血清微小RNA-296、CC趋化因子受体3表达与非小细胞肺癌复发转移的相关性分析

目的检测非小细胞肺癌患者血清微小RNA-296(microRNA-296,miR-296)、CC趋化因子受体3(CC chemokine receptor-3,CCR3)的表达情况,并探究其表达水平与非小细胞肺癌患者复发转移的相关性。方法选取2016年6月至2018年1月湖南省直中医医院收治的非小细胞肺癌患者70例为非小细胞肺癌组,同期选取在本院进行常规体检的健康人群70例为对照组。采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测所有研究对象血清miR-296、CCR3的表达水平。分析血清miR-296、CCR3表达水平与非小细胞肺癌临床病理特征之间的关系;通过Kaplan-Meier法绘制复发转移曲线评估血清miR-296、CCR3表达水平对非小细胞肺癌患者复发转移的影响;采用Cox回归分析非小细胞肺癌患者复发转移的影响因素。结果非小细胞肺癌组血清miR-296、CCR3表达水平均显著高于对照组(P<0.05)。非小细胞肺癌患者血清miR-296、CCR3表达与吸烟、分化程度及临床分期密切相关(P<0.05)。miR-296高表达组治疗后2年复发转移率高于miR-296低表达组(P<0.05),CCR3高表达组治疗后2年复发转移率高于CCR3低表达组(P<0.05)。miR-296高CCR3高组患者复发转移率显著高于miR-296低CCR3低组,差异有显著性(P<0.001),miR-296低CCR3高组患者复发转移率高于miR-296高CCR3低组,差异无显著性(P=0.531)。Cox回归分析结果显示,血清miR-296、CCR3高表达和分化程度是影响非小细胞肺癌患者预后的独立危险因素。结论miR-296、CCR3在非小细胞肺癌患者血清中的表达水平明显升高,且与患者分化程度有关,二者水平均与患者复发转移密切相关,提示miR-296、CCR3可能作为非小细胞肺癌复发转移预测的潜在生物学指标。

长链非编码RNA锌指蛋白667反义RNA1通过下调微小RNA-296表达抑制胶质瘤细胞U87MG侵袭、转移

目的:观察长链非编码RNA(lncRNA)锌指蛋白667反义RNA1(ZNF667-AS1)下调微小RNA(miRNA,miR)-296对胶质瘤细胞U87MG侵袭、转移的影响。方法:双荧光素酶鉴定ZNF667-AS1与miR-296的靶向关系。实验分为对照组、空载体质粒组、sh-ZNF667-AS1组、sh-ZNF667-AS1+阴性对照组、sh-ZNF667-AS1+miR-296 mimic组。空载体质粒组转染pEGFPN1空载体,sh-ZNF667-AS1组转染pEGFPN1-sh-ZNF667-AS1,质粒转染成功后,在sh-ZNF667-AS1组基础上,sh-ZNF667-AS1+阴性对照组转染miR-296 mimic NC,sh-ZNF667-AS1+miR-296 mimic组转染miR-296 mimic。实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测细胞中ZNF667-AS1、miR-296水平;细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖;Transwell检测细胞侵袭和迁移;蛋白质免疫印迹实验检测细胞中迁移侵袭抑制蛋白(MIIP)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)蛋白水平。多组间比较行单因素方差分析,进一步两两比较行SNK-q法。结果:生物信息学软件(Starbase)分析显示ZNF667-AS1序列上存在miR-296潜在结合位点,且经荧光素酶实验验证,miR-296与ZNF667-AS1呈正相关(P<0.05)。0 h各组细胞吸光度(A450)值差异无统计学意义(F=1.071,P>0.05),12、24、36、48 h各组细胞A450值比较,差异有统计学意义(F=17.238、93.997、48.271、60.646,P<0.05)。细胞处理48 h,对照组、空载体质粒组、sh-ZNF667-AS1组、sh-ZNF667-AS1+阴性对照组、sh-ZNF667-AS1+miR-296 mimic组中ZNF667-AS1水平分别为1.01±0.12、0.98±0.14、0.44±0.09、0.46±0.07、0.76±0.12;miR-296水平分别为1.01±0.14、1.02±0.13、0.39±0.06、0.42±0.05、0.72±0.09;侵袭细胞数量分别为(83.25±6.05)、(84.37±8.76)、(39.49±4.15)、(42.15±7.42)、(63.18±7.13)个;迁移细胞数量分别为(126.60±8.79)、(124.49±9.12)、(76.16±6.48)、(79.44±12.15)、(118.18±6.86)个,且差异有统计学意义(F=36.498、55.130、58.771、47.314,P<0.05)。结论:降低ZNF667-AS1表达可下调miR-296表达抑制胶质瘤细胞U87MG侵袭、转移,而过表达miR-296可逆转上述过程。

微小RNA-296在肿瘤演进中的作用

肿瘤演进是一个多步骤、多因素参与的复杂过程.微小RNA-296（miR-296）在肿瘤演进中扮演重要角色,涉及肿瘤细胞的增殖、分化、血管新生、侵袭、迁移、凋亡以及耐药性等一系列过程.

微小RNA-296对三阴性乳腺癌增殖与凋亡的影响

目的检测微小RNA(miR)-296在三阴性乳腺癌(TNBC)组织及细胞株中的表达,探讨miR-296对TNBC细胞增殖,凋亡的影响及其机制。方法TNBC细胞株人乳腺癌细胞-231(MDA-MB-231),人乳腺癌细胞-453(MDA-MB-453)及人正常乳腺上皮细胞(MCF10A)购自中国科学院上海细胞生物学研究所,miR-296的过表达及干扰质粒分别转染至细胞株中,细胞分组为MDA-MB-231、MDA-MB-231-mimics、MDA-MB-231-anti-sh296及MDA-MB-453、MDA-MB-453-mimics、MDA-MB-453-anti-sh296;实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测miR-296在各组细胞中的相对表达量;使用LipofectamineTM 2000脂质体转染miR-296至细胞中,Real-time PCR证实转染成功后;通过细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)检测对细胞生存率的影响;通过集落形成实验检测细胞的增殖能力;流式细胞实验检测miR-296对细胞凋亡的影响。应用SPSS 16.0统计软件分析。结果与癌旁组织比较,miR-296在TNBC组织中的含量明显降低(0.48±0.23比1.00±0.25,t=10.89,P<0.01)。miR-296在TNBC细胞株MDA-MB-231,MDA-MB-453中的表达明显低于正常乳腺上皮细胞MCF10A(0.19±0.08比1.00±0.26,t=8.36,P<0.01;0.46±0.19比1.00±0.26,t=4.68,P<0.01);与对照组比较,过表达miR-296后MDA-MB-231-mimics和MDA-MB-453-mimics细胞生存率低于转染前[(65.81±10.49)%比(99.39±22.58)%,t=3.82,P<0.01],[(73.17±11.81)%比(100.13±19.35)%,t=3.36,P<0.01];而给予干扰miR-296后细胞生存率较转染前升高;过表达miR-296后,细胞MDA-MB-231-mimics和MDA-MB-453-mimics的克隆相对值明显低于对照组(0.23±0.10比0.99±0.23,t=8.12,P<0.01),(0.43±0.16比1.01±0.20,t=6.44,P<0.01);而干扰miR-296后的克隆相对值明显高于对照组;过表达miR-296后,MDA-MB-231-mimics和MDA-MB-453-mimics细胞的凋亡百分数高于对照组[(25.76±2.83)%比(6.73±1.09)%,t=17.72,P<0.01],[(21.16±2.92)%比(5.56±0.87)%,t=14.47,P<0.01],干扰miR-296后细胞的凋亡百分数下降。过表达miR-296后,细胞MDA-MB-231-mimics和MDA-MB-453-的CX3趋化因子受体1(CX3CR1)的表达量低于对照组(0.36±0.14比1.00±0.20,t=7.45,P<0.01),0.43±0.10比1.00±0.16,t=8.48,P<0.01);而干扰miR-296后,细胞MDA-MB-231-sh-296和MDA-MB-453-sh-296的CX3CR1的表达量高于对照组(5.91±1.57比1.00±0.20,t=8.79,P<0.01),(4.89±1.08比1.00±0.16,t=10.03,P<0.01)。结论抑制miR-296的表达,可以通过靶向作用提高TNBC细胞的生存率,降低凋亡百分数,提示miR-296可能通过CX3CR1在TNBC中发挥抑癌作用。

微小RNA-296-3p靶向核蛋白1调控舌鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究

目的研究微小RNA-296-3p对舌鳞状细胞癌(简称舌鳞癌)细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其潜在机制。方法以正常口腔上皮黏膜角质细胞HOK为对照,实时定量聚合酶链反应法检测舌鳞癌细胞系CAL27、SCC15和SCC9中miR-296-3p和核蛋白1(NUPR1)mRNA的表达,蛋白印迹法检测NUPR1蛋白表达水平。CAL27细胞分为对照组(NC组)、miR-con组、miR-296-3p组、si-con组、si-NUPR1组、miR-296-3p+pcDNA组和miR-296-3p+pcDNA-NUPR1组,细胞计数试剂盒8(CCK8)法检测细胞活性,Transwell检测细胞迁移和侵袭,蛋白印迹法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证CAL27细胞中miR-296-3p与NUPR1的调控关系。结果与HOK细胞相比,在舌鳞癌细胞系CAL27、SCC15和SCC9中miR-296-3p的含量显著降低(0.54±0.08、0.38±0.05、0.59±0.07比1.04±0.12,t=10.401、15.231、9.718,P均<0.05),NUPR1 mRNA(5.94±0.40、4.48±0.45、5.19±0.48比0.94±0.12,t=35.918、22.803、25.769)和NUPR1蛋白(0.79±0.09、0.54±0.05、0.62±0.08比0.28±0.04,t=15.535、12.182、11.404)表达量均显著升高(P均<0.05)。与NC组、miR-con组相比,miR-296-3p组CAL27细胞活性、迁移数、侵袭数及PCNA、MMP-2和MMP-9的蛋白表达均降低(P均<0.05)。与NC组、si-con组相比,si-NUPR1组CAL27细胞活性、迁移数、侵袭数及PCNA、MMP-2和MMP-9的蛋白表达均降低(P均<0.05)。miR-296-3p在CAL27细胞负调控NUPR1表达。与miR-296-3p+pcDNA组相比,miR-296-3p+pcDNA-NUPR1组CAL27细胞活性(138.34±5.73比98.54±5.89,t=14.530)、迁移数(95.28±7.56比67.92±5.23,t=8.929)、侵袭数(184.53±17.57比101.26±10.64,t=12.162)及PCNA(0.68±0.07比0.35±0.06,t=10.738)、MMP-2(0.43±0.05比0.29±0.04,t=6.559)和MMP-9(0.58±0.06比0.33±0.08,t=7.500)的蛋白表达均升高(P均<0.05)。结论miR-296-3p通过靶向负调控NUPR1表达抑制舌鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

循环miRNA-296-5p与原发性高血压发病机制的相关性研究

目的:探讨血浆中miRNA-296-5p与原发性高血压(EH)的相关性。方法:选取EH患者80例和非EH患者80例,收集两组患者基本病史、心血管疾病用药情况等一般资料,采用qRT-PCR检测其血浆中循环miRNA-296-5p的表达水平,生物信息学预测miRNA-296-5p的靶基因以及其调控的信号通路,ELISA检测两组患者血浆中TGF-β1和ACE2的表达,并分析两者与miRNA-296-5p的相关性。结果:EH组与非EH组在年龄、性别、BMI、基本病史和部分血液学生化指标比较,差异无统计学意义(P>0.05);EH组血浆中循环miRNA-296-5p表达水平明显高于非EH(P<0.01);ROC曲线分析发现曲缺中miRNA-296-5p曲线下面积为0.844 5,95%可信区间为(CI)0.782 5~0.906 4(P<0.01),灵敏度80.00%,特异性90.00%;生物信息学预测发现miRNA-296-5p的靶基因可能为血管转化生长因子-β1(TGF-β1)和血管紧张素转化酶2(ACE2),可能调控血管转化生长因子/SMAD(TGF-β/SMAD)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K-Akt)、胰岛素/胰岛素生长因子信号通路(Insulin/IGF)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NOTCH等信号通路,并可能参与多种circRNA的调控;ELISA检测发现EH组TGF-β1和ACE2的表达明显高于非EH组(P<0.01),miRNA-296-5与TGF-β1、ACE2均呈正相关(r=0.317 6、0.417 1,P<0.01)。结论:血浆中循环miRNA-296-5p可能通过调控TGF-β1和ACE2导致EH的发生,并可以作为EH新的临床诊断标志物。

蜂胶黄酮PB3A作用下结肠癌细胞株中miRNA-198和miRNA-296-5p的表达及功能预测

目的:探讨蜂胶黄酮短叶松素-3-乙酸酯(pinobanksin-3-acetate,PB3A)对结肠癌SW480细胞微小RNA(microRNA,miRNA)表达谱的影响,为结肠癌的治疗及靶向药物研发提供理论依据。方法:使用miRNA芯片技术分析检测蜂胶黄酮PB3A处理人类结肠癌SW480细胞后miRNA表达谱的变化。通过实时荧光定量PCR方法检测miRNA-198和miRNA-296-5p的表达水平,以此来验证miRNA芯片结果的准确性和可靠性。利用miRWalk、Micro T、miRanda等12个网上数据库预测这2条miRNAs的靶基因并进行靶基因功能富集分析。结果:miRNA芯片分析结果显示,蜂胶黄酮PB3A干预24 h后结肠癌SW480细胞中差异表达倍数在2倍及以上的miRNA有267条,其中差异表达倍数达10倍及以上的miRNA有30条,28条为上调表达,2条下调表达;RT-qPCR实验结果显示miRNA-198和miRNA-296-5p的表达量趋势跟miRNA芯片结果一致,表达差异有统计学意义(P<0.05)。miRNA靶基因预测发现miRNA-198有859个靶基因,miRNA-296-5p有906个靶基因;对这些可能被调控的靶基因进行Gene Class分析,结果显示miRNA-198和miRNA-296-5p的靶基因功能主要为转录因子、拷贝数变异、细胞分化、癌基因、蛋白激酶、组蛋白、转移癌基因、肿瘤抑制基因等(P<0.05)。信号通路富集分析结果显示,miRNA-198靶基因显著富集于肿瘤通路、Wnt信号通路、胞吞通路、Erb B信号通路、黏着斑通路、黑素生成通路等信号通路,而miRNA-296-5p靶基因在MAPK信号通路、胞吞通路、轴突导向通路、Wnt信号通路、胰岛素信号通路、钙离子信号通路等信号通路中出现聚集(P<0.05)。结论:蜂胶黄酮PB3A影响结肠癌SW480细胞的miRNA表达谱。PB3A作用下miRNA-198和miRNA-296-5p的异常表达可能参与PB3A抗结肠癌的过程。

miR-296对人肺腺癌A549细胞恶性生物学行为的影响

目的探讨微小RNA-296(miR-296)对人肺腺癌A549细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响及其潜在的分子机制。方法将miR-296表达载体、抑制剂及相应阴性对照分别转染人肺腺癌A549细胞,实时PCR检测miR-296在不同细胞中的表达情况,CCK8法和平板克隆实验检测miR-296对A549细胞增殖能力的影响,流式细胞术检测细胞凋亡率,Transwell法检测细胞迁移能力,Western blotting检测S100A4在各组A549细胞中的表达情况。结果与相应的对照组比较,转染了miR-296表达载体的A549细胞miR-296表达显著上调,细胞增殖和迁移能力明显下降,凋亡率明显上升,S100A4蛋白表达下调,差异均有统计学意义(均P<0.05);而转染了miR-296抑制剂的A549细胞miR-296表达显著下调,细胞增殖和迁移能力明显增强,凋亡率明显下降,S100A4蛋白表达上调,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论miR-296通过靶向调控S100A4表达来抑制A549细胞增殖、迁移,促进凋亡。

白术内酯Ⅲ对自发性高血压大鼠脑卒中的影响及机制研究

目的探讨白术内酯Ⅲ(AⅢ)通过微小RNA-296-5p(miR-296-5p)对自发性高血压大鼠(SHR)脑卒中的作用及可能机制。方法使SHR连续2个月自由饮用0.9%氯化钠溶液,然后给予1%氯化钠溶液喂养,构建SHR脑卒中模型。将模型大鼠分为模型组(Model组)、AⅢ低剂量组(AⅢ-L组)、AⅢ高剂量组(AⅢ-H组)、阳性药物尼莫地平组(Nim组)、miR-296-5p激动剂组(miR-296-5p agomir组)、agomir NC组、AⅢ-H+miR-296-5p agomir组、AⅢ-H+agomir NC组,每组12只。检测并记录大鼠神经症状评分、平均动脉压、存活时间、血小板黏附率变化,采用苏木素-伊红(HE)染色法检测大鼠脑组织海马CA1区病理变化,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测海马CA1区中miR-296-5p表达。结果与NC组比较,Model组大鼠神经症状评分、平均动脉压、血小板黏附率、miR-296-5p表达升高,存活时间缩短,海马CA1区病理损伤严重,差异有统计学意义(P<0.05);与Model组比较,AⅢ-L组、AⅢ-H组、Nim组大鼠神经症状评分、平均动脉压、血小板黏附率、miR-296-5p表达降低,存活时间延长,海马CA1区病理损伤减轻,差异有统计学意义(P<0.05);与Model组、agomir NC组比较,miR-296-5p agomir组大鼠神经症状评分、平均动脉压、血小板黏附率、miR-296-5p表达升高,存活时间缩短,海马CA1区病理损伤加剧,差异有统计学意义(P<0.05);与AⅢ-H组、AⅢ-H+agomir NC组比较,AⅢ-H+miR-296-5p agomir组大鼠神经症状评分、平均动脉压、血小板黏附率、miR-296-5p表达升高,存活时间缩短,海马CA1区病理损伤严重,差异有统计学意义(P<0.05)。结论AⅢ可能通过抑制miR-296-5p表达对SHR脑卒中起到治疗作用。