微小RNA-32通过抑制Kruppel样因子4表达促进胃癌细胞的增殖与侵袭

目的观察微小RNA（miRNA，miR）-32对胃癌细胞增殖及侵袭的影响，探讨其调控机制。方法通过实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）测定miR组、lent-shmiR-32组和lent-vector组，采用Lipofectamine2000和慢病毒分别转染miR-32mimics、scramble、lent-shmiR-32和lent-vector。通过xCELLigence实时细胞分析系统测定4组细胞增殖能力，通过Transwell实验测定4组细胞的侵袭能力，通过Westernblot测定Kruppel样因子4（KLF4）的表达。结果FQ-PCR结果显示，miR-32的表达量在5种胃癌细胞株（AGS、KATO-Ⅲ、MGC8-03、NCI-N87、SGC-7901）中均显著高表达于胃正常组织细胞株GES-1，分别为0．18±0．03比12．40±1．40、0．18±0．03比35．80±2．10、0．18±0．03比27．10±3．60、0．18±0．03比6．20±1．60、0．18±0．03比8．50±3．50，P〈0．01；与scramble组比较，miR-32过表达组的细胞数在48、72h培养后出现显著增加，48h时，miR-32过表达组与scramble组相对细胞数为（160．3±5．4）％比（104．2±3．8）％，P〈0．01；72h时，miR-32过表达组与scramble组相对细胞数为（310．2±5．4）％比（107．2±2．9）％，P〈0．01；miR-32过表达组侵袭细胞数显著多于scramble组，（327±18）个比（113±10）个，P〈0．01。与lent-vector组比较，lent-shmiR-32组的细胞数在48、72h培养后出现显著减少，48h时，lent-shmiR-32组与lent-vector组相对细胞数为（46．5±3．9）％比（102．3±2．9）％，P〈0．01；72h时，lent-shmiR-32组与lent-vector组相对细胞数为（32．6±1．9）％比（104．2±3．7）％，P〈0．01；lent-shmiR-32组侵袭细胞数显著低于lent-vector组[（41±9）个比（99±13）个，P〈0．01]。与lent-vector组比较，lent-shmiR-32组KLF4基因的mRNA水平显著上升（10．3±1．9比1．8±0．3，P〈0．01）；Westernblot显示，与lent-vector组比较，lent-shmiR-32组的MGC8-03细胞中，KLF4蛋白表达量显著升高（3．79±0．54比1．35±0．21，P〈0．01）。miR-32过表达组KLF4的mRNA及蛋白表达水平均显著低于scramble组，分别为0．27±0．05比1．00±0．14，P〈0．01；1．16±0．13比3．26±0．65，P〈0．01。结论miR-32通过下调KLF4基凼表达而促进胃癌细胞增殖与侵袭。

LncRNA MIR503HG靶向miR-32-5p调控 ITGA6表达对非小细胞肺癌增殖与迁移的影响

目的 探讨长链非编码RNA(LncRNA)MIR503HG、微小RNA(miRNAs)-32-5p、整合素α(ITGA)6在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及其对NSCLC细胞增殖和迁移的影响。方法 从癌症基因组图谱(TCGA)数据库中提取273例NSCLC患者癌组织及其对应癌旁组织的LncRNA、miRNA及转录组mRNA的芯片数据,R软件中MAX STAT函数包统计分析LncRNA MIR503HG、miR-32-5p、ITGA6在NSCLC中的表达。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测80例NSCLC患者癌组织标本和NSCLC细胞系中LncRNA MIR503HG、miR-32-5p、ITGA6 mRNA表达。双荧光素酶实验证明LncRNA MIR503HG、miR-32-5p、ITGA6的关系。依次以LncRNA MIR503HG-mimic-NC、LncRNA MIR503HG-mimic、miR-32-5p-agomir-NC、miR-32-5p-agomir、LncRNA MIR503HG-mimic+miR-32-5p-agomir、LncRNA MIR503HG-mimic+miR-32-5p-agomir+pcDNA3.1-ITGA6、miR-32-5p-agomir+pcDNA3.1-ITGA6转染H1299细胞,另设定正常(Normal)组细胞。EDU染色实验与Transwell小室实验检测各组细胞体外增殖与转移活性;裸鼠体内皮下种植肿瘤模型检测细胞体内生长与转移能力。Western印迹检测ITGA6、E-钙黏蛋白(cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达。结果 在线分析结果显示,与癌旁组织和BEAS-2B细胞相比,LncRNA MIR503HG、ITGA6 mRNA在NSCLC组织和NSCLC细胞表达升高,miR-32-5p mRNA下降,差异具有统计意义(均P<0.05)。双荧光素酶实验证实LncRNA MIR503HG靶向miR-32-5p表达,miR-32-5p靶向ITGA6表达。过表达LncRNA MIR503HG可增强H1299细胞的体外增殖与转移及体内生长与转移能力,ITGA6和Vimentin表达升高,E-cadherin表达降低,miR-32-5p-agomir可部分逆转这一作用,而pcDNA3.1-ITGA6可部分修复这一逆转作用,差异均具有统计意义(P<0.05)。结论 下调LncRNA MIR503HG表达能降低H1299细胞增殖与转移能力,发挥抑癌效应,其机制可能与靶向miR-32-5p调控ITGA6表达水平有关,为NSCLC的治疗提供靶点。

胃癌组织中CDX2和miRNA-32表达与患者预后的关系

目的:探讨胃癌组织中尾型同源盒转录因子2(CDX2)、miRNA-32表达与患者临床病理参数、预后的关系。方法:收集50例胃癌组织,采用免疫组化检测CDX2蛋白表达,分析CDX2表达与患者临床病理参数及预后的关系;实时荧光定量PCR检测肿瘤和癌旁组织中CDX2 mRNA和miRNA-32表达,分析两者相关性及其与临床病理参数的关系。结果:胃癌组织中CDX2蛋白阳性率为58.0%,CDX2蛋白阳性表达率淋巴结转移患者为45.2%,临床Ⅲ~Ⅳ期患者为46.9%,分别低于无淋巴结转移患者的78.9%和临床Ⅰ~Ⅱ期患者的77.8%,差异均有统计学意义(P<0.05)。与CDX2阳性患者比较,CDX2阴性患者术后2年和3年累计复发率分别为80.9%和95.2%,高于CDX2阳性患者的44.8%和69.0%,差异均有统计学意义(P<0.05),中位复发时间和5年生存率低于CDX2阳性患者,差异均具有统计学意义(P<0.05)。CDX2 mRNA和miRNA-32表达与肿瘤浸润深度、临床分期、淋巴结转移有关,差异均有统计学意义(P<0.05),miRNA-32与CDX2 mRNA表达呈正相关(r=0.861,P<0.05)。结论:胃癌组织CDX2和miRNA-32表达下调或缺失与患者临床病情进展相关,术后易复发,生存期缩短,预后不良。

miR-32-5p和FKBP14基因转染对SPC-A1细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其靶向关系验证

目的观察miR-32-5p和FK506结合蛋白14(FKBP14)基因转染对人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系SPC-A1增殖、迁移、侵袭能力的影响,并验证两者之间靶向关系。方法选取SPC-A1细胞,将细胞为A、B、C、D、E、F组,分别转染miR-32-5p+pcDNA-FKBP14、miR-32-5p+pcDNA、miR-32-5p、miR-con、pcDNA-FKBP14、pcDNA-con,采用MTT法检测细胞吸光度值,并计算细胞存活率;Transwell实验检测细胞迁移数、侵袭数,Western blotting法检测细胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量。取SPC-A1细胞,将细胞分为G、H、I、J组,分别转染FKBP14-WT+miR-con、FKBP14-WT+miR-32-5p、FKBP14-MUT+miR-con、FKBP14-MUT+miR-32-5p,采用荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性。取SPC-A1细胞,将细胞分为K、L、M、N组,分别转染miR-32-5p、miR-con、anti-miR-32-5p、anti-miR-con,Western blotting法检测细胞中KBP14蛋白相对表达量。结果与B组比较,A组细胞存活率、迁移细胞数、侵袭细胞数及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量增加(P均<0.05);与D组比较,C组细胞存活率、迁移细胞数、侵袭细胞数及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量减少(P均<0.05);与F组比较,E组SPC-A1细胞存活率、迁移细胞数、侵袭细胞数及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量增加(P均<0.05)。与G组比较,H组细胞荧光素酶活性减弱(P<0.05);与I组比较,J组细胞荧光素酶活性无显著变化(P>0.05)。与L组比较,K组FKBP14蛋白相对表达量减少(P<0.05);与N组比较,M组FKBP14蛋白相对表达量增加(P<0.05)。结论过表达miR-32-5p或敲减FKBP14后SPC-A1细胞存活率降低,迁移细胞数、侵袭细胞数减少,miR-32-5p与FKBP14存在靶向调控关系。

结肠癌组织中lncRNA XIST、miR-32-5p、EZH2的表达变化及临床意义

目的观察结肠癌组织中长链非编码RNA(lncRNA)X染色体失活特异性转录本基因(XIST)、微小RNA(miR)-32-5p、基因增强子的人类同源基因(EZH2)的表达变化,并探讨其临床意义。方法采用实时荧光定量PCR检测86例结肠癌组织和癌旁组织中的lncRNA XIST、miR-32-5p、EZH2,分析lncRNA XIST、miR-32-5p、EZH2表达与患者临床病理特征的关系,采用Pearson线性相关分析三者之间的相关性。结果与癌旁组织相比,结肠癌组织中lncRNA XIST、EZH2表达高,而miR-32-5p表达低(P均<0.05)。结肠癌组织中lncRNA XIST、miR-32-5p、EZH2表达与肿瘤分期有关(P均<0.05)。结肠癌组织中lncRNA XIST与miR-32-5p的表达呈负相关(r=-0.612,P<0.01),miR-32-5p与EZH2的表达呈负相关(r=-0.608,P<0.01)。结论结肠癌组织中lncRNA XIST、EZH2表达升高,而miR-32-5p表达降低,均与肿瘤分期有关,有可能成为新的结肠癌肿瘤标志物。

下调miR-32对幽门螺杆菌诱导的肠上皮细胞凋亡及TAK1-p38通路的影响

目的探究下调微小RNA-32(miR-32)对幽门螺杆菌(H.pylori)诱导的肠上皮细胞凋亡及转化生长因子β激活激酶1-p38丝裂原激活蛋白激酶(TAK1-p38)通路的影响。方法体外培养正常人肠上皮细胞系HIEC-6细胞,分为空白对照组(BC组,无H.pylory感染无转染正常培养HIEC-6细胞)、H.pylory组(H.pylory感染)、H.pylory+NC组(inhibitor-NC转染+H.pylory感染)、H.pylory+inhibitor组(miR-32 inhibitor转染+H.pylory感染),CCK-8法检测各组HIEC-6细胞活性,Annexin V-FITC/PI检测各组HIEC-6细胞凋亡,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)表达量,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测各组细胞miR-32、TAK1、p38 mRNA表达水平,免疫印迹(WB)检测各组细胞TAK1、p38蛋白表达水平。结果与BC组比较,H.pylory组HIEC-6细胞miR-32表达水平、凋亡率、上清液TNF-α、IL-6表达量、细胞TAK1、p38 mRNA及蛋白表达水平显著增加,细胞活性显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与H.pylory+NC组比较,H.pylory+inhibitor组miR-32表达水平、凋亡率、上清液TNF-α、IL-6表达量、细胞TAK1、p38 mRNA及蛋白表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),细胞活性显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论下调miR-32可抑制H.pylory感染诱导的HIEC-6细胞凋亡,可能与抑制TAK1-p38通路,减轻细胞炎性反应有关。

下调miR-32-5p表达对顺铂耐药肺癌细胞化疗敏感性的影响及其机制

目的探讨下调微小RNA-32-5p(miR-32-5p)表达对顺铂(DDP)耐药肺癌细胞化疗敏感性的影响及其机制。方法体外培养人肺癌细胞系A549、SPC-A-1、H226(以下分别称A549、SPC-A-1、H226细胞)和人正常肺支气管上皮细胞系BEAS2B(以下称BEAS2B细胞),采用RT-qPCR法检测miR-32-5p表达,选择miR-32-5p相对表达量最高的肺癌细胞进行后续实验。采用药物持续接触、浓度递增诱导法筛选DDP耐药肺癌细胞。采用MTS法检测肺癌细胞及其DDP耐药细胞DDP半数抑制浓度(IC50),采用RT-qPCR法检测肺癌细胞及其DDP耐药细胞miR-32-5p表达。选择上述DDP耐药肺癌细胞,随机分为观察组和对照组,分别转染miR-32-5p inhibitor、NC inhibitor,采用RT-qPCR法验证转染效率,采用MTS法检测两组DDP IC50,采用流式细胞仪检测两组细胞凋亡率,采用Western blotting法检测两组Bax、Bcl-2蛋白表达。通过TargetScan7.2软件预测miR-32-5p的靶基因。取DDP耐药肺癌细胞,随机分为miR-32-5p mimic-TCF21-wt组、miR-32-5p inhibitor-TCF21-wt组、miR-32-5p mimic-TCF21-mut组、miR-32-5p inhibitor-TCF21-mut组,相应转染miR-32-5p mimic或miR-32-5p inhibitor、pGLO-TCF21-wt或pGLO-TCF21-mut,采用双荧光素酶报告基因实验检测各组荧光素酶活性。结果A549、SPC-A-1、H226细胞miR-32-5p相对表达量均高于BEAS2B细胞,且A549细胞miR-32-5p相对表达量高于SPC-A-1、H226细胞(P均<0.05)。故选择A549细胞进行后续实验。A549细胞与DDP耐药A549细胞的DDP IC 50分别为(2.92±0.18)、(15.47±3.01)μg/mL,miR-32-5p相对表达量分别为1.00±0.03、12.35±2.87,二者比较P均<0.05。观察组与对照组miR-32-5p相对表达量分别为0.27±0.08、1.00±0.05,DDP IC50分别为(7.43±1.25)、(16.22±2.54)μg/mL,细胞凋亡率分别为(7.69±0.24)%、(2.35±0.18)%,两组比较P均<0.05。观察组Bax蛋白相对表达量高于对照组,Bcl-2蛋白相对表达量低于对照组(t分别为5.28、9.54,P均<0.05)。TargetScan7.2软件在线预测显示,TCF21启动子区与miR-32-5p具有结合位点。双荧光素酶报告基因实验显示,miR-32-5p mimic-TCF21-wt组荧光素酶活性低于miR-32-5p inhibitor-TCF21-wt组(P<0.05),而miR-32-5p mimic-TCF21-mut组与miR-32-5p inhibitor-TCF21-mut组荧光素酶活性比较P>0.05。结论下调miR-32-5p表达能够提高DDP耐药肺癌细胞化疗敏感性,其机制与靶向调控TCF21能够促进Bax蛋白表达、抑制Bcl-2蛋白表达,从而提高细胞凋亡率有关。

微小RN A-32在肝细胞癌中的作用

微小RNA（miRNA）参与多种重要的细胞生物学过程，还参与包括肝细胞癌（HCC）在内的多种疾病的发生与发展。近年来研究发现miR-32在多种肿瘤组织中表达异常，miR-32在HCC中表达上调，扮演了“致癌基因”的角色，参与调控体内HCC细胞的细胞周期、凋亡及侵袭转移等多个病理生理过程，并有望成为HCC治疗的新靶点。