义

目的检测在结肠癌组织和对应癌旁组织微小RNA(miRNA,miR)-199a-3p和磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表达,探讨两者与结肠癌临床病理特征的关系。方法选择2016年1月至2019年7月武汉大学中南医院经病理学确诊的67例结肠癌患者,其中男性28例,女性37例,平均年龄63.2岁,采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测其结肠癌组织及对应癌旁组织中miR-199a-3p和PI3K/Akt/mTOR表达,分析miR-199a-3p的表达与各临床病理学参数的关系,分析结肠癌肿瘤组织中miR-199a-3p、PI3K、Akt、mTOR蛋白表达之间的关系。应用SPSS 22.0统计软件分析,各组间比较采用χ^2检验。结果结肠癌肿瘤组织miR-199a-3p表达(1.107±0.041)明显高于癌旁正常组织(0.613±0.034),差异有统计学意义(t=2.611,P<0.05);结肠癌患者肿瘤组织miR-199a-3p表达与淋巴管侵袭(χ^2=8.111,P<0.05)、血管侵袭(χ^2=5.550,P<0.05)、淋巴结转移(χ^2=4.189,P<0.05)、肝转移(χ^2=12.320,P<0.05)、临床分期(χ^2=4.300,P<0.05)等临床病理因素明显相关,而与年龄(χ^2=0.069,P>0.05)、性别(χ^2=0.238,P>0.05)、肿瘤位置(χ^2=0.321,P>0.05)、病理分级(χ^2=0.013,P>0.05)、腹膜转移(χ^2=0.109,P>0.05)等临床病理因素无明显相关;mTOR在结肠癌肿瘤组织中的阳性表达率为80.60%(54/67),明显高于癌旁正常组织阳性表达率23.88%(16/67),差异有统计学意义(χ^2=43.191,P<0.05);Akt在结肠癌肿瘤组织中的阳性表达率为74.63%(50/67),明显高于癌旁正常组织阳性表达率28.36%(19/67),差异有统计学意义(χ^2=28.711,P<0.05);PI3K在结肠癌肿瘤组织中的阳性表达率为68.66%(46/67),明显高于癌旁正常组织阳性表达率25.37%(17/67),差异有统计学意义(χ^2=25.191,P<0.05);结肠癌肿瘤组织中miR-199a-3p表达与PI3K、Akt、mTOR均呈正相关(r=0.632、0.605、0.689,P<0.05),结肠癌肿瘤组织中PI3K表达与Akt、mTOR均呈正相关(r=0.707、0.705,P<0.05),结肠癌肿瘤组织中Akt表达与mTOR呈正相关(r=0.647,P<0.05)。结论结肠癌患者肿瘤组织miR-199a-3p表达水平明显高于癌旁组织,与淋巴管侵袭、血管侵袭、淋巴结转移、肝转移、临床分期等临床病理因素显著相关;结肠癌肿瘤组织中miR-199a-3p、PI3K、Akt、mTOR表达之间均呈正相关,miR-199a-3p,PI3K/Akt/mTOR信号通路在结肠癌疾病发生、发展过程中发挥重要作用。

过表达微小RNA-199b维持人诱导多能干细胞分化的内皮细胞表型的研究

目的过表达人诱导多能干细胞分化的内皮细胞(hiPSC-EC)中微小RNA(miRNA,miR)-199b-5p,探讨miR-199b-5p对hiPSC-EC传代过程中hiPSC-EC表型转换的影响。方法利用流式细胞术鉴定hiPSC-EC第1代(P1)、第5代(P5)和第10代(P10)内皮细胞表面标志CD31和CD34,将hiPSC-EC分为两组,利用慢病毒分别将过表达miR-199b-5p质粒和空白对照质粒转染hiPSC-EC,实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测过表达miR-199b-5p组和空白对照组中miR-199b-5p的表达水平,流式细胞技术鉴定hiPSC-EC过表达组和空白对照组P10细胞表面标志CD31和CD34。应用GraphPadPrism7统计软件分析,数据以均值±标准差(Mean±SD)表示,采用t检验分析过表达组和对照组miR-199b-5p的转录水平和成管数目。结果流式细胞技术检测发现hiPSC-EC在P1~P10传代过程中内皮细胞表面标志CD31和CD34逐渐下降,P188.69%CD31^+/69.57%CD34^+,P568.84%CD31^+/36.90%CD34^+,P1041.66%CD31^+/19.29%CD34^+,FQ-PCR显示miR-199b-5p在hiPSC-ECP1~P10传代过程中显著下降(F=18.190,P<0.01),差异有统计学意义。利用慢病毒载体实现hiPSC-EC过表达miR-199b-5p后,hiPSC-EC在传代过程中内皮细胞表型转换显著被抑制,miR-199b-5p过表达组P1074.33%CD31^+/58.56%CD34^+,对照组P1046.30%CD31^+/38.07%CD34^+。结论miR-199b-5p在hiPSC-EC传代过程中显著下降,miR-199b-5p过表达能够维持传代过程中hiPSC-EC的表型。

槐角黄酮调控miR-199a-3p/p38MAPK/NF-κB对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和炎症因子分泌的影响

目的 探讨槐角黄酮对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和炎症因子分泌的影响。方法 将乳腺癌细胞BT549分为正常对照(NC)组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、miR-NC组、miR-199a-3p组、高剂量+anti-miR-NC组、高剂量+anti-miR-199a-3p组。采用CCK-8、克隆形成实验评估细胞增殖;采用Transwell法评估细胞迁移和侵袭。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-199a-3p表达。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测细胞培养液上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)以及白细胞介素-1β(IL-1β)水平。采用蛋白免疫印迹(Western blot)检测p-p38MAPK和p-p65蛋白表达。结果 与NC组比较,低、中、高剂量组BT549细胞活力、克隆形成数、迁移数、侵袭数降低,miR-199a-3p表达升高,细胞培养液上清中TNF-α、IL-6以及IL-1β水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-199a-3p组BT549细胞活力、克隆形成数、迁移数、侵袭数降低,细胞培养液上清中TNF-α、IL-6以及IL-1β水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与高剂量+anti-miR-NC组比较,高剂量+anti-miR-199a-3p组BT549细胞活力、克隆形成数、迁移数、侵袭数升高,细胞培养液上清中TNF-α、IL-6以及IL-1β水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与NC组比较,高剂量组BT549细胞p-p38MAPK和p-p65蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与高剂量+anti-miR-NC组比较,高剂量+anti-miR-199a-3p组BT549细胞p-p38MAPK和p-p65蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 槐角黄酮可抑制乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和炎症反应,其机制可能是通过上调miR-199a-3p表达、抑制p38MAPK/NF-κB通路实现的。

微小RNA-199a对人胚肺成纤维细胞表型转化的抑制作用机制研究

目的探讨微小RNA-199a(miR-199a)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)向肌成纤维细胞转化的作用及机制。方法将细胞分为6组:对照组、模型组(5 ng·mL^-1的TGF-β1诱导HELF细胞72 h)、第1转染组(转染150 nmol·L^-1的inhibitor NC质粒)、第2转染组(转染150 nmol·L^-1的miR-199a inhibitor质粒)、第3转染组(转染inhibitor NC质粒+TGF-β1诱导)和第4转染组(转染miR-199a inhibitor质粒+TGF-β1诱导)。用实时荧光定量-PCR法检测细胞中miR-199a基因的表达(2^-△△Ct值),以蛋白质印迹法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、CollagenⅠ、磷酸化-丝氨酸/苏氨酸激酶(p-Akt)和磷酸化-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)的表达水平(灰度值)。结果对照组、模型组、第1转染组、第2转染组、第3转染组和第4转染组的miR-199a表达水平分别为0.99±0.00,4.73±0.29,0.93±0.12,0.37±0.01,4.52±0.22和0.31±0.08,模型组与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.001)。模型组、第3转染组和第4转染组的α-SMA蛋白表达水平分别为0.58±0.13,0.58±0.10和0.36±0.03;这3组的CollagenⅠ蛋白表达水平分别为0.50±0.05,0.49±0.07和0.29±0.04;这3组的p-Akt(S473)/Akt蛋白表达水平分别为0.60±0.15,0.59±0.16和0.30±0.09;这3组的p-mTOR/mTOR蛋白表达水平分别为0.74±0.02,0.74±0.04,0.49±0.06,上述指标:第4转染组与第3转染组比较,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论miR-199a促进TGF-β1诱导的HELF细胞向肌成纤维细胞的转化,其机制可能与miR-199a激活PI3K/Akt/mTOR通路有关。

血清miR-199、miR-21对复发性自然流产患者流产再发生的预测价值分析

目的探讨miRNA-199、miR-21对复发性自然流产(RSA)患者流产再发生的预测价值。方法回顾性选取2021年7月至2023年5月湖州市第三人民医院妇科诊治的RSA患者95例,根据是否再发生流产分为再发生组和未发生组。收集患者临床资料,抽取患者肘静脉血检测血清miR-199、miR-21水平。随访观察95例RSA患者孕28周流产再发生率。比较再发生组与未发生组患者临床资料及血清miR-199、miR-21水平;分析RSA患者流产再发生的影响因素;分析血清miR-199、miR-21对RSA患者流产再发生的预测效能。结果95例RSA患者均无失访,其中孕28周流产再发生24例,发生率为25.26%(24/95),71例未发生。再发生组年龄≥35岁、自然流产次数≥4次患者比例均高于未发生组(均P<0.05),孕酮水平及超声多模态评分均低于未发生组(均P<0.05)。再发生组血清miR-199、miR-21水平均高于未发生组(P<0.05)。自然流产次数≥4次(OR=2.984)及血清miR-199(OR=4.141)、miR-21(OR=4.926)水平升高是RSA患者流产再发生的独立危险因素(均P<0.05),超声多模态评分(OR=0.206)是保护因素(P<0.05)。血清miR-199、miR-21水平预测RSA患者流产再发生的AUC分别为0.779、0.804,最佳截断值分别为3.57、2.95;两者联合预测AUC为0.907,明显高于各指标单独预测。结论RSA患者血清miR-199、miR-21均呈高表达,与流产再发生密切相关,两者联合预测流产再发生的价值较高,有助于指导临床做进一步决策与治疗。