长链非编码RNA SPATA31D5P吸附微小RNA-320a促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的乳腺癌(BC)中存在多种长链非编码RNA(lncRNA)的异常表达,并且与生存预后密切相关。本研究旨在探讨lncRNA SPATA31D5P在乳腺癌中的表达并通过吸附miR-320a影响乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力。方法收集乳腺癌组织及癌旁组织各30例,采用Real-time PCR检测SPATA31D5P在乳腺癌组织及乳腺癌细胞系中的表达水平。选择乳腺癌MDA-MB-231细胞转染针对SPATA31D5P siRNA干扰载体,采用CCK-8法、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(Ed U)法、Transwell小室实验和细胞划痕实验测定细胞增殖、侵袭和迁移能力,流式细胞术检测细胞周期和凋亡的改变。采用生物信息学方法筛选可与SPATA31D5P互补结合的miRNAs,Real-time PCR及双荧光素酶报告实验验证SPATA31D5P对miR-320a的调控作用。结果乳腺癌组织中SPATA31D5P水平显著高于邻近正常乳腺组织,各乳腺癌细胞系中SPATA31D5P表达都高于正常乳腺上皮细胞MCF10 A。siRNA干扰组的SPATA31D5P水平为0.288±0.052,低于空白对照组的1.114±0.096和阴性对照(NC)组的1.079±0.128(P<0.01)。与NC组和空白对照组相比,干扰组MDA-MB-231细胞的增殖活力明显下降并出现G_(1)期阻滞,凋亡率明显增加(P<0.01);干扰组的划痕愈合率和穿膜细胞数目分别为(14.36±1.75)%和(26±1.52)个,低于NC组的(52.25±1.87)%和(67.33±2.91)个(P<0.01)。双荧光素酶实验证实,SPATA31D5P能够直接调控miR-320a的表达及荧光素酶活性。结论 SPATA31D5P在乳腺癌中高表达,干扰其表达能有效抑制MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭,其作用机制可能与靶向调控miR-320a有关。

长链非编码RNA RP11-641D5.1通过靶向微小RNA-486-5p调控急性髓系白血病细胞增殖、细胞周期和免疫逃逸实验研究

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)RP11-641D5.1对急性髓系白血病细胞增殖、细胞周期及免疫逃逸的调控作用及机制。方法:采用实时定量PCR(RT-qPCR)分析RP11-641D5.1在急性髓系白血病细胞株(HL-60、SKM-1、THP-1、KG-1、NB4)和人骨髓基质细胞HS-5中的表达量。分别将阴性质粒(NC组)和RP11-641D5.1质粒(RP11-641D5.1组)转染至SKM-1细胞。采用集落形成实验和流式细胞术检测转染后各组SKM-1细胞增殖和细胞周期。采用酶联免疫吸附实验检测两组细胞干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)的表达量。采用LncCeRBase软件分析RP11-641D5.1与miR-486-5p的靶向关系,并采用双荧光素酶报告实验验证。采用RT-qPCR检测RP11-641D5.1对微小RNA(miR)-486-5p表达的调控作用。采用蛋白质印迹(Western blot)检测酪氨酸激酶(JAK)-信号转导和转录激活因子3(STAT3)信号通路中磷酸化酪氨酸激酶(p-JAK)、磷酸化转录激活因子(p-STAT)、细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)、核内原癌基因c-myc蛋白的表达。结果:相对于HS-5细胞,急性髓系白血病细胞株HL-60、SKM-1、THP-1、KG-1、NB4中RP11-641D5.1表达较低,且SKM-1细胞中表达最低(均P<0.05),故后续采用SKM-1细胞进行实验。与NC组比较,过表达RP11-641D5.1能够抑制SKM-1细胞增殖和细胞周期进展,促进细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2的表达(均P<0.05)。RP11-641D5.1能够靶向结合miR-486-5p(P<0.05)。与NC组比较,RP11-641D5.1组细胞中miR-486-5p表达下调,JAK-STAT3信号通路相关蛋白表达水平降低(均P<0.05)。结论:RP11-641D5.1在急性髓系白血病中表达水平降低,可能通过下调miR-486-5p表达抑制急性髓系白血病细胞增殖、细胞周期进展和免疫逃逸。

microRNA-320d通过PBX3抑制子宫内膜癌JEC细胞上皮-间质转化功能

【目的】研究microRNA-320d(miR-320d)对子宫内膜癌JEC细胞上皮-间质转化功能的影响及其相关机制。【方法】JEC子宫内膜癌细胞株分别转染miR-320d mimics和negative control mimic,分别作为M320d、NCM组,并设立未转染对照control组,采用RT-PCR法检测各组细胞miR-320d含量。Transwell实验检测3组细胞迁移能力和侵袭能力。Westernblot法检测3组细胞α-Catenin和PBX3表达水平,及PBX3过表达对miR-320d抑制EMT的拮抗作用。双荧光素酶实验检测miR-320d与PBX3的关系。【结果】M320d组miR-320d的表达水平为control组的(808.25±15.58)倍(P<0.05)。M320d组迁移细胞数量29.56±0.59低于control组的94.48±1.02(P<0.05)。M320d组侵袭细胞数量7.33±0.84低于control组的86.28±3.51(P<0.05)。M320d组细胞α-Catenin、E-cadherin蛋白表达量(0.365±0.017、0.261±0.008)高于对照组(0.114±0.010、0.151±0.021),Vimentin蛋白表达量(0.105±0.009)低于对照组(0.211±0.025),PBX3蛋白表达量(0.181±0.002)低于对照组(0.311±0.007)。PBX3过表达M320d组子宫内膜癌细胞中α-Catenin、E-cadherin蛋白表达量(0.139±0.019、0.143±0.007)低于对照组(0.399±0.034、0.261±0.017),Vimentin蛋白表达量(0.234±0.008)高于对照组(0.105±0.009),差异均有统计学意义(P<0.05)。双荧光素酶检验结果显示PBX3为miR-320d的下游靶基因。【结论】miR-320d可能通过降低下游靶基因PBX3水平影响EMT相关蛋白表达,抑制子宫内膜癌JEC细胞的上皮-间质转化功能。

微小RNA-320a通过靶向FoxM1调控肝癌细胞迁移

目的探讨微小RNA-320a(miR-320a)在肝癌细胞中对癌基因Fox M1的靶向调控作用以及对肝癌细胞迁移能力的影响,为肝癌治疗提供新的靶点。方法通过信息学工具网站http://www.micro RNA.org找到可能靶向调控Fox M1表达的微小RNA;利用蛋白印记和双荧光素酶报告基因试验验证miR-320a对Fox M1的调控作用;采用Transwell小室分析miR-320a和Fox M1对肝癌细胞迁移的影响。结果信息学分析表明,miR-320a在Fox M1的3'端非翻译区存在2个潜在结合位点。蛋白印迹实验显示miR-320a降低Fox M1在肝癌细胞中的蛋白水平,双荧光素酶报告基因试验显示miR-320a可以调控Fox M1表达。miR-320a类似物对Fox M1表达有下调作用(P<0.01),miR-320a抑制物对Fox M1表达有上调作用(P<0.05)。Transwell试验表明miR-320a类似物可抑制肝癌细胞株Huh7、HCC-LM3的迁移能力,miR-320a抑制物可增加Huh7、HCC-LM3的迁移能力。当使用小干扰RNA下调Fox M1在这些细胞株中的表达后,miR-320a类似物和miR-320a抑制物对肝癌细胞迁移能力的调控作用明显减弱。结论 miR-320a有抑制肝癌细胞迁移的作用,这种抑制作用是通过靶向调控癌基因Fox M1来实现的。

微小RNA-320a和钠氢交换调控因子1在肝细胞癌中的表达及机制

目的探讨微小RNA(microRNA,miRNA)-320a和钠氢交换调控因子1(Na+/H+exchanger regulatory factor 1,NHERF1)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达及机制。方法收集首都医科大学附属北京佑安医院2015年1月至2016年1月经手术治疗的HCC患者肝癌组织及癌旁组织。采用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测miR-320a和NHERFl在HCC组织、癌旁组织、HCC细胞株Bel-7402和正常肝细胞株HL-7702中的表达。将体外培养的Bel-7402细胞分为对照组、空白组和miR-320a转染组,空白组中仅加入2 ml全培养基;对照组加入2 ml空载体质粒;miR-320a组将稀释的miR-320a混合液加入到完全养基中,最终体积为2 ml;采用RT-PCR检测Bel-7402细胞中miR-320a、NHERF1及β-catenin的表达,采用流式细胞术检测Bel-7402细胞的凋亡,采用Transwell检测Bel-7402细胞迁移侵袭能力。结果miR-320a(0.51±0.01 vs 0.83±0.02)和NHERFl(0.78±0.02 vs 1.42±0.05)在肝癌组织中的表达均显著低于癌旁组织,差异有统计学意义(t值分别为-80.25、-68.05,P均<0.001)。miR-320a(0.75±0.03 vs 0.81±0.04)和NHERFl(0.79±0.05 vs 1.58±0.05)在Bel-7402细胞中的相对表达量均显著低于HL-7702,差异有统计学意义(t=-2.73,P=0.021,t=-27.60,P<0.001)。对照组、空白组和miR-320a转染组在Bel-7402细胞中miR-320a相对表达量分别为0.77±0.04、0.79±0.05和1.28±0.07,差异有统计学意义(H=11.66,P=0.003),miR-320a转染组显著高于对照组和空白组(H值分别为8.308、8.308,P值分别为0.004、0.004)。对照组、空白组和miR-320a转染组Bel-7402细胞中NHERFl相对表达量分别为0.82±0.04、0.70±0.04和1.46±0.06,差异有统计学意义(H=15.17,P=0.001),miR-320a转染组显著高于对照组和空白组(H值分别为8.337、8.308,P值分别为0.004、0.004)。空白组、对照组和miR-320a转染组Bel-7402细胞凋亡率分别为11.2%、11.4%、32.5%,差异有统计学意义(χ^2=9263.95,P<0.001)。其中miR-320a转染组显著高于空白组和对照组(χ^2值分别为7508.35、5100.96,P均<0.001),空白组和对照组间差异无统计学意义(χ^2=1.024,P=0.311)。miR-320a组Bel-7402迁移能力显著降低。对照组、空白组和miR-320a转染组Bel-7402细胞中β-catenin的相对表达量分别为1.66±0.07、1.62±0.06、0.64±0.02,差异有统计学意义(H=12.117,P=0.002)。其中,miR-320a转染组显著低于空白组和对照组(H值分别为8.308、8.308,P值分别为0.004、0.004),空白组和对照组间差异无统计学意义(H=1.641,P=0.200)。结论miR-320a和NHERF1在HCC中表达降低,miR-320a可能通过Wnt信号转导通路发挥作用,抑制癌细胞的增殖。

血清微小miR-92a、miR-26b、miR-320对老年冠心病患者PCI术后不良心血管事件的预测价值

目的 探究血清微小RNA(miR)-92a、miR-26b、miR-320对老年冠心病患者PCI术后不良心血管事件的预测价值。方法 前瞻性选取2021年10月至2023年10月于安阳市人民医院行经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术治疗的172例冠心病患者作为研究组,根据患者术后6个月是否出现主要不良心血管事件(MACE)将其分为MACE组36例和非MACE组136例,另选取同期健康体检者172例作为对照组;比较研究组和对照组受检者的血清miR-92a、miR-26b、miR-320水平,比较MACE组和非MACE组患者的一般资料、血清miR-92a、miR-26b、miR-320水平和生化指标;采用多因素Logistic回归分析老年冠心病患者PCI术后MACE的影响因素;采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清miR-92a、miR-26b、miR-320对老年冠心病患者PCI术后MACE的预测价值。结果 研究组患者的血清miR-92a、miR-320水平分别为2.13±0.40、2.44±0.45,明显高于对照组的1.02±0.27、1.01±0.26,miR-26b水平为0.40±0.09,明显低于对照组的1.00±0.26,差异均有统计学意义(P<0.05);MACE组患者的血清miR-92a、miR-320水平分别为4.65±0.61、5.67±0.71,明显高于非MACE组的1.46±0.34、1.58±0.38,miR-26b水平为0.19±0.04,明显低于非MACE组的0.46±0.10,差异均有统计学意义(P<0.05);MACE组患者的总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、心肌肌钙蛋白I (cTnI)、N端脑钠肽前体(NT-proBNP)分别为(4.68±1.15) mmol/L、(2.97±0.43) mmol/L、(1.05±0.26)μg/L、(1 265.31±46.38) ng/L,明显高于非MACE组的(4.09±1.14) mmol/L、(2.42±0.39) mmol/L、(0.30±0.05)μg/L、(772.35±32.25) ng/L,差异均有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示,miR-92a、miR-320、TC、LDL-C、c TnI、NT-proBNP均是影响老年冠心病患者PCI术后MACE的危险因素(P<0.05),miR-26b为保护因素(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,血清miR-92a、miR-26b、miR-320预测老年冠心病患者PCI术后MACE的AUC为0.848、0.824、0.743,三者联合预测老年冠心病患者PCI术后MACE的AUC为0.888,三者联合优于各自单独预测(Z联合vs miR-92a=2.675、Z联合vs miR-26b=2.681、Z联合vs miR-320=2.712,P<0.05)。结论 老年冠心病患者血清miR-92a、miR-320水平显著升高,miR-26b显著降低,三者联合可有效提高老年冠心病患者PCI术后MACE的预测价值。

干扰微小RNA-320表达通过蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素通路保护高糖诱导的胰岛β细胞损伤

目的探讨微小RNA-320(miR-320)在高糖诱导的胰岛β细胞损伤中的作用和分子机制。方法本研究起止时间为2019年1月至2020年1月。小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞购于中国科学院典型培养物保藏中心,将其分为对照组、高糖组、高糖+miRNA抑制剂阴性对照(anti-miR-NC)组、高糖+miR-320抑制剂(anti-miR-320)组、高糖+蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素(Akt/mTOR)通路抑制剂(LY294002)组、高糖+anti-miR-320+LY294002组。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-320的表达水平。噻唑蓝(MTT)法、流式细胞术分别检测细胞存活和凋亡;酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)的活力;蛋白质印迹法(Western blotting)检测磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化的mTOR复合物1(p-mTORC1)的表达水平。结果与对照组比较,高糖组胰岛β细胞miR-320表达升高[(2.69±0.14)比(0.98±0.06)],存活率降低[(54.03±4.34)%比(99.74±9.16)%],凋亡率[(20.80±1.83)%比(7.75±0.86)%]、LDH活力[(257.76±18.94)U/L比(104.31±10.98)U/L]升高,p-Akt[(0.22±0.01)比(0.65±0.04)]和p-mTORC1蛋白[(0.18±0.02)比(0.51±0.03)]表达降低;与高糖+anti-miR-NC组比较,高糖+anti-miR-320组胰岛β细胞miR-320表达[(1.43±0.06)比(2.76±0.12)]降低,存活率[(89.43±7.11)%比(54.01±4.21)%]升高,凋亡率[(10.95±1.10)%比(20.72±1.76)%]、LDH活力[(139.77±13.24)U/L比(258.21±20.73)U/L]降低,p-Akt[(0.43±0.02)比(0.23±0.01)]和p-mTORC1蛋白[(0.32±0.02)比(0.18±0.01)]表达升高;与高糖组比较,高糖+LY294002组胰岛β细胞存活率[(33.60±3.67)%比(53.97±4.96)%]降低,凋亡率[(32.13±2.02)%比(20.89±2.23)%]、LDH活力[(337.05±24.15)U/L比(257.95±19.10)U/L]升高。与高糖+anti-miR-320组比较,高糖+anti-miR-320+LY294002组胰岛β细胞存活率[(64.00±5.77)%比(89.54±7.10)%]降低,凋亡率[(18.77±1.89)%比(10.93±1.12)%]、LDH活力[(223.38±23.35)U/L比(139.75±13.44)U/L]升高(P<0.05)。结论干扰miR-320表达能够减轻高糖诱导的胰岛β细胞损伤,其机制与激活Akt/mTOR信号通路有关。

子痫前期患者胎盘微小RNA-30d表达与内质网应激的相关性分析

目的探讨微小RNA-30d(micro-RNA-30d,miR-30d)异常表达与内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的关系,以及其在子痫前期致病中的作用。方法2018年10月至2019年9月在海南医学院第二附属医院产科收治的子痫前期患者30例为研究对象,同时选择同期在本院正常分娩产妇30例作为对照组。实时荧光定量聚合酶链式反应检测(real-time polymerase chain reaction,RTPCR)胎盘组织中miR-30d表达,免疫组化学染色检测胎盘组织中CHOP、激活转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、葡萄糖调节蛋白78(glucose regulatory protein 78,GRP78)蛋白表达,并分析miR-30d与胎盘组织中CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT enhancer binding protein homologous protein,CHOP)、ATF6、GRP78等蛋白表达的相关性。采用t检验、Pearson相关系数分析法进行统计分析。结果子痫前期患者胎盘组织中miR-30d表达的2^(-△△Ct)值为0.308±0.072,显著高于对照组的0.115±0.014,差异有统计学意义(P<0.01)。子痫前期胎盘组织中CHOP、ATF6和GRP78 ERS标志蛋白表达较对照组显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。Pearson相关分析显示子痫前期患者胎盘组织中miR-30d表达与CHOP(r=0.517,P<0.05)、ATF6(r=0.452,P<0.05)和GRP78(r=0.484,P<0.05)ERS标志蛋白表达呈显著正相关(P<0.05)。结论子痫前期患者胎盘组织miR-30d高表达,升高的miR-30d激活了ERS,可能是导致子痫前期发生的原因。

微小RNA-181d在食管鳞状细胞癌中的表达及其临床意义

目的探讨miR-181d在食管鳞状细胞癌组织中的表达,并分析其临床意义。方法应用反转录实时荧光定量PCR(reverse transcription quantitative real-time PCR, RT-qPCR)技术检测37例食管鳞状细胞癌癌组织及癌旁组织中miR-181d的表达,分析miR-181d表达与肿瘤临床病理特征的相关性。结果miR-181d在89.2%(33/37)的食管鳞状细胞癌组织中表达水平显著高于对应癌旁组织(P<0.01);miR-181d表达水平与性别、年龄、浸润深度、淋巴结转移、组织学分级、肿瘤部位均无明显相关性(P>0.05),但与TNM分期显著相关(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示,miR-181d高表达组总生存率和无病生存率明显低于低表达组(P<0.05)。结论 mi R-181d在食管鳞状细胞癌组织中的表达与肿瘤的TNM分期及预后相关,mi R-181d可能作为潜在预测指标评估食管鳞状细胞癌患者的预后。

血清miR-26b、miR-320b水平与GDM胰岛素抵抗相关性

目的:分析血清微小RNA-26b(miR-26b)、miR-320b水平与妊娠期糖尿病(GDM)患者发生胰岛素抵抗(IR)的相关性。方法:回顾性随机选取本院2020年5月-2023年5月收治的GDM孕妇85例纳入GDM组,同期产前检查健康孕妇90例为对照组。检测两组孕妇血清miR-26b、miR-320b水平,收集两组孕妇临床相关资料并进行比较。用Pearson法分析miR-26b、miR-320b水平与GDM孕妇IR的相关性。根据研究组孕妇是否发生IR将其分成有IR组和无IR组,单因素和多因素分析GDM孕妇发生IR的影响因素。结果:两组年龄、孕周、生产史、收缩压、舒张压比较无差异(P>0.05);GDM组孕前体质指数(BMI)高于对照组,miR-26b、miR-320b水平均低于对照组,胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)高于对照组(均P<0.05)。GDM组孕妇miR-26b、miR-320b水平与HOMA-IR水平呈负相关(P<0.05),孕妇IR发生率为61.7%。IR孕妇孕前BMI、糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)水平均高于无IR孕妇,miR-26b、miR-320b均低于无IR孕妇(均P<0.05)。经logistic回归分析显示,miR-26b(OR=0.305)、miR-320b(OR=0.426)是GDM孕妇发生IR的独立保护因素(均P<0.05)。ROC曲线分析显示,miR-26b、miR-320b及二者联合预测GDM孕妇发生IR的敏感度分别为73.9%、69.6%、87.0%,特异性分别为66.2%、71.6%、87.8%,曲线下面积分别为0.778、0.798、0.918。结论:miR-26b、miR-320b在GDM孕妇中异常低表达,且与HOMA-IR呈负相关;miR-26b、miR-320b升高是GDM孕妇发生IR的保护因素,二者联合检测可有效预测GDM孕妇发生IR情况。

2型糖尿病合并桥本甲状腺炎患者血清微小RNA-22-5p和25羟维生素D水平变化及其预测价值研究

目的:探讨2型糖尿病(T2DM)合并桥本甲状腺炎(HT)患者血清微小RNA-22-5p(miR-22-5p)、25羟维生素D水平变化及其预测价值。方法:选取T2DM患者96例,根据是否合并HT分为T2DM组(50例)和T2DM+HT组(46例)。另选择同期体检健康者40例为对照组。比较三组一般资料、空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、甲功五项[游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺激素(TSH)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)、甲状腺球蛋白抗体(TGAb)]、血清炎症因子[高敏C反应蛋白(hs-CRP)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和IL-10]、25羟维生素D和miR-22-5p。采用Spearman法分析甲功五项、血清炎症因子与miR-22-5p及25羟维生素D的相关性。绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-22-5p、25羟维生素D对T2DM合并HT的预测价值。结果:三组一般资料比较差异无统计学意义(均P>0.05)。与对照组比较,T2DM组FBG、HbA1c、hs-CRP、TNF-α、IL-6和miR-22-5p升高,25羟维生素D降低(均P<0.05);T2DM+HT组FBG、HbA1c、FT3、FT4、TSH、TPOAb、TGAb、hs-CRP、TNF-α、IL-6和miR-22-5p升高,IL-10和25羟维生素D降低(均P<0.05)。T2DM组FT3、FT4、TSH、TPOAb、TGAb、hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-10与miR-22-5p、25羟维生素D无相关性(均P>0.05)。T2DM+HT组FT3、FT4、TSH、IL-10与miR-22-5p、25羟维生素D无相关性(均P>0.05),TPOAb、TGAb、hs-CRP、TNF-α、IL-6与25羟维生素D呈负相关(均P<0.05),与miR-22-5p呈正相关(均P<0.05)。25羟维生素D、miR-22-5p以及两者联合检测预测T2DM合并HT的曲线下面积(AUC)分别为0.774、0.842、0.915,联合检测的预测价值较高。结论:T2DM合并HT患者25羟维生素D水平降低,miR-22-5p表达升高,两者与TPOAb、TGAb、hs-CRP、TNF-α、IL-6具有相关性,对T2DM合并HT具有较好的预测价值。

微小RNA-144-3p靶向调控TPD52表达及对喉癌细胞凋亡和侵袭的影响

目的探讨微小RNA-144-3p(miR-144-3p)对喉癌细胞凋亡、侵袭的影响和肿瘤蛋白D52(TPD52)的靶向调控作用。方法采用荧光实时定量PCR(QPCR)法检测23对手术切除的喉癌组织和癌旁组织及人鼻咽永生化上皮细胞NP69和喉癌细胞株(Hep2、TU212和TU686)的miR-144-3p水平。选取miR-144-3p水平最低的喉癌细胞并向其转染miR-144-3p模拟物(过表达组)或阴性对照(对照组),转染48 h后采用QPCR检测两组的miR-144-3p和TPD52 m RNA水平,采用MTT法、流式细胞术和Transwell小室实验检测增殖率、凋亡率和穿膜细胞数;采用双荧光素酶报告实验评价miR-144-3p对TPD52的靶向调控作用。结果 QPCR检测结果显示,喉癌组织中miR-144-3p的水平为0. 241±0. 156,低于癌旁组织的1. 003±0. 229(P<0. 05);喉癌细胞Hep2、TU212和TU686的miR-144-3p水平依次为0. 123±0. 027、0. 356±0. 069和0. 541±0. 087,均低于NP69细胞(P<0. 05),选取表达水平最低的Hep2细胞用于后续实验。转染48 h,过表达组miR-144-3p的水平为3. 266±0. 820,高于对照组的1. 051±0. 144(P<0. 05)。过表达组转染24、48、72 h的细胞增殖率均低于对照组(P<0. 05)。转染48 h过表达组的细胞凋亡率为(16. 980±1. 983)%,高于对照组的(6. 732±0. 943)%,差异有统计学意义(P<0. 05)。过表达组的穿膜细胞数为(62. 7±8. 0)个,低于对照组的(87. 7±8. 9)个,差异有统计学意义(P<0. 05)。双荧光素酶活性检测结果显示,miR-144-3p可抑制野生型TPD52 3’UTR报告基因载体的荧光素酶活性,而对突变型TPD52 3’UTR的荧光素酶活性无影响。结论miR-144-3p在喉癌组织和喉癌细胞株中均低表达。miR-144-3p可能通过抑制TPD52表达来抑制喉癌细胞的增殖、侵袭并诱导凋亡。

微小RNA-320靶向FOXM1调控食管鳞癌放射敏感性的机制研究

目的探讨微小RNA-320(miR-320)对食管鳞癌(ESCC)放射敏感性的影响及可能机制。方法采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测正常食管上皮细胞株HEEC和ESCC细胞株KYSE-150、TE-13和Eca-109中miR-320和叉头框蛋白M1(FOXM1)的表达水平。采用脂质体法将miR-320模拟物(mimics)及其阴性对照(NC)转染至Eca-109细胞,分为转染组和对照组。QPCR和Western blotting检测miR-320 mimics转染后FOXM1的蛋白和mRNA水平以评价miR-320对FOXM1的调控作用。克隆形成实验评价克隆形成能力;免疫荧光实验检测γH2AX荧光焦点数;AnnexinⅤ-FITC/PI双染法测定细胞凋亡;Western blotting测定XIAP、Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3的表达水平;采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-320与FOXM1之间的靶向关系。结果 QPCR检测显示,Eca-109细胞中miR-320相对表达量最低,FOXM1相对表达量最高,故选取该细胞株进行后续实验。转染48 h后,转染组miR-320表达量显著高于对照组;QPCR和Western blotting检测发现转染组FOXM1 mRNA和蛋白水平均低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,转染组Eca-109细胞克隆形成能力显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);转染组照射处理后1、6、24 hγH2AX焦点数增加,差异有统计学意义(P<0.05)。转染组Eca-109细胞的凋亡率高于对照组(P<0.05)。与对照组比较,转染组Bax和cleaved caspase-3表达增加,XIAP和Bcl-2表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。在野生型FOXM1-3’UTR质粒转染细胞中,miR-320 mimics转染组Eca-109细胞的荧光素酶活性明显低于对照组(P<0.05);而在突变型质粒转染细胞中,两组细胞的荧光素酶活性的差异无统计学意义(P>0.05)。结论 miR-320能增强ESCC细胞放射敏感性,可能与靶向抑制FOXM1表达有关。

长链非编码RNA DLX6-AS1调控微小RNA-15b和磷脂酶D1影响口腔鳞状细胞癌侵袭转移的分子机制研究

目的:探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)生长停滞特异性蛋白6-反义RNA1(growth arrest specific protein 6-antisense RNA1,DLX6-AS1)对口腔鳞状细胞癌(口腔鳞癌)细胞增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制。方法:实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测口腔鳞癌组织及癌旁组织中DLX6-AS1、微小RNA-15b(microRNA-15b,miR-15b)和磷脂酶D1(phospholipase D1,PLD1)mRNA的表达水平。转染DLX6-AS1小干扰RNA至口腔鳞癌细胞HSC3,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)、Transwell小室和Western印迹法(Western blot)检测抑制DLX6-AS1表达对HSC3细胞的增殖、迁移和侵袭能力,以及对p21、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)和E-钙黏附素(E-cadherin)蛋白表达的影响。分别共转染miR-15b抑制剂或PLD1过表达载体与DLX6-AS1小干扰RNA至HSC3细胞,用上述相同方法观察抑制miR-15b或过表达PLD1对DLX6-AS1表达抑制的HSC3细胞增殖、迁移和侵袭能力,以及对p21、MMP-2和E-cadherin蛋白表达的影响。双荧光素酶报告基因实验验证DLX6-AS1与miR-15b及miR-15b与PLD1的调控关系。结果:与癌旁组织比较,口腔鳞癌组织中DLX6-AS1和PLD1 mRNA表达水平升高(P<0.001),miR-15b表达水平降低(P<0.001)。抑制DLX6-AS1表达可降低HSC3细胞存活率、迁移和侵袭,以及MMP-2的蛋白表达水平(P<0.001),提高p21和E-cadherin蛋白表达水平(P<0.001)。抑制miR-15b表达或过表达PLD1均可降低抑制DLX6-AS1表达对HSC3细胞的存活率、迁移和侵袭及P21、MMP-2和E-cadherin蛋白表达的影响。DLX6-AS1在HSC3细胞中靶向负调控miR-15b,miR-15b靶向负调控PLD1。结论:抑制DLX6-AS1表达可能通过靶向调控miR-15b和PLD1轴抑制口腔鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

miR-647、miR-122、KMT2D表达与前列腺癌临床病理特征及预后的相关性分析

目的探讨前列腺癌组织中微小RNA-647(miR-647)、微小RNA-122(miR-122)、组蛋白赖氨酸甲基转移酶2D(KMT2D)与其临床病理特征及预后的相关性。方法选取100例前列腺癌患者作为研究对象,均于术中采集肿瘤组织及癌旁正常组织标本送检,统计肿瘤组织及癌旁正常组织内miR-647、miR-122、KMT2D表达水平差异;分析miR-647、miR-122、KMT2D表达与肿瘤分期、肿瘤直径、淋巴结转移、微血管侵犯等的关系;并随访2年,比较复发转移与未复发转移患者miR-647、miR-122、KMT2D表达间差异。结果肿瘤组织内miR-647表达水平为(0.62±0.13),低于癌旁正常组织的(1.02±0.19),miR-122、KMT2D表达水平为(6.45±1.24)、(1.45±0.23),低于对照组的(1.23±0.22)、(0.89±0.12)(P<0.05);肿瘤分期Ⅲ期、肿瘤直径≥3 cm、有淋巴结转移及有微血管侵犯患者miR-647表达水平低于肿瘤分期Ⅰ~Ⅱ期、肿瘤直径<3 cm、无淋巴结转移及无微血管侵犯患者,miR-122、KMT2D表达水平高于肿瘤分期Ⅰ~Ⅱ期、肿瘤直径<3 cm、无淋巴结转移及无微血管侵犯患者(P<0.05);100例患者术后随访2年,共出现24例复发转移,复发转移率为24.00%(24/100);复发转移患者miR-647表达水平为(0.51±0.11),低于未复发转移患者的(0.73±0.15),miR-122、KMT2D表达水平为(8.42±1.39)、(1.89±0.32),高于未复发转移患者的(4.68±1.02)、(1.12±0.15)(P<0.05)。结论前列腺癌组织内miR-647、miR-122、KMT2D存在不同程度表达,均与肿瘤分期、肿瘤直径及淋巴结转移等关系密切,且可明显影响患者预后,还需临床高度重视。

长链非编码RNA LINC00662靶向微小RNA-103a-3p对黑色素瘤细胞增殖和周期的影响

目的探究长链非编码RNA LINC00662对黑色素瘤细胞增殖和周期的影响,以及分子机制。方法本研究于2018年10月至2020年2月进行。以体外培养的人皮肤黑色素瘤细胞A375为研究对象,然后将其分为四组,分别为si-NC、siLINC00662、si-LINC00662+anti-miR-NC和si-LINC00662+anti-miR-103a-3p转染A375细胞。采用RT-PCR检测皮肤黑色素瘤组织中LINC00662和miR-103a-3p的表达水平,CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,蛋白质印迹法(western blot‐ting)检测细胞周期蛋白1(CyclinD1)、增殖细胞核抗原(PCNA)的蛋白表达。结果与正常组织和正常皮肤细胞相比,在皮肤黑色素瘤组织和细胞株中LINC00662表达[1.24±0.50比4.17±1.27]上调,miR-103a-3p表达[1.17±0.32比0.64±0.21]显著下调。LINC00662与miR-103a-3p靶向结合。与si-NC组相比,si-LINC00662组LINC00662表达[1.00±0.06比0.48±0.06]、OD值和S期细胞比例[(34.7±3.5)%比(20.5±3.0)%]降低,G0/G1期细胞比例[(57.4±5.2)%比(74.7±4.8)%]增高,Cyclin D1[1.00±0.01比0.56±0.06]、PCNA蛋白表达[0.99±0.05比0.53±0.06]下降。抑制miR-103a-3p表达可以部分恢复沉默LINC00662对黑色素瘤的细胞增殖、周期的影响。结论长链非编码RNA LINC00662通过靶向负调控miR-103a-3p的表达,抑制皮肤黑色素瘤细胞的增殖,并诱导细胞周期阻滞。

蒲公英萜醇通过上调微小RNA-610表达抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移侵袭

目的探讨蒲公英萜醇对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及分子机制。方法2019年4月至2020年1月,将鼻咽癌细胞SUNE1分为对照组、蒲公英萜醇低、中、高浓度组、微小RNA(miR)-NC组、miR-610组、蒲公英萜醇+anti-miR-NC组、蒲公英萜醇+anti-miR-610组。MTT法检测SUNE1细胞增殖;蛋白质印迹法检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(p21)、细胞周期蛋白D1(cyclinD1)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表达;Transwell检测细胞迁移和侵袭;实时荧光定量PCR(RTqPCR)检测miR-610表达水平。结果不同浓度蒲公英萜醇处理鼻咽癌细胞SUNE1后,细胞增殖抑制率[(16.72±1.42)%、(31.95±2.95)%、(54.59±5.0)%比(0.00±0.00)%]和p21、miR-610(1.68±0.14、2.37±0.21、3.09±0.29比1.00±0.06)表达水平升高,迁移(70.02±5.72、56.49±5.35、43.37±4.19比86.71±7.05)、侵袭(50.70±4.41、39.12±3.89、26.28±2.78比69.12±4.80)细胞数和Cy⁃clinD1、MMP-2、MMP-9水平降低,呈浓度依赖性(P<0.05)。过表达miR-610可提高细胞增殖抑制率[(46.66±4.48)%比(7.11±0.74)%]和p21表达水平,降低迁移(52.18±5.35比87.40±6.86)、侵袭(33.11±3.29比70.27±5.39)细胞数和CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平(P<0.05)。抑制miR-610表达逆转了蒲公英萜醇抗鼻咽癌SUNE1细胞增殖、迁移和侵袭作用。结论蒲公英萜醇可抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭,其机制可能与上调miR-610表达相关。

血清miR-320a、MACC1对结肠癌术后复发转移的预测价值

目的探讨血清微小RNA-320a(miR-320a)、结肠癌转移关联基因1(MACC1)对结肠癌术后复发转移的预测价值。方法选取102例结肠癌患者为结肠癌组,63例结肠良性病变患者为对照组。qRT-PCR测定血清miR-320a表达,ELISA法测定血清MACC1,Pearson相关法分析结肠癌患者血清miR-320a表达与MACC1水平的相关性。术后随访3年,统计复发转移率,多因素Cox回归分析结肠癌术后复发转移的影响因素,受试者工作特征曲线分析血清miR-320a表达、MACC1水平对结肠癌术后复发转移的预测价值。结果与对照组比较,结肠癌组血清miR-320a表达低,MACC1水平高(P均<0.05)。结肠癌患者血清miR-320a表达与MACC1水平呈负相关(r=-0.672,P<0.05)。中位随访时间22个月,术后复发转移率为25.49%(26/102)。血管侵犯(HR=1.900,95%CI:1.442~2.285)、TNM分期Ⅲ期(HR=1.433,95%CI:1.237~1.725)、MACC1≥7.18 ng/mL(HR=2.022,95%CI:1.808~3.061)是结肠癌术后复发转移的独立危险因素,miR-320a≥0.91(HR=0.322,95%CI:0.126~0.575)是独立保护因素(P<0.05)。miR-320a+MACC1预测结肠癌术后复发转移的曲线下面积明显大于二者单独预测(P均<0.05),敏感度、特异度分别为84.62%、88.16%。结论结肠癌患者血清miR-320a表达降低,MACC1水平升高,二者联合检测可预测结肠癌术后复发转移。

lncRNA-SNHG5在重度子痫前期胎盘组织中的表达及其对滋养细胞增殖能力影响的机制

目的分析长链非编码RNA(lncRNA)小核仁RNA宿主基因5(SNHG5)在重度子痫前期(sPE)胎盘组织中的表达情况,及其对人正常滋养细胞HTR8增殖能力影响的机制。方法应用实时荧光定量PCR检测30例重度子痫前期孕妇(sPE组)与30例正常晚孕孕妇(正常组)胎盘组织中lncRNA-SNHG5的表达情况。取人正常滋养细胞HTR8分为过表达组、抑制组、对照组,分别转染过表达质粒(pcDNA3.1-lncRNA-SNHG5)、lncRNA-SNHG5抑制序列以及空质粒。检测转染24 h、48 h、72 h后各组细胞的增殖情况,以及转染24 h后各组lncRNA-SNHG5、微小RNA-155(miRNA-155)及其靶基因细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表达情况。结果sPE组胎盘组织中lncRNA-SNHG5的表达水平低于正常组(P<0.05)。抑制组、对照组、过表达组各时间点细胞增殖能力依次提高,lncRNA-SNHG5、cyclin D1 mRNA及蛋白表达水平均依次升高,miRNA-155表达水平依次降低(均P<0.05)。结论lncRNA-SNHG5与sPE密切相关,其可能通过调控miRNA-155/cyclin D1途径,影响滋养细胞增殖能力。

LncRNA PVT1 miR-30d表达与上皮性卵巢癌患者化疗敏感性及预后的关系

目的探讨LncRNA PVT1、miR-30d表达与上皮性卵巢癌患者化疗敏感性及预后的关系。方法选取2012年2月~2014年1月行手术治疗的76例上皮性卵巢癌患者的癌组织标本作为上皮性卵巢癌组,另选取本院收治的76例良性卵巢肿瘤作为对照组。检测LncRNA PVT1、miR-30d相对表达量,根据表达水平分为高表达组与低表达组;根据对顺铂(DDP)、阿霉素(ADM)、环磷酰胺(CTX)的敏感性将患者分为敏感组和耐药组并对比LncRNA PVT1、miR-30d表达情况;应用Pearson法对miR-30d和LncRNA PVT1表达的相关性进行分析;采用Kaplan-Meier对上皮性卵巢癌患者5年的生存情况进行分析。结果与对照组相比,上皮性卵巢癌组miR-30d表达水平降低(P<0.05),LncRNA PVT1表达水平升高(P<0.05)。miR-30d、LncRNA PVT1表达均与FIGO分期、分化程度密切相关(P<0.05)。DDP、ADM敏感组miR-30d表达水平显著高于耐药组(P<0.05),LncRNA PVT1表达水平显著低于耐药组(P<0.05)。Pearson相关性分析显示上皮性卵巢癌组织中miR-30d和LncRNA PVT1表达呈负相关(P<0.05)。Kaplan-Meier法分析显示miR-30d高表达组5年内总生存率及中位生存时间远高于低表达组(73.7%VS 33.3%,28.0月VS 20.0月,P<0.05);LncRNA PVT1低表达组5年内总生存率及中位生存时间远高于高表达组(81.5%VS 22.4%,27.0月VS 18.0月,P<0.05)。结论上皮性卵巢癌患者癌组织miR-30d低表达,LncRNA PVT1高表达,miR-30d、LncRNA PVT1表达与上皮性卵巢癌患者化疗敏感性及预后有关。