微小RNA-21对磷酸酶和张力蛋白同源物基因在乳腺癌细胞的表达及细胞凋亡的研究

目的观察转染微小RNA-21(mi R-21)对MCF7细胞系中磷酸酶和张力蛋白同源物基因(PTEN)表达及细胞凋亡的影响。方法对MCF7细胞转染mi R-21,采用免疫组织化学法检测转染前后PTEN的表达;用噻唑蓝(MTT)比色法测转染mi R-21后MCF7细胞增殖;流式细胞术检测转染后MCF7细胞凋亡。结果经免疫组织化学检测,转染组未见染色,对照组细胞胞质呈棕褐色,转染组PTEN的表达明显低于对照组,MTT法检测转染组细胞活力增加(P<0.05)。转染组的凋亡率为(3.14±0.24)%,空白组、空质粒组的凋亡率分别为(8.04±0.02)%、(9.41±0.53)%(P<0.05),转染组细胞凋亡率明显减少。结论 PTEN是mi R-21的靶基因之一,mi R-21的高表达可促进乳腺癌的发展。

微小RNA-21调控同源性磷酸酶-张力蛋白基因表达在子痫前期发病中的作用机制

目的探究微小RNA-21(miR-21)在子痫前期(PE)病人发病中的表达变化及可能作用机制。方法收集2016年8月至2019年10月郑州市妇幼保健院收治的45例PE病人及45例匹配正常孕妇胎盘组织,采用实时定量PCR(RT-qPCR)法检测miR-21相对表达水平。体外培养人滋养层细胞系HTR-8/SVneo,转染miR-21模拟物(mimics组),抑制物(inhibitor组)及无意义序列(NC组),另设无任何处理HTR-8/SVneo细胞为空白对照组(BC组)。采用Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率,采用Tanswell小室检测细胞侵袭性。生物学分析并进行双荧光素酶报告基因验证miR-21与同源性磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)的靶向关系,免疫印迹(WB)法检测胎盘组织及细胞中PTEN、磷脂酰肌醇-3激酶(p-PI3K)及蛋白激酶B(p-Akt)磷酸化蛋白表达情况。结果与正常组(0.45±0.06)比较,PE病人胎盘组织中miR-21表达水平(0.41±0.05)显著降低(t=79.157,P<0.05),PTEN mRNA及蛋白表达水平分别为(4.13±0.58)、(0.91±0.08)均显著增加(t=36.201、30.858,P<0.05)。PE病人胎盘组织中miR-21与PTEN蛋白表达水平呈负相关(r=-0.542,P<0.05)。与BC组、NC组比较,mimics组HTR-8/SVneo细胞侵袭细胞数、pPI3K、p-Akt蛋白表达水平显著增加,凋亡率、PTEN蛋白表达水平显著降低,inhibitor组呈相反趋势。双荧光素酶报告基因实验结果显示,与转染NC+Wt(1.00±0.00)比较,转染mimics+Wt后HTR-8/SVneo细胞相对荧光活性(0.39±0.04)显著降低(t=37.355,P<0.05)。结论 miR-21可通过靶向抑制PTEN表达促进细胞侵袭并抑制其凋亡,可能与促进PI3K/Akt通路激活有关。

子宫内膜异位症患者血清微小RNA-92a相对表达水平、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因表达水平与预后的相关性

目的探讨子宫内膜异位症患者血清微小RNA-92a(miRNA-92a)相对表达水平、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)表达水平与预后的关系。方法选取200例行腹腔镜手术的子宫内膜异位症患者为研究组,120例行腹腔镜子宫肌瘤切除术的患者为对照组。采用荧光定量PCR技术检测两组患者血清miRNA-92a相对表达水平和PTEN水平,采用Pearson法分析研究组患者血清miRNA-92a相对表达水平与PTEN水平的相关性。术后随访3个月,根据子宫内膜异位症患者复发情况分为复发组和未复发组,采用酶联免疫吸附法检测两组患者血清雌二醇、孕酮、促卵泡激素(FSH)水平,比较两组患者血清miRNA-92a相对表达水平及PTEN、雌二醇、孕酮、FSH水平,采用Pearson法分析复发组患者血清miRNA-92a相对表达水平、PTEN水平与内分泌指标的相关性,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清miRNA-92a相对表达水平、PTEN水平及二者联合检测预测子宫内膜异位症复发的价值。结果研究组患者血清miRNA-92a相对表达水平高于对照组,PTEN水平低于对照组(P<0.05);研究组患者血清miRNA-92a的相对表达水平与PTEN水平呈负相关(P<0.05)。复发组患者血清miRNA-92a相对表达水平、雌二醇、孕酮、FSH水平均高于未复发组,PTEN水平低于未复发组(P<0.05)。Pearson分析结果显示,复发组患者血清miRNA-92a的相对表达水平与雌二醇、孕酮、FSH水平均呈正相关(均P<0.05),PTEN水平与雌二醇、孕酮、FSH水平均呈负相关(均P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,血清miRNA-92a相对表达水平、PTEN水平预测子宫内膜异位症复发的曲线下面积分别为0.831(95%CI:0.785,0.870;P=0.025)、0.867(95%CI:0.824,0.902;P=0.024),最佳截断值分别为1.77 ng/mL、0.80 ng/mL,对应的灵敏度分别为85.00%、91.00%,特异度分别为77.50%、73.33%;二者联合检测的曲线下面积为0.965(95%CI:0.932,0.987;P=0.007),灵敏度和特异度分别为92.00%、90.71%。血清miRNA-92a相对表达水平、PTEN水平联合检测预测子宫内膜异位症复发的曲线下面积高于二者单独检测(P<0.05)。结论子宫内膜异位症患者血清miRNA-92a呈高表达,PTEN呈低表达,二者与患者内分泌指标水平相关,且对子宫内膜异位症复发均有一定的预测价值,可能共同影响子宫内膜异位症患者病情发展及预后。

微小RNA-214靶向调控PTEN对成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化、矿化的影响及机制研究

目的:探讨微小RNA-214(miR-214)靶向调控第10号染色体丢失性磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)对成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化、矿化的影响及机制。方法:将成骨细胞MC3T3-E1分为miR-124 mimic组(转染miR-124 mimic)、miR-124 NC组(转染miR-124 NC)、pcDNA3.1-PTEN组(转染pcDNA3.1-PTEN)、miR-124 mimic+pcDNA3.1-PTEN组(转染miR-124 mimic+pcDNA3.1-PTEN)。采用在线生信预测miR-124和PTEN靶向结合位点,通过双荧光素酶报告基因进行验证。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测细胞miR-124和PTEN mRNA表达。采用CCK-8法检测细胞增殖。采用碱性磷酸酶活性测定检测细胞分化能力。采用茜素红染色和骨钙素水平测定检测细胞的矿化。采用Werstern blot检测PTEN、Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、骨桥蛋白(OPN)、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)水平。结果:与miR-124 NC组比较,miR-124 mimic组野生型PTEN的荧光素酶活性降低(均P<0.05)。与miR-124 NC组比较,miR-124 mimic组miR-124及p-PI3K、p-AKT蛋白表达升高,PTEN mRNA和蛋白、细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、ColⅠ和OPN蛋白、细胞矿化率和骨钙素水平降低,而pcDNA3.1-PTEN组则相反(均P<0.05)。与miR-124 mimic组比较,miR-124 mimic+pcDNA3.1-PTEN组p-PI3K、p-AKT蛋白表达降低,PTEN mRNA和蛋白、细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、ColⅠ和OPN蛋白、细胞矿化率和骨钙素水平升高(均P<0.05)。结论:miR-214通过靶向下调PTEN蛋白表达激活PI3K/AKT信号通路,从而调控成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化。

微小RNA-486-5p通过调控缺氧诱导因子-1α/人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶A信号通路影响结肠癌的发生发展

目的探讨微小RNA-486-5p(miR-486-5p)通过调控缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶A(Akt)信号通路影响结肠癌的发生发展。方法脂质体Lipofectamine™3000将miR-486-5p模拟物NC(对照),miR-486-5p模拟物转入SW480结肠癌细胞中,细胞购自上海细胞库。反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR-486-5p表达,噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,Transwell实验检测细胞侵袭,蛋白质印迹法(Western blot)检测B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)、bcl-2相关蛋白X(bax)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、p27、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、HIF-1α、PTEN、PI3K及磷酸化Akt(p-Akt)蛋白表达。组间比较采用t检验进行分析。结果miR-486-5p模拟物组细胞miR-486-5p表达量(1.87±0.09比1.00±0.10,t=5.589,P<0.05)、细胞早期凋亡率[(15.48±0.97)%比(1.47±0.09)%,t=4.327,P<0.05],细胞晚期凋亡率[(27.46±1.54)%比(3.24±0.13)%,t=5.652,P<0.05],细胞周期G1期[(60.32±4.43)%比(24.08±1.96)%,t=4.578,P<0.05]、bax(0.96±0.08比0.18±0.01,t=5.373,P<0.05)、p27(0.86±0.06比0.32±0.01,t=5.762,P<0.05)及PTEN(1.64±0.09比0.46±0.02,t=4.874,P<0.05)蛋白表达量高于对照组,miR-486-5p模拟物组细胞活力(0.33±0.01比0.54±0.03,t=4.582,P<0.05)、细胞侵袭数目[(37.59±2.64)个比(179.93±6.96)个,t=4.147,P<0.05],bcl-2(0.21±0.01比1.04±0.09,t=5.287,P<0.05)、Cyclin D1(0.14±0.00比0.85±0.07,t=4.642,P<0.05)、MMP-9(0.28±0.02比0.84±0.06,t=4.643,P<0.05)、HIF-1α(0.45±0.03比1.53±0.09,t=5.562,P<0.05)、PI3K(0.38±0.01比1.78±0.10,t=5.468,P<0.05)及p-Akt(0.38±0.02比1.10±0.08,t=4.129,P<0.05)蛋白表达量低于对照组。结论上调miR-486-5p表达量可诱导结肠癌细胞SW480凋亡、抑制细胞侵袭、使细胞周期发生阻滞,可能与抑制HIF-1α/PTEN/PI3K/Akt信号通路有关。

微小RNA-221对肝细胞癌第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因的调节及其对生物学特性的影响

目的观察微小RNA（miRNA，miR）-221在正常肝细胞和肝癌细胞株中的表达，检测miR-221在正常肝组织和肝癌组织中的表达，并干预肝癌细胞中miR-221水平探讨其对第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因（PTEN）的调控和对肝癌细胞生物学特性的影响。方法采用实时定量聚合酶链反应法检测miR-221在正常肝细胞和肝癌细胞株中的表达，收集28例伴有门静脉癌栓的肝细胞癌手术患者正常肝组织、癌栓、癌组织和癌旁组织并检测其表达；采用miR-221抑制剂（inhibitor）和拟似物（mimic）靶向干预miR-221在肝癌细胞中的表达，Westernblot法检测其对PTEN的调控，以及细胞计数试剂盒（CCK-8）法、流式细胞仪和Transwell法检测其对肝癌细胞的增殖、凋亡和迁移的影响。结果肝癌HepG2、BEL-7402和Hep3B细胞的miR-221相对表达量分别为0．783±0．021、0．954±0．021、0．837±0．026，显著高于正常肝102细胞的0．081±0．007（P〈0．05），且肝癌组织和癌栓的相对表达量为0．897±0．048、0．984±0．048，亦显著高于正常肝组织和癌旁组织的0．067±0．007、0．063±0．008（P〈0．05），而肝癌细胞的PTEN的表达水平显著低于正常肝细胞（P〈0．05），且肝癌组织和癌栓亦低于正常肝细胞（P〈0．05）；与对照组比较，miR-221inhibitor和mimic转染肝癌细胞后，PTEN表达水平分别上调和下调263％和32％（P〈0．05），转染miR-221inhibitor肝癌细胞的增殖和迁移活性降低，凋亡率增加（P〈0．05），而转染miR-221mimie肝癌细胞则增殖和迁移活性增加，凋亡率降低（P〈0．05）。结论肝癌细胞和肝癌组织、癌栓中miR-221呈高表达，降低其水平能上调VrEN的表达，有效降低细胞增殖和迁移活性，诱导细胞凋亡，是肝细胞癌的潜在治疗靶点。

皂荚提取物对肝癌大鼠微小RNA-21及磷酸酶及张力蛋白同源基因的影响

微小RNA（miRNA）调节着人类三分之一的基因。而miR-21是众多miRNAs中国际公认的癌基因之一，当抑制miR-21表达时，人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（PTEN）表达升高，肝癌细胞的生长、侵袭、和迁移也受到抑制。我们前期研究结果显示，皂荚提取物能够调节多种信号通道，发挥抗肝癌的作用.

微小RNA-92a-3p靶向PTEN调控胰腺癌细胞增殖和转移

目的:探讨微小RNA-92a-3p(microRNA-92a-3p,miR-92a-3p)靶向第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tension homolog deleted on chromosome ten,PTEN)调控胰腺癌细胞增殖和转移的作用机制。方法:采用Real-time PCR检测人正常胰腺导管上皮细胞株(HPDE6-C7)与胰腺癌细胞株(Panc-1,BxPC-3,AsPC-1,MIA Paca-2,Capan-2)中的miR-92a-3p表达;同时,采用蛋白质印迹法检测上述细胞中PTEN的表达。选取胰腺癌细胞株BxPC-3和Panc-1的细胞进行实验,分为转染对照模拟物组(NC mimics组)、miR-92a-3p模拟物组(miR-92a-3p mimics组)、对照拮抗剂组(NC inhibitor组)、miR-92a-3p拮抗剂(miR-92a-3p inhibitor组),采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖,Transwell小室检测细胞转移能力,蛋白质印迹法检测PTEN蛋白表达水平。将野生型PTEN的3’-非编码区(untranslated regions,UTR)(wt-PTEN 3’UTR)或突变体PTEN的3’-UTR(mutPTEN 3’UTR)分别与NC mimics,miR-92a-3p mimics,NC inhibitor,miR-92a-3p inhibitor共转染293T细胞,采用双萤光素酶报告实验检测miR-92a-3p与PTEN的靶向结合关系。在BxPC-3细胞的回复实验中,实验又分NC inhibitor+siNC组、miR-92a-3p inhibitor+si-NC组、NC inhibitor+si-PTEN组和miR-92a-3p inhibitor+si-PTEN组;在Panc-1细胞的回复实验中,实验又分为NC mimics+NC组、miR-92a-3p mimics+NC组、NC mimics+PTEN组和miR-92a-3p mimics+PTEN组,再分别采用CCK-8检测细胞增殖,Transwell小室检测细胞转移能力,蛋白质印迹法检测PTEN蛋白的表达。结果:与HPDE6-C7细胞相比,miR-92a-3p在胰腺癌细胞株中均呈高表达(均P<0.01),PTEN在胰腺癌细胞株中均呈低表达(均P<0.05)。与NC mimics组相比,miR-92a-3p mimics组BxPC-3和Panc-1细胞活力均升高(均P<0.01);与NC inhibitor组相比,miR-92a-3p inhibitor组BxPC-3和Panc-1细胞活力均降低(均P<0.01)。与NC mimics组相比,miR-92a-3p mimics组穿过微孔的BxPC-3和Panc-1细胞数均增多(均P<0.01);与NC inhibitor组相比,miR-92a-3p inhibitor组穿过微孔的BxPC-3和Panc-1细胞数均减少(均P<0.01)。与NC mimics组相比,miR-92a-3p mimics组的wtPTEN 3’UTR荧光素酶活性被抑制(P<0.01);与NC inhibitor组相比,miR-92a-3p inhibitor组的wt-PTEN 3’UTR荧光素酶活性被增强(P<0.01)。与miR-92a-3p inhibitor+si-NC组相比,miR-92a-3p inhibitor+si-PTEN组恢复了miR-92a-3p inhibitor对BxPC-3细胞增殖和转移的影响;与miR-92a-3p mimics+NC组相比,miR-92a-3p mimics+PTEN组恢复了miR-92a-3p mimics对Panc-1细胞增殖和转移的影响。结论:MiR-92a-3p可靶向抑制PTEN的表达,促进胰腺癌细胞的增殖和转移。

外泌体微小RNA-23a对非小细胞肺癌血管生成的影响及机制研究

目的:探究外泌体微小RNA(miR)-23a对非小细胞肺癌(NSCLC)血管生成的影响,分析其作用机制。方法:收集NSCLC患者癌组织和癌旁组织,同时以人肺癌细胞系H1299细胞为研究对象。比较癌组织与癌旁组织第10号染色体缺失性磷酸酶和张力蛋白同源物基因(PTEN)、血管内皮生长因子(VEGF)表达。分别采用免疫组化染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)、实时定量反转录PCR(qRT-PCR)和Western blot分析miR-23a对H1299细胞PTEN、VEGF、蛋白激酶B(AKT)表达的影响。结果:肺癌组织PTEN表达低于癌旁组织,而VEGF表达高于癌旁组织(均P<0.05)。miR-23a过表达明显抑制H1299细胞PTEN mRNA和蛋白表达,促进AKT、VEGF mRNA以及磷酸化AKT(p-AKT)和VEGF蛋白表达,而抑制miR-23a后结果相反(均P<0.05)。结论:NSCLC细胞来源的外泌体miR-23a能够诱导肿瘤血管生成,促进NSCLC的发展,其机制可能与靶向抑制PTEN有关。

微小RNA-222靶向调控PTEN表达及对胰腺癌细胞侵袭迁移的影响

目的探讨微小RNA-222(miR-222)对第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)的靶向调控作用及胰腺癌细胞SW1990侵袭迁移的影响。方法体外常规培养SW1990细胞并分为实验组、阴性对照组和空白对照组。实验组转染miR-222抑制物,阴性对照组转染阴性对照序列,而空白对照组不行任何转染。采用实时定量PCR(QPCR)、活细胞计数CCK-8、划痕实验和Transwell实验测定miR-222水平、增殖活力、划痕愈合率和穿膜细胞数目,QPCR和Western blotting检测PTEN、基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的水平;构建PTEN基因3’端非翻译区(3’UTR)野生型和突变型质粒并采用双荧光素酶报告基因系统验证miR-222与PTEN的靶向关系。结果实验组的miR-222水平为0.316±0.046,低于阴性对照组的1.129±0.213和空白对照组的1.147±0.274(P<0.05)。与空白对照组和阴性对照组相比,实验组SW1990细胞转染48、72 h的增殖活力下降(P<0.05);实验组的划痕愈合率和穿膜细胞数目分别为(21.36±2.79)%和(182.62±14.85)个,低于阴性对照组的(65.82±5.71)%和(379.84±20.52)个及空白对照组的(67.19±6.03)%和(384.01±19.20)个(P<0.05);与空白对照组和阴性对照组相比,实验组的MMP-9和MMP-2水平降低,而PTEN水平升高(P<0.05)。与转染突变型PTEN 3’UTR的质粒相比,miR-222模拟物能降低转染PTEN 3’UTR野生型质粒细胞的荧光素酶活性(P<0.05),但对突变型无影响(P>0.05)。结论在SW1990细胞中下调miR-222水平可抑制其增殖和迁移侵袭能力并降低MMP-2、MMP-9表达,可能通过靶向PTEN来发挥促癌作用,在胰腺癌的靶向治疗中有一定价值。

微小RNA-425-5p靶向调控PTEN表达促进宫颈癌海拉细胞增殖、侵袭和迁移的实验研究

目的探讨微小RNA(miR)-425-5p对宫颈癌海拉细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其机制。方法2018年10月至2019年10月,利用Lipofectamine^(TM) 2000将miR-425-5p模拟物(mimics)、抑制剂(inhibitor)及其阴性对照转染至海拉细胞中,采用实时荧光定量PCR检测细胞中miR-425-5p的表达情况,MTT法检测细胞增殖活力,平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,Transwell小室实验检测细胞侵袭和迁移,蛋白质印迹法(Western blotting)检测细胞中磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)蛋白的表达。采用生物信息学软件预测、双荧光素酶报告基因实验验证miR-425-5p和PTEN的靶向关系。将PTEN过表达质粒pcDNA3.1-PTEN和PTEN干扰序列siRNA-PTEN转染至海拉细胞后,观察PTEN对海拉细胞增殖活力、克隆形成能力、侵袭能力和迁移能力的影响。结果与各自阴性对照比较,miR-425-5p过表达可促进海拉细胞增殖[(142.25±11.32)%比(100.00±6.67)%]、克隆形成、侵袭[(133.28±9.86)个比(77.46±5.32)个]和迁移[(187.56±15.12)个比(115.35±10.26)个]并下调PTEN蛋白表达,而miR-425-5p低表达则抑制海拉细胞增殖[(58.38±3.45)比(100.00±5.74)]、克隆形成、侵袭[(43.32±3.62)个比(75.65±6.15)个]和迁移[(62.28±4.05)个比(109.72±9.84)个]并上调PTEN蛋白表达(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验证实,PTEN是miR-425-5p的靶基因;PTEN过表达可促进海拉细胞增殖[(66.52±4.36)%比(100.00±6.18)%]、克隆形成、侵袭[(46.23±3.13)个比(71.65±5.24)个]和迁移[(62.65±4.26)个比(108.42±8.57)个],而PTEN低表达则抑制海拉细胞增殖[(136.52±9.85)个比(100.00±7.05)个]、克隆形成、侵袭[(110.27±9.85)个比(70.52±6.18)个]和迁移[(168.78±16.96)个比(113.26±10.13)个]。结论miR-425-5p可通过靶向调控PTEN表达促进宫颈癌海拉细胞增殖、侵袭和迁移。

微小RNA-130b靶向调控PTEN表达及对骨肉瘤细胞上皮间质转化的影响

目的探讨微小RNA-130b(miR-130b)对第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因(PTEN)的靶向调控及骨肉瘤(OS)MG-63细胞上皮间质转化(EMT)的影响。方法从美国国家生物技术信息中心的GEO数据库中下载基因表达谱OS样本数据集GSE39058、GSE79181的series matrix数据分别用于分析OS组织的miR-130b水平及与预后的关系。采用脂质体法将miR-130b抑制剂转染至MG-63(抑制组),同时设置未转染组和空白对照组,活细胞计数CCK-8和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测增殖活力和凋亡率,实时定量PCR和Western blotting检测PTEN及上皮表型标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)和间质表型标志物波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的水平,在线预测miR-130b与PTEN的靶向结合序列并利用双荧光素酶报告基因实验验证两者的靶向关系。结果GSE39058数据集显示,65例OS患者的组织miR-130b水平为11.040±1.008,高于26例化疗后切除组织的9.614±1.154(P<0.05);GSE79181数据集显示,miR-130b低水平组的中位生存期为2823天,优于高水平组的1463天(P<0.05)。抑制组的miR-130b水平为0.038±0.006,低于未转染组的1.160±0.137和空白对照组的1.049±0.089;抑制组的凋亡率为(17.672±1.664)%,高于未转染组的(7.975±0.364)%和空白对照组的(7.438±0.560)%,差异有统计学意义(P<0.05)。抑制组转染24、48 h后的细胞活力较未转染组和空白对照组减弱(P<0.05);与未转染组和空白对照组相比,抑制组的Vimentin和α-SMA水平降低,而PTEN和E-cadherin水平升高(P<0.05)。未转染组和空白对照组上述指标的差异无统计学意义(P>0.05)。双荧光素酶活性检测结果显示,miR-130b模拟物与PTEN野生型质粒共转染细胞后,荧光素酶活性降低(P<0.05),而与PTEN突变型质粒共转染后的荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)。结论OS组织中miR-130b水平升高且下调miR-130b水平可抑制细胞增殖和EMT过程并诱导凋亡,可能通过靶向PTEN来发挥促癌作用,在OS靶向治疗中有一定价值。

心康冲剂调控慢性心衰大鼠miRNA-21/PTEN抗心肌纤维化研究

目的探讨心康冲剂抗心衰大鼠心肌纤维化的机制。方法90只SD大鼠分为正常组10只,模型组、对照组及心康低、中、高剂量组各16只。心康低、中、高剂量组分别给予0.5、1、2 g/(kg·d)的心康冲剂溶液。对照组给予0.06 g/(kg·d)的芪苈强心胶囊。正常组、模型组按1 m L/(kg·d)灌服生理盐水。各组均每日1次,连续灌服8周。计算左心室质量指数(LVMI);心脏切片行HE、Masson染色并计算胶原容积分数(CVF);采用Real-time PCR法检测miRNA-21、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)m RNA表达水平;用Pearson相关及Logistic多元线性回归分析miRNA-21、PTEN m RNA、CVF与LVMI之间的相关性。结果与正常组比,模型组大鼠心肌CVF、LVMI比值及miRNA-21表达升高(P<0.01),PTENm RNA表达下降(P<0.01)。与模型组比,心康低、中、高剂三组CVF、LVMI比值及miRNA-21表达下降(P<0.01)、PTENm RNA表达升高(P<0.01);与芪苈强心组比较,心康冲剂低、中、高剂LVMI、CVF、miRNA-21、PTEN m RNA无明显差异(P>0.05)。miRNA-21、PTENm RNA、CVF均与LVMI有明显线性相关关系。结论心康冲剂可通过下调miRNA-21、升高PTEN m RNA表达抗心肌纤维化。

miR-21低表达对垂体瘤细胞系RC-4BC增殖、凋亡的影响及与PTEN靶向关系

目的观察微小RNA-21(miR-21)低表达对垂体瘤细胞系RC-4BC增殖、凋亡的影响,并分析其与第10号染色体丢失的张力蛋白同源磷酸酶基因(PTEN)的靶向关系。方法取对数生长期的RC-4BC细胞分为两组,沉默组转染miR-21抑制物miR-21 inhibitor,阴性对照组转染抑制物阴性对照NC-inhibitor,采用RT-PCR法检测miR-21、第10号染色体丢失的张力蛋白同源磷酸酶基因(PTEN)mRNA,采用CCK8实验观察两组细胞增殖能力(以OD值表示),采用平板克隆实验观察两组细胞集落形成能力(以集落形成数表示),采用流式细胞术观察两组细胞凋亡率并观察细胞周期分布情况。收集RC-4BC细胞制备单细胞悬液,分别将miR-21 mimics或NC-mimics与PTEN-WT或PTEN-MUT共转染至RC-4BC细胞,转染后细胞标记为miR-21 mimics+PTEN-WT组、NC-mimics+PTEN-WT组、miR-21 mimics+PTEN-MUT组、NC-mimics+PTEN-MUT组,采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-21与PTEN的靶向关系。结果沉默组RC-4BC细胞中miR-21、PTEN mRNA相对表达量分别为0.30±0.08、2.89±0.14,阴性对照组RC-4BC细胞中miR-21、PTEN mRNA相对表达量分别为1.01±0.02、0.99±0.03,两组相比,P均<0.05。沉默组RC-4BC细胞24 h、48 h、72 h时OD值均低于阴性对照组(P均<0.05)。沉默组RC-4BC细胞集落形成数低于阴性对照组(P<0.05)。沉默组RC-4BC细胞凋亡率高于阴性对照组(P<0.05)。沉默组RC-4BC细胞G0/G1期占比65.65%±7.82%、S期占比19.25%±3.70%,阴性对照组RC-4BC细胞G0/G1期占比45.62%±5.03%、S期占比35.72%±4.67%,两组相比,P均<0.05。miR-21 mimics+PTEN-WT组、NC-mimics+PTEN-WT组、miR-21 mimics+PTEN-MUT组、NC-mimics+PTEN-MUT组细胞的相对荧光素酶活性分别为0.39±0.07、1.02±0.03、1.01±0.04、1.00±0.03,其中miR-21 mimics+PTEN-WT组相对荧光素酶活性与其他各组相比,P均<0.05。结论沉默miR-21能够移至垂体瘤细胞系RC-4BC的增殖、促进其凋亡,其机制可能与靶向调控PTEN基因有关。

蓝盆花醇提物抗肝纤维化的作用及机制研究

目的 探讨蓝盆花醇提物抗肝纤维化(HF)的作用及机制。方法 采用四氯化碳灌胃法建立HF模型。通过观察肝组织病理学变化,检测HF指标[α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)]及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路相关因子mRNA和蛋白表达水平,考察低、中、高剂量(50、100、200 mg/kg)蓝盆花醇提物对HF模型大鼠的改善作用及可能机制。按1 800 mg/(kg·d)(以生药量计)灌胃大鼠蓝盆花醇提物制备含药血清,以低、中、高浓度(将含药血清稀释至10%、15%、20%)蓝盆花醇提物含药血清干预HSC-T6细胞,观察其对微小RNA-21(miRNA-21)表达的影响;将miRNA-21模拟物/抑制剂转染至HSC-T6细胞,并检测PI3K/Akt信号通路相关因子的mRNA和蛋白表达水平。结果 体内实验结果表明,低、中、高剂量蓝盆花醇提物均可显著改善HF模型大鼠肝组织病理学变化,降低其胶原百分比(P<0.01),下调其HF指标及PI3K、Akt的mRNA和蛋白表达(P<0.01),上调其磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)的mRNA及其蛋白表达(P<0.01)。体外实验结果表明,低、中、高浓度蓝盆花醇提物含药血清均可显著抑制miRNA-21的表达(P<0.01);转染miRNA-21模拟物后,细胞中PI3K、Akt的m RNA和蛋白表达上调(P<0.01),PTEN的m RNA及其蛋白表达下调(P<0.01);而转染miRNA-21抑制剂后,细胞中上述指标的变化与转染miRNA-21模拟物相反(P<0.01)。结论 蓝盆花醇提物可通过抑制miRNA-21表达、上调PTEN表达,进而抑制PI3K/Akt信号通路活性,最终发挥抗HF的作用。

miR⁃26a⁃5p靶向PTEN基因影响成骨细胞分化及基质矿化

目的探究微小RNA-26a-5p(miR-26a-5p)对第10染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(PTEN)的靶向作用及对成骨细胞分化及基质矿化的影响。方法通过在线软件预测miR-26a-5p与PTEN基因的结合位点,并经双荧光素酶报告基因检测验证。取生长状态良好的MC3T3-E1细胞,分为miR-26a-5p模拟物(mimic)组、miR-26a-5p mimic阴性对照(NC)组、pcDNA3.1-PTEN组、miR-26a-5p+pcDNA3.1-PTEN组,通过MTT法检测细胞增殖、碱性磷酸酶活性测定研究细胞分化情况、骨钙素定量检测分析和茜素红染色观察细胞基质矿化情况、Western blot检测成骨分化标志物和Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路蛋白表达变化。结果与NC组比较,miR-26a-5p mimic组miR-26a-5p水平、细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原(ColⅠ)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素、矿化率及β-catenin表达升高,PTEN mRNA及蛋白表达和糖原合成酶激酶-3b(Gsk-3b)表达降低(P<0.05),pcDNA3.1-PTEN组PTEN mRNA及蛋白表达和Gsk-3b表达升高,细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、ColⅠ、OPN、骨钙素、矿化率及β-catenin表达降低(P<0.05);与miR-26a-5p mimic组比较,miR-26a-5p+pcDNA3.1-PTEN组PTEN mRNA及蛋白表达和Gsk-3b表达升高,细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、ColⅠ、OPN、骨钙素、矿化率及β-catenin表达降低(P<0.05)。结论miR-26a-5p可靶向下调PTEN表达,调控Wnt/β-catenin信号通路,促进成骨细胞增殖、分化及基质矿化。

miR-26a调控PTEN基因降低小鼠慢性淋巴白血病细胞的耐药性

目的观察微小RNA-26a(miR-26a)通过第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)对慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞耐药性的调控作用。方法实验分为4组:对照组(L1210细胞),耐药组(L1210/DDP细胞)、NC组(转染空载质粒+L1210/DDP细胞)和抑制剂组(转染miR-26a-inhibitor质粒+L1210/DDP细胞)。RT-qPCR检测miR-26a和PTEN mRNA表达;双荧光素酶实验检测miR-26a对PTEN的靶向性;MTT法检测细胞对顺铂(DDP)耐药性;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Wetern blot检测细胞中PTEN、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT)蛋白表达。结果miR-26a能够抑制细胞中PTEN表达(P<0.05)。miR-26a可靶向作用于PTEN。抑制miR-26a表达可降低细胞对DDP的半数抑制浓度(IC_(50))值,提高细胞凋亡率,上调PI3K蛋白表达及p-AKT/AKT(P<0.05)。结论抑制miR-26a表达可通过上调PTEN表达降低细胞耐药作用。

青蒿琥酯通过调节miR-21/PTEN/AKT轴对甲状腺癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响

目的 观察青蒿琥酯对甲状腺癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响及微小RNA(miRNA)-21在该过程中的作用,并探讨相关机制。方法 取TPC-1细胞,将miR-21过表达质粒miR-21 mimics转染至TPC-1细胞,随机分为mimics组、联合组,mimics组常规培养,联合组加入青蒿琥酯(320μg/mL)。另取TPC-1细胞分为空白组、青蒿琥酯组,空白组常规培养,青蒿琥酯组加入青蒿琥酯(320μg/mL)。实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)法检测细胞miR-21表达量;MTT法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡率;划痕实验检测细胞迁移能力;双荧光素酶实验验证miR-21与第十染色体同源丢失性磷酸酶和张力蛋白基因(PTEN)的靶向关系;免疫印迹法检测细胞PTEN、蛋白激酶B(AKT)、p-AKT蛋白表达。结果 与空白组比较,青蒿琥酯组miR-21表达量,24、48、72 h吸光度值,迁移率,p-AKT/AKT降低,凋亡率、PTEN蛋白表达量升高(P<0.05),mimics组miR-21表达量,24、48、72 h吸光度值,迁移率,p-AKT/AKT升高,凋亡率、PTEN蛋白表达量降低(P<0.05);与青蒿琥酯组比较,联合组miR-21表达量,24、48、72 h吸光度值,迁移率,p-AKT/AKT升高,凋亡率、PTEN蛋白表达量降低(P<0.05);与mimics组比较,联合组miR-21表达量,24、48、72 h吸光度值,迁移率,p-AKT/AKT降低,凋亡率、PTEN蛋白表达量升高(P<0.05);双荧光素酶结果显示,PTEN是miR-21的靶基因。结论 青蒿琥酯可抑制甲状腺癌细胞增殖、迁移,并促进其凋亡,其作用机制可能与下调miR-21进一步靶向调控下游PTEN/AKT轴表达有关。

重症急性胰腺炎继发感染影响因素及其与miR-216a-PTEN水平的关系

目的 分析重症急性胰腺炎(SAP)继发感染的影响因素及其与微小RNA-216a(miR-216a)-磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)的关系。方法 收集2020年2月-2022年2月新乡市中心医院普瘤三科收治的SAP患者96例为研究对象,分析SAP患者继发感染和病原菌及耐药情况,归纳SAP患者继发感染的影响因素,分析miR-216a-PTEN信号通路分子与SAP继发感染的关系。结果 SAP继发感染29例,感染发生率为30.21%(29/96);29例SAP继发感染患者腹水标本,检出病原菌41株,其中革兰阴性菌24株占58.54%,以鲍氏不动杆菌为主,革兰阳性菌12株占29.27%,真菌5株占12.20%;鲍氏不动杆菌对美罗培南、亚胺培南、头孢曲松、头孢吡肟、左氧氟沙星、庆大霉素、丁胺卡那霉素常用抗菌药物耐药率较高(>80%),对替加环素、头孢哌酮/舒巴坦敏感性高,大肠埃希菌对头孢曲松、头孢吡肟、左氧氟沙星耐药率较高(均>70%),而对美罗培南、亚胺培南、丁胺卡那霉素耐药率较低,金黄色葡萄球菌对多数抗菌药物耐药率高,仅对利奈唑胺、呋喃坦啶、万古霉素耐药率低;miR-216a mRNA、PTEN mRNA、PTEN蛋白与SAP继发感染的发生相关(P<0.05)。结论 SAP继发感染病原菌以革兰阴性菌为主,抗感染治疗需依据药敏试验选择合理抗菌药物,miR-216a-PTEN信号通路分子参与SAP继发感染,有望为SAP继发感染新的治疗潜在靶点提供新思路。

微小RNA-29a/PTEN通路在铝致神经元网络损伤中的作用及机制

[背景]铝可致海马突触可塑性损伤,其机制可能是神经元间信号传递受阻。微小RNA-29a(miR-29a)能够靶向调控第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(PTEN)的表达,参与神经元网络的生成,并可能参与铝对神经元网络电活动的影响。[目的]通过体外培养经过麦芽酚铝[Al(mal)_(3)]处理的ICR小鼠原代海马神经元,研究miR-29a靶向调控PTEN在铝对神经元网络损伤中的作用及机制。[方法]体外培养24 h内新生的ICR乳鼠原代海马神经元,在培养第6天时使用免疫荧光化学法标记神经元特异性蛋白微管相关蛋白2(MAP2)确定神经元的纯度;使用不同浓度的Al(mal)_(3)处理神经元,将神经元分为对照组,10、20、40μmol·L^(-1)Al(mal)_(3)组,采用CCK-8法检测神经元细胞活力,后续实验选择20μmol·L^(-1)Al(mal)_(3)建立神经元网络损伤模型进行干预。采用慢病毒感染的方法转染miR-29a进入神经元,分为mNG组、mNG+20μmol·L^(-1)Al(mal)_(3)组、miR-29a组、miR-29a+20μmol·L^(-1)Al(mal)_(3)组,使用微电极阵列(MEA)分析神经元及神经网络的放电情况,使用实时定量PCR(RT-PCR)检测各组miR-29a和PTEN mRNA的表达情况,采用Western blotting检测各组神经元PTEN蛋白的表达情况。[结果]小鼠原代海马神经元的纯度大于90%,各组原代海马神经元细胞活力均在80%以上。在Al(mal)_(3)处理48 h时,接种于MEA板上的对照组神经元自发放电频率、簇发放电频率、网络簇发放电频率和同步指数变化幅度分别为207.56%±38.70%、73.19%±46.43%、75.42%±33.04%和117.13%±15.54%,Al(mal)_(3)处理组神经元网络电活动呈现下降的趋势。与对照组相比,20、40μmol·L^(-1)Al(mal)_(3)组的自发放电频率、簇发放电频率、网络簇发放电频率和同步指数明显下降(变化幅度分别为171.70%±28.08%、49.20%±23.23%、50.20%±18.18%、85.45%±20.30%和150.68%±26.15%、43.43%±15.54%、52.05%±26.31%、26.80%±8.29%,均P<0.05)。与对照组(1.00)相比,20、40μmol·L^(-1)Al(mal)_(3)组miR-29a的相对表达水平分别下降为0.74±0.09和0.62±0.12(均P<0.05),PTEN mRNA的相对表达水平分别升高为1.32±0.12和1.48±0.11(均P<0.05),PTEN蛋白相对表达量分别升高到1.29±0.12和1.82±0.10(均P<0.05)。使小鼠原代海马神经元过表达miR-29a,与mNG组相比,miR-29a组的自发放电频率、簇发放电频率和网络簇发放电频率明显升高(变化幅度分别为252.80%±62.03%、171.65%±56.30%和197.75%±27.12%,均P<0.05),mNG+20μmol·L^(-1)Al(mal)_(3)组的神经元网络电活动明显下降(各参数变化幅度分别为123.28%±47.31%、66.62%±31.53%、70.60%±12.48%和52.86%±20.26%,均P<0.05)。与mNG+20μmol·L^(-1)Al(mal)_(3)组相比,miR-29a+20μmol·L^(-1)Al(mal)_(3)组的神经元网络电活动明显升高(各参数变化幅度分别为161.41%±42.13%、101.16%±30.63%、127.02%±29.58%和109.73%±15.61%,均P<0.05)。与mNG组(1.00)相比,miR-29a组神经元PTEN mRNA相对表达量(0.67±0.11)明显下降(P<0.05),PTEN蛋白表达(0.75±0.08)下降(P<0.05);mNG+20μmol·L^(-1)Al(mal)_(3)组PTEN mRNA相对表达量(1.32±0.12)明显升高(P<0.05),PTEN蛋白相对表达量(1.46±0.15)上升(P<0.05)。与mNG+20μmol·L^(-1)Al(mal)_(3)组比较,miR-29a+20μmol·L^(-1)Al(mal)_(3)组PTEN mRNA相对表达量(0.93±0.06)降低(P<0.05),PTEN蛋白相对表达量(0.92±0.09)降低(P<0.05)。[结论]铝显著抑制海马神经元网络电活动,miR-29a通过调控PTEN的表达可能参与铝致海马神经元网络电活动损伤。