2型糖尿病患者血清微小RNA-33a表达及其与微血管并发症的关系探讨

目的探讨2型糖尿病(T2DM)血清微小RNA(miR)-33a表达及其与微血管并发症的关系。方法选取本院2019年5月~2022年2月收治的T2DM患者120例,根据糖化血红蛋白(HbA1c)水平将其分为低水平组(HbA1c≤7%)37例、中水平组(7%<HbA1c<9%)51例和高水平组(HbA1c≥9%)32例;根据是否合并微血管并发症将其分为并发症组(56例)和无并发症组(64例)。另选取109例同期健康体检者作为对照组。收集T2DM患者一般临床资料和实验室检查指标及所有受试者血清miR-33a水平并分组进行比较。采用多因素logistic回归分析探讨T2DM患者发生微血管并发症的影响因素;采用Pearson相关分析评估血清miR-33a表达水平与微血管并发症的相关性。结果高水平组、中水平组、低水平组和对照组受试者血清miR-33a表达水平均依次降低(P<0.05);120例T2DM患者中合并微血管并发症56例,发生率为46.67%;多因素logistic回归分析结果显示,校正因素前、后血清miR-33a高表达均是T2DM患者发生微血管并发症的独立危险因素(P<0.001);Pearson相关分析结果显示,血清miR-33a表达水平与微血管并发症的发生呈正相关(P<0.001)。结论血清miR-33a是T2DM患者发生微血管并发症的危险因素,且与微血管并发症的发生呈正相关。

微小RNA-33a对平滑肌细胞表型转化的调控机制研究

目的:微小RNA-33a(miR-33a)可调控动脉粥样硬化进展,对斑块内巨噬细胞及内皮细胞影响巨大,但对平滑肌细胞的作用尚不明确。本研究旨在探究miR-33a对平滑肌细胞表型转化的调控机制。方法:培养人主动脉平滑肌细胞(HASMC),给予不同浓度(10、20、50、80、100 ng/ml)血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)处理24 h、48 h,用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,根据以上结果确定最终用药浓度。测序筛选与HASMC表型转化相关的微小RNA(miRNA),挑选合适的miRNA并验证。实验分组:确定用药浓度后分对照组、PDGF-BB组(20 ng/ml PDGF-BB诱导HASMC);转染细胞48 h后又分为无义序列(NC)对照组、miRNA过表达组(miR-33a mimics)、沉默NC+诱导组(inhibitor NC+PDGF-BB诱导HASMC)、miRNA沉默+诱导组(miR-33a敲减inhibitor+PDGF-BB诱导HASMC)。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测平滑肌肌动蛋白α(ACTA2)、平滑肌22α(TAGLN)、骨桥蛋白(OPN)等,蛋白免疫印迹(Western blot)检测磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)等。采用瞬时转染技术过表达及沉默miR-33a,观察其对PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达及平滑肌细胞表型转化的影响。结果:用20 ng/ml PDGF-BB处理48 h时,MTT法结果显示,HASMC增殖较明显;细胞划痕实验结果显示,HASMC迁移较明显,因此选用20 ng/ml PDGF-BB处理48 h作为后续用药条件。测序及验证结果示,miR-33a可能与HASMC表型转化相关。RT-qPCR结果显示,PDGF-BB组与对照组相比,以及miRNA过表达组与NC对照组相比,ACTA2、TAGLN表达量均明显降低,OPN表达量均明显升高。Western blot结果显示,PDGF-BB组与对照组相比,以及miRNA过表达组与NC对照组相比,ACTA2、钙调蛋白1(CNN1)及肌球蛋白重链11(MYH11)表达量均明显降低,OPN表达量均明显升高,PI3K/Akt/mTOR通路均被激活,表达量明显升高;与PDGF-BB组和miRNA过表达组相比,miRNA沉默+诱导组中ACTA2、CNN1及MYH11表达量明显升高,OPN表达量明显降低,PI3K/Akt/mTOR通路被抑制,表达量下降。结论:miR-33a介导PI3K/Akt/mTOR通路促进平滑肌细胞表型转化,加速动脉粥样硬化的发生和发展。

妊娠期糖尿病患者血清LncRNA DANCR和miR-33a-5p水平表达对妊娠结局预测价值研究

目的 探讨妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)患者血清长链非编码核糖核酸分化拮抗非蛋白编码RNA (long noncoding RNA differentiation antagonizing nonprotein coding RNA,LncRNA DANCR)、微小RNA-33a-5p (miR-33a-5p)水平表达对妊娠结局的预测价值。方法 选取2021年8月~2023年2月于衡水市第四人民医院产检和分娩的154例GDM患者为GDM组,并根据妊娠结局分为良好结局组(n=115)和不良结局组(n=39);同期收集24周葡萄糖耐量试验正常的149例健康孕产妇作为对照组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血清LncRNA DANCR和miR-33a-5p水平;采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析血清LncRNA DANCR和miR-33a-5p预测GDM患者不良妊娠结局的价值;采用Pearson相关性分析GDM不良妊娠结局患者血清LncRNA DANCR,miR-33a-5p与空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、稳态模式评估法计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)的相关性;Logistic回归分析GDM患者不良妊娠结局的影响因素。结果 GDM组血清LncRNA DANCR水平(0.69±0.15)显著低于对照组(1.01±0.22),miR-33a-5p (1.59±0.40)及不良妊娠结局总发生率(25.34%)显著高于对照组(1.02±0.23,5.36%),差异具有统计学意义(t/χ^(2)=14.835,15.140,23.011,均P<0.05)。不良妊娠结局组血清LncRNADANCR水平(0.50±0.14)显著低于良好结局组(0.75±0.18),miR-33a-5p (2.00±0.58),FBG (8.97±0.66mmol/L),FINS (18.63±1.31pmol/ml)和HOMAIR (7.42±0.98)显著高于良好结局组(1.45±0.26,8.01±0.59mmol/L,14.32±1.29pmol/ml,5.10±0.86),差异具有统计学意义(t=7.895~17.961,均P<0.05)。LncRNA DANCR,miR-33a-5p单独及二者联合预测GDM患者不良妊娠结局的曲线下面积(area under curve,AUC)分别为0.820,0.819和0.897。GDM不良妊娠结局患者血清LncRNA DANCR与FBG,FINS,HOMA-IR呈负相关(r=-0.498,-0.513,-0.509,均P<0.05),miR-33a-5p与FBG,FINS,HOMA-IR呈正相关(r=0.517,0.494,0.507,均P<0.05)。LncRNA DANCR是影响GDM患者不良妊娠结局的保护因素(OR=0.804,95%CI:0.693~0.933,P=0.004),miR-33a-5p是影响GDM患者不良妊娠结局的危险因素(OR=2.747,95%CI:1.444~5.225,P=0.002)。结论 GDM不良妊娠结局患者LncRNADANCR降低,miR-33a-5p升高,二者均是不良妊娠结局的影响因素。

利拉鲁肽通过microRNA-33对2型糖尿病小鼠肝损伤的治疗作用

目的:观察利拉鲁肽对2型糖尿病小鼠肝组织微小RNA-33(microRNA-33,miR-33)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)及肝细胞凋亡通路相关蛋白的影响,探讨其可能作用机制,为临床应用提供药效学依据。方法:采用高脂饮食联合链脲佐菌素(STZ)腹腔注射复制C57BL/6小鼠2型糖尿病模型。小鼠随机分为4组,每组15只:对照组为正常小鼠皮下注射等量的生理盐水;模型组为T2DM小鼠皮下注射等量的生理盐水;利拉鲁肽低剂量组为了2DM小鼠皮下注射100μg·kg^(-1)·d^(-1)利拉鲁肽;利拉鲁肽高剂量组为T2DM小鼠皮下注射200μg·kg^(-1)·d^(-1)利拉鲁肽。给药4周后进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT),检测各组小鼠空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天冬氨酸氨基转移酶(AST)的含量;HE染色检测肝组织病理学变化;免疫荧光检测肝组织的cleaved caspase-3;Western blot法检测p-AMPK/AMPK及凋亡相关蛋白Bcl-2、caspase-3的水平;实时定量PCR检测肝组织miR-33的水平。结果:与模型组相比,利拉鲁肽高、低剂量组小鼠FBG、TG、TC、LDL-C、ALT及AST含量明显降低,HDL-C含量明显升高(P<0.05);肝组织病理结构的紊乱得到明显改善;免疫荧光结果可见,利拉鲁肽高、低剂量给药组小鼠的cleaved caspase-3明显降低;Western blot实验结果可见,利拉鲁肽高、低剂量给药组小鼠肝组织的Bcl-2表达明显增高,caspase-3表达显著下降(P<0.05)肝组织AMPK磷酸化水平显著增加(P<0.01);且肝组织miR-33水平显著降低(P<0.01),且呈一定的剂量依赖性。结论:利拉鲁肽可以缓解2型糖尿病小鼠肝损伤,其机制可能与降低肝组织miR-33表达,从而增加AMPK磷酸化水平,进而抑制肝细胞凋亡有关。

食管癌病人血清中miR-33a-5p和SIRT6表达及其与临床病理特征的关系

目的探讨食管癌病人血清微小RNA-33a-5p(miR-33a-5p)、沉默信号调节蛋白6(Sirtuin6,SIRT6)表达水平及其与临床病理特征、预后的关系。方法2018年3月~2020年3月期间收治的食管癌初诊病人123例(食管癌组),食管炎病人94例(良性病变组),同期体检健康者72例(对照组);收集食管癌病人临床病理资料。采用实时荧光定量PCR法检测三组血清中miR-33a-5p、SIRT6 mRNA的表达情况,分析食管癌病人血清miR-33a-5p、SIRT6 mRNA表达水平与临床病理特征的关系;TargetScanHuman网站预测miR-33a-5p与SIRT6的靶向关系;Pearson法分析食管癌病人血清miR-33a-5p与SIRT6 mRNA表达水平相关性;采用Kaplan-Meier法分析食管癌病人血清miR-33a-5p、SIRT6 mRNA表达水平与病人预后的关系;Cox回归分析食管癌病人预后的影响因素。结果食管癌组血清miR-33a-5p表达水平高于良性病变组、对照组,差异有统计学意义(P<0.05),血清SIRT6 mRNA表达水平低于良性病变组、对照组,差异有统计学意义(P<0.05);TargetScanHuman网站预测miR-33a-5p与SIRT6存在靶向结合位点,食管癌病人血清miR-33a-5p与SIRT6 mRNA表达水平呈负相关关系(r=-0.468,P<0.05);食管癌病人血清miR-33a-5p、SIRT6 mRNA表达水平与TNM分期、淋巴结转移、分化程度有关;血清miR-33a-5p低表达与SIRT6 mRNA高表达食管癌病人3年生存率明显高于miR-33a-5p高表达与SIRT6 mRNA低表达食管癌病人,差异有统计学意义(P<0.05);Cox回归分析结果显示,miR-33a-5p高表达及SIRT6 mRNA低表达是食管癌病人死亡的独立危险因素(P<0.05)。结论食管癌病人血清miR-33a-5p表达水平升高,SIRT6 mRNA表达水平降低;二者表达水平与食管癌病人临床病理特征和病人预后相关。

miRNA-33对Hcy干预RAW264.7巨噬细胞衍生的泡沫细胞表达ABCA1/ABCG1的影响

目的:研究同型半胱氨酸(Hcy)是否通过微小RNA-33 (miRNA-33)抑制三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)和三磷酸腺苷结合盒转运体G1(ABCG1)的表达,从而降低胆固醇逆转运(RCT)效率。方法:复制RAW264.7巨噬细胞经氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导为泡沫细胞的模型,油红O染色确定模型是否复制成功,用LipofectamineTM2000将miRNA-33 mimics和miRNA-33 inhibitor分别转染入细胞内,再给予5 mmol/L的Hcy干预24 h后进行实验;用油红O染色观察细胞内脂滴情况;real-time PCR和Western blot检测ABCA1和ABCG1的mRNA和蛋白表达水平;液体闪烁计数法检测细胞内胆固醇流出率;高效液相色谱分析细胞内胆固醇含量。结果:(1)与空白对照组相比,miRNA-33 mimics组细胞内脂滴含量增加,ABCA1和ABCG1的mRNA和蛋白表达量降低(P <0.05),细胞内胆固醇含量逐渐增加(P <0.05),细胞内胆固醇流出率逐渐减少(P <0.05);(2)与空白对照组相比,miRNA-33 inhibitor组检测结果与miRNA-33 mimics组的结果相反,差异具有统计学意义(P <0.05);(3)空白对照组、miRNA-33 mimics-NC组和miRNA-33 inhibitor-NC组3组间相比,所有检测结果的差异均无统计学显著性。结论:Hcy可间接通过诱导miRNA-33表达而抑制ABCA1和ABCG1的蛋白表达,降低RCT效率。

2型糖尿病合并稳定型心绞痛患者中医证型特点及与血清miR-33a、炎性标志物和预后的关系

目的:探究2型糖尿病合并稳定型心绞痛(T2DM-SAP)患者中医证型特点及与血清微小RNA-33a(miR-33a)、炎性标志物和预后的关系。方法:纳入2021年11月~2022年11月期间本院收治的T2DM-SAP患者119例,依据临床症状、脉搏等对T2DM-SAP患者进行中医辨证,回顾性收集不同证型患者相关临床资料。比较不同证型T2DM-SAP患者的血清miR-33a表达、炎性标志物[降钙素原(PCT)、同型半胱氨酸(Hcy)及血清超敏C反应蛋白(hs-CRP)]水平及预后情况[中重度心血管不良事件(全因死亡,心肌梗死再入院或脑卒中复发)、轻度(短暂性脑缺血发作与心绞痛再入院)]。结果:119例T2DM-SAP患者临床主要有4种证型分布,包括气虚血瘀证38例(31.93%)、痰瘀互结证34例(28.57%)、气阴两虚证25例(21.01%)、阴阳两虚证22例(18.49%);4种证型患者的血清miR-33a表达、PCT、Hcy以及hs-CRP水平比较,气虚血瘀证、痰瘀互结证均高于其他2种证型(P<0.05),且痰瘀互结证高于气虚血瘀证(P<0.05);预后情况比较,痰瘀互结证心血管不良事件总发生率均高于其他3种证型(P<0.05),而气阴两虚证、气虚血瘀证、阴阳两虚证之间比较无统计学差异(P>0.05)。结论:T2DM-SAP患者临床常见中医证型包括气虚血瘀证、痰瘀互结证、气阴两虚证以及阴阳两虚证,且不同证型患者之间的预后情况、血清miR-33a表达及炎性标志物水平存在差异。

miR-33a在急性心肌梗死患者血清中表达及意义

目的探讨微小RNA-33a(miR-33a)在急性心肌梗死(AMI)患者血清中检测的意义。方法以AMI患者202例为研究组,健康体检者180例为对照组。按心电图将研究组分为两组:ST段抬高型AMI患者为STEMI组,非ST段抬高型AMI患者为NSTEMI组。应用实时荧光定量-聚合酶链反应(qTR-PCR)检测血清miR-33a水平;同时检测两组血清肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白(Tn)T、血脂和炎性因子水平。结果研究组吸烟史、阳性家族史比例明显高于对照组,STEMI组吸烟史比例明显高于NSTEMI组(P<0.01);研究组血清miR-33a水平明显高于对照组,STEMI组miR-33a水平明显高于NSTEMI组(P<0.05);研究组血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血糖(GLU)水平明显高于对照组,而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平明显低于对照组(P<0.001);STEMI组血清中LDL-C水平明显高于NSTEMI组,TG水平明显低于NSTEMI组(P<0.05)。研究组CK、CK-MB、TnT、血清炎性因子C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)水平明显高于对照组;STEMI组血清中CK、CK-MB、TnT、CRP、PCT水平明显高于NSTEMI组(P<0.001)。研究组血清miR-33a与LDL-C呈正相关,与HDL-C呈负相关(P<0.05)。研究组血清miR-33a与CK、CK-MB、TnT、CRP、PCT呈正相关(r=0.6181,0.6168,0.5169,0.5402,0.6366,P<0.05)。结论miR-33a在AMI患者血清中存在表达增高,与一些血脂及炎性因子指标有相关,miR-33a可能通过调控这些指标在AMI的病情进展中发挥作用。

黄芪甲苷通过调控miR-33a及ABCA1信号发挥抗动脉粥样硬化作用

目的:观察黄芪甲苷是否通过调控微小RNA-33a(miR-33a)而影响下游信号三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的表达,促进巨噬细胞内胆固醇流出,从而研究黄芪甲苷抗动脉粥样硬化的作用机制。方法:体内实验:采用HE染色检测各组小鼠主动脉横截面病理损伤程度real-time PCR和Western blot分别检测小鼠主动脉ABCA1的mRNA和蛋白表达。体外实验:建立THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞,然后用黄芪甲苷含药SD大鼠血清处理,采用real-time PCR检测细胞miR-33a表达;细胞随机分为空白血清组、黄芪甲苷含药血清组及黄芪甲苷含药血清+miR-33a mimic处理组,real-time PCR和Western blot法检测细胞ABCA1的mRNA和蛋白表达,油红O染色和高效液相色谱法检测细胞内脂质含量,[3H]法检测细胞内胆固醇流出。结果:体内实验显示,黄芪甲苷组小鼠血管各层结构正常,排列整齐,局部有小灶性的钙化颗粒物沉积,病变轻,斑块小,泡沫细胞和脂质减少,弹力板基本完整,病变程度明显轻于模型组。与模型组相比,黄芪甲苷组小鼠主动脉的miR-33a表达量降低,ABCA1 mRNA和蛋白相对表达量均升高(P <0. 05)。体外实验显示,在不影响THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞活性的情况下,黄芪甲苷含药血清能明显上调ABCA1的mRNA和蛋白表达,但能被转染miR-33 mimic抑制;黄芪甲苷含药血清可减少细胞中的脂质蓄积,但能被细胞中转染miR-33 mimic所弱化;黄芪甲苷减少细胞内胆固醇蓄积与其促进细胞内胆固醇流出有关,细胞中转入过量miR-33a可以抑制胆固醇流出。结论:黄芪甲苷可通过减少miR-33a的生成,进而上调ABCA1表达,促进巨噬细胞中胆固醇流出,这可能是黄芪甲苷抗动脉粥样硬化作用的分子机制之一。

急性冠脉综合征患者大颗粒HDL结合miR-33介导HDL趋炎化转变

目的:探讨急性冠脉综合征(ACS)患者高密度脂蛋白(HDL)结合miR-33水平是否影响HDL功能。方法:纳入48例ACS患者为ACS组,52例健康体检者为对照组。分离和纯化HDL大中小颗粒亚组分后,实时荧光定量PCR法检测各亚组分及血浆miR-33表达。体外实验分组如下:阴性对照组、rHDL组、HDL大颗粒(L-HDL)组、HDL中颗粒组、HDL小颗粒组和L-HDL+anti-miR33组。3H标记胆固醇完成细胞内胆固醇流出实验,Luminex 200试剂盒检测炎症因子在THP-1泡沫细胞中的表达。结果:miR-33在ACS患者血浆及HDL各亚组分中均明显增加,特别是L-HDL。ACS患者HDL各亚组分的细胞胆固醇流出能力及抗炎能力明显受损。抑制miR-33和HDL的结合后,L-HDL的胆固醇流出能力及抗炎能力均有所恢复。结论:ACS急性炎症状态下,L-HDL结合miR-33水平上调,介导HDL抗动脉粥样硬化功能受损。

IDI2-AS1通过微小RNA-33b-5p调控NR4A2影响急性心肌梗死的发展

目的探究长链非编码RNA(lncRNA)IDI2-AS1/微小RNA-33b-5p(miR-33b-5p)/核受体相关蛋白NR4A2竞争性内源RNA(ceRNA)调控网络对急性心肌梗死(AMI)的影响及相关性,验证IDI2-AS1通过miR-33b-5p调控NR4A2影响心肌梗死的发生发展。方法通过基因表达数据库(GEO)获取心肌梗死相关的miRNA及mRNA表达芯片,并进行差异表达分析;通过TargetScan数据库对NR4A2的上游调控机制进行预测。按随机数字表法将32只C57/BL6雄性小鼠分为假手术(Sham)组、AMI模型组、miR-33b-5p mimic组(结扎过程中心脏组织局部注射miR-33b-5p mimic慢病毒5×10^(7) TU)和miR-33b-5p inhibitor组(结扎过程中心脏组织局部注射miR-33b-5p inhibitor慢病毒5×10^(7) TU),每组8只。超声心动图观察各组小鼠心脏左室舒张期末内径(LVEDD)和左室收缩期末内径(LVESD),计算左室短轴缩短率(LVFS)和左室射血分数(LVEF)。末次称重后麻醉处死小鼠并取心脏组织,光镜下观察心脏组织Masson染色情况,计算心肌胶原容积分数(CVF)和心肌梗死面积。收集SPF级SD大鼠乳鼠心肌细胞,分为正常对照组(Control组)、缺血缺氧模型组、miR-33b-5p mimic转染组(缺血缺氧处理前转染miR-33b-5p mimic)和miR-33b-5p inhibitor转染组(缺血缺氧处理前转染miR-33b-5p inhibitor),测定心肌细胞天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3/7(caspase-3/7)活性。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素(IL-1β、IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;采用比色法检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)水平;采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2、细胞色素C(Cyt C)及IDI2-AS1/miR-33b-5p/NR4A2调控轴基因表达。结果心肌梗死芯片分析显示,NR4A2在心肌梗死中表达显著上调,上游调控机制预测表明其可能通过IDI2-AS1/miR-33b-5p/NR4A2调控轴影响心肌梗死的发生发展。超声心动图检测显示,与AMI模型组和miR-33b-5p inhibitor组比较,miR-33b-5p mimic组小鼠心脏LVEF、LVFS均显著升高,LVEDD、LVESD及CK、CK-MB、LDH水平均显著降低,差异均有统计学意义。光镜下显示,AMI模型组及miR-33b-5p inhibitor组小鼠出现心肌纤维化和心肌梗死;而miR-33b-5p mimic组小鼠心肌纤维化程度降低,心肌梗死面积显著缩小。与AMI模型组和miR-33b-5p inhibitor组比较,miR-33b-5p mimic组小鼠心脏组织MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平及Bax、Cyt C表达均显著降低,SOD水平及Bcl-2表达均显著升高,差异均有统计学意义;miR-33b-5p mimic组小鼠心脏组织IDI2-AS1、NR4A2表达均较AMI模型组和miR-33b-5p inhibitor组显著降低〔IDI2-AS1(2^(-ΔΔCt)):1.96±0.08比2.73±0.08、3.10±0.05,NR4A2(2^(-ΔΔCt)):2.36±0.07比3.16±0.08、3.80±0.08,均P<0.01〕,miR-33b-5p表达较AMI模型组和miR-33b-5p inhibitor组显著升高(2^(-ΔΔCt):0.88±0.07比0.57±0.07、0.23±0.01,均P<0.01)。细胞实验结果显示,miR-33b-5p mimic转染组大鼠乳鼠心肌细胞的caspase-3/7活性较缺血缺氧模型组和miR-33b-5p inhibitor转染组显著降低,提示miR-33b-5p可显著降低缺血缺氧细胞模型的细胞凋亡水平;各组大鼠乳鼠心肌细胞过氧化、炎症指标水平及心肌细胞凋亡通路重要基因和IDI2-AS1/miR-33b-5p/NR4A2调控轴表达变化趋势与上述情况一致。结论IDI2-AS1可以通过miR-33b-5p调控NR4A2进而影响AMI的发生发展。

miR-33b靶向上游转录因子1基因调控喉癌细胞的作用机制

目的微小RNA-33b(miR-33b)是否可通过靶向调控上游转录因子1(USF1)而参与喉癌发生发展过程尚未明确。文中旨在探讨miR-33b靶向USF1对喉癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响及机制。方法选取2016年5月至2018年6月华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院43例喉癌患者的喉癌组织标本及癌旁组织标本。采用qRT-PCR与Western blot检测喉癌组织及喉癌TR-LCC-1细胞中miR-33b、USF1的表达。分别将miR-33b mimics及miR-con、si-USF1及si-con转染至TR-LCC-1细胞,分为正常组(常规培养的TR-LCC-1细胞)、miR-con组(miR-con转染至TR-LCC-1细胞)、miR-33b组(miR-33b mimics转染至TR-LCC-1细胞)、si-con组(si-con转染至TR-LCC-1细胞)、si-USF1组(si-USF1转染至TR-LCC-1细胞)、miR-33b+pcDNA组(miR-33b mimics与pcDNA共转染至TR-LCC-1细胞)、miR-33b+pcDNA-USF1组(miR-33b mimics与pcDNA-USF1共转染至TR-LCC-1细胞)。MTT法检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡率;Transwell小室实验检测细胞迁移及侵袭能力;双荧光素酶报告实验验证miR-33b的靶基因并通过Western blot检测靶基因USF1蛋白表达;Western blot检测Ki-67、MMP-2、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3蛋白表达。结果与癌旁组织(1.00±0.32)比较,喉癌组织中miR-33b的表达水平(0.52±0.23)显著降低(P<0.05),USF1 mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与miR-con组比较,miR-33b组TR-LCC-1细胞的细胞存活率、迁移细胞数与侵袭细胞数、Ki-67、MMP-2蛋白、Bcl-2蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),TR-LCC-1细胞的细胞凋亡率、TR-LCC-1细胞中miR-33b、Bax、Cleaved caspase-3蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05)。与si-con组比较,si-USF1组喉癌TR-LCC-1细胞中USF1蛋白相对表达量、TR-LCC-1细胞的细胞存活率、迁移细胞数与侵袭细胞数、Ki-67、MMP-2、Bcl-2蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),细胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)。与miR-33b+pcDNA组比较,miR-33b+pcDNA-USF1组喉癌TR-LCC-1细胞中USF1蛋白相对表达量、细胞存活率、迁移细胞数与侵袭细胞数、Ki-67、MMP-2、Bcl-2蛋白相对表达量显著升高(P<0.05),细胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3蛋白相对表达量均显著降低(P<0.05)。结论miR-33b靶向调控USF1抑制喉癌细胞增殖、迁移及侵袭,诱导细胞凋亡,为阐明喉癌的发病机制奠定实验基础。

miR-33b靶向Myc对T细胞活化的调控及其在扩张型心肌病中的作用

目的:探讨微小RNA-33b(miR-33b)靶向Myc对T细胞活化的调控及其在扩张型心肌病(DCM)中的作用。方法:以45例DCM患者为DCM组,另选同期30例健康志愿者为正常组。采用qRT-PCR与Western blot分别检测两组受试者CD4+T细胞中miR-33b及Myc表达;Pearson法分析DCM患者CD4+T细胞中miR-33b与Myc表达的相关性。双荧光素酶报告基因检测miR-33b与Myc的靶向关系。体外培养Jurkat T细胞,将miR-33b mimic及抑制剂转染至Jurkat T细胞,将Myc siRNA及其阴性对照转染至Jurkat T细胞。采用流式细胞术检测细胞表面活化标记物CD25和CD69表达;ELISA检测IL-2水平;MTT法检测细胞增殖。结果:DCM组患者CD4+细胞中miR-33b表达水平显著低于正常组(t=10.528,P<0.0001),Myc mRNA及蛋白表达均显著升高(t=11.238,P<0.0001);Pearson分析显示miR-33b与Myc呈负相关(F=14.091,P<0.05);与miR-con组比较,miR-33b组Jurkat T细胞miR-33b表达显著上调;与anti-miR-con组比较,anti-miR-33b组Jurkat T细胞miR-33b表达显著下调;miR-33b组Jurkat T细胞CD25、CD69 MFI值显著下降,细胞培养上清液中IL-2水平下降,细胞活性降低,而anti-miR-33b组CD25、CD69 MFI值、IL-2水平及细胞活性均明显升高(FCD25=32.532,FCD69=75.971,FIL-2=38.084,P<0.0001);荧光素酶报告基因实验验证miR-33b可靶向调控Myc表达;与si-con组比较,si-Myc组CD25、CD69 MFI值、IL-2水平及细胞活性均显著降低。结论:miR-33b通过靶向调控Myc进而调节DCM患者CD4+T细胞活化及增殖,其表达水平降低可能是DCM患者免疫异常活化的重要机制。

血浆微小RNA-122和33a与2型糖尿病合并冠心病患者冠状动脉病变程度的相关性分析

目的探讨血浆微小RNA(miR)-122和miR-33a与2型糖尿病合并冠心病患者冠状动脉病变程度的相关性。方法回顾性分析2019年1月至2021年10月徐州市第一人民医院196例2型糖尿病患者的临床资料。其中,合并冠心病81例(合并组),未合并冠心病115例(对照组)。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测血浆miR-122、miR-33a水平,采用酶联免疫吸附法检测血浆N末端B型利钠肽前体(NT-proBNP)水平。合并组患者根据冠状动脉造影结果确定冠状动脉病变支数,并进行Gensini积分评价。采用线性回归模型分析血浆miR-122、miR-33a和NT-proBNP与2型糖尿病患者发生冠心病的关系。绘制受试者工作特征(ROC)曲线,分析血浆miR-122和miR-33a预测2型糖尿病患者发生冠心病的效能。合并组采用Spearman相关法分析血浆miR-122和miR-33a与冠状动脉病变支数的关系,采用Pearson相关法分析血浆miR-122和miR-33a与血浆NT-proBNP和Gensini积分的关系。结果合并组血浆miR-122、miR-33a和NT-proBNP明显高于对照组[5.76±1.35比1.18±0.33、1.39±0.37比0.65±0.11和(786.87±156.39)ng/L比(103.45±19.27)ng/L],差异有统计学意义(P<0.01)。线性回归分析结果显示,2型糖尿病患者血浆miR-122、miR-33a和NT-proBNP与冠心病发生呈正相关(P<0.01);ROC曲线分析结果显示,血浆miR-122、miR-33a单独和联合预测2型糖尿病患者发生冠心病的曲线下面积为0.816、0.845和0.912(95%CI 0.744~0.865、0.768~0.892和0.836~0.967)。冠状动脉造影结果显示,单支病变46例,2支病变25例,3支病变10例。3支病变患者血浆miR-122、miR-33a、NT-proBNP及Gensini积分明显高于2支病变患者和单支病变患者[6.52±0.96比4.95±0.85和3.74±0.52、1.45±0.31比1.06±0.25和0.81±0.13、(829.78±62.59)ng/L比(627.48±47.12)和(502.64±38.24)ng/L、(63.89±12.71)分比(42.18±6.03)和(22.36±2.41)分],2支病变患者明显高于单支病变患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。Spearman相关分析结果显示,合并组血浆miR-122和miR-33a与冠状动脉病变支数呈正相关(r=0.879和0.825,P<0.05);Pearson相关分析结果显示,合并组血浆miR-122和miR-33a与血浆NT-proBNP和Gensini积分呈正相关(miR-122:r=0.896和0.788,miR-33a:r=0.871和0.765;P<0.05)。结论血浆miR-122、miR-33a水平与2型糖尿病患者冠心病发生及冠状动脉病变程度均相关,可用于指导2型糖尿病患者冠心病的防治。

微小RNA-33对小鼠肝再生的影响及其作用机制

目的探讨微小RNA(miRNA,miR)-33对小鼠肝再生的促进作用及其分子机制。方法2018年9月到2019年12月,将40只C57/B6小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)按照数字随机分组法分为模型组和miR-33 KD组。模型组小鼠经尾静脉注射对照腺相关病毒1×1011 vg/ml,miR-33 KD组小鼠经尾静脉注射miR-33敲降的腺相关病毒1×1011 vg/ml。在注射20 d后,模型组和miR-33 KD组采用70%肝切除方法建立小鼠肝再生模型。分别在肝切术后4 d计算肝重/体重比,采用溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)免疫组织化学染色分析肝脏细胞分裂能力;采用生物信息学分析miR-33的靶基因,采用蛋白质印迹法(Western blot)分析细胞增殖指标细胞核增殖抗原(Ki-67)和靶蛋白在两组肝组织中的表达。组间比较采用t检验。结果模型组和miR-33 KD组小鼠术后4 d肝脏/体重比分别为(4.10±0.61)%和(4.98±0.72)%。与模型组比较,miR-33 KD组术后4 d肝脏/体重比显著增加,差异有统计学意义(t=2.019,P<0.05)。与模型组肝脏细胞BrdU阳性率(32.47±7.99)%比较,miR-33 KD组小鼠肝脏细胞BrdU阳性率(75.38±10.56)%显著增加,差异有统计学意义(t=4.391,P<0.05)。与模型组肝脏细胞Ki-67蛋白表达水平(0.43±0.11)比较,miR-33 KD组小鼠肝脏细胞Ki-67蛋白表达水平(1.37±0.31)显著增加,差异有统计学意义(t=3.281,P<0.05)。生物信息学显示细胞周期素依赖性激酶(CDK6)是miR-33的靶基因。与模型组CDK6蛋白表达水平(0.25±0.15)比较,miR-33 KD组CDK6蛋白表达水平(1.02±0.28)显著增加,差异有统计学意义(t=3.108,P<0.05)。结论miR-33通过靶向作用于CDK63’端非编码区(3’UTR)区域,调控CDK6蛋白表达水平,进而影响细胞周期,调节正常肝脏细胞增殖。

长链非编码RNA GHRLOS2在结直肠癌中的表达及作用机制

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)GHRLOS2在结直肠癌组织和细胞中的表达及作用机制。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测结直肠癌组织或细胞中GHRLOS2、微小RNA-33b-5p(miR-33b-5p)表达水平。构建过表达GHRLOS2的结直肠癌细胞系HCT116、SW480,通过划痕实验、Transwell实验检测过表达GHRLOS2对HCT116、SW480细胞迁移和侵袭能力的影响;使用葡萄糖检测试剂盒检测过表达GHRLOS2细胞及对照细胞内的葡萄糖含量;采用蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞中PCK1蛋白表达水平;基于生物信息学方法预测miR-33b-5p与PCK1的靶向结合关系。结果qRT-PCR检测结果显示,结直肠癌组织样本中的GHRLOS2表达水平低于癌旁组织,结直肠癌细胞中的GHRLOS2表达水平低于正常结肠上皮细胞,差异有统计学意义(P<0.05);GHRLOS2表达与Grade分级、Stage分期、淋巴结转移均相关(P<0.05)。结直肠癌组织的miR-33b-5p表达水平高于对应癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.001)。划痕实验、Transwell实验、葡萄糖含量检测结果显示,过表达GHRLOS2可显著抑制结直肠癌细胞的侵袭、迁移和葡萄糖代谢。过表达GHRLOS2可抑制miR-33b-5p表达水平;GHRLOS2是miR-33b-5p的分子海绵,PCK1是miR-33b-5p的靶标;过表达GHRLOS2可竞争性结合miR-33b-5p,促进PCK1表达增加。结论GHRLOS2在结直肠癌组织和细胞中表达下调,其可能通过miR-33b-5p/PCK1途径调节结直肠癌细胞的侵袭、迁移及葡萄糖代谢能力,GHRLOS2有望成为结直肠癌靶向治疗的潜在生物靶点。

miR-33a在稳定型心绞痛患者血清中的表达及意义

目的探讨微小RNA-33a(miR-33a)在稳定型心绞痛患者血清中水平及检测价值。方法选取2018年1月至2019年12月确诊的稳定型心绞痛患者220例(心绞痛组),选取同期健康体检者200例(对照组)。心绞痛组按疾病严重程度分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级。应用实时定量PCR法检测两组血清miR-33a表达水平;同时检测两组血清的血脂和炎性因子水平。采用GEO数据库检索数据,对miR-33a的功能进行生物信息学分析。结果心绞痛组血清miR-33a水平明显高于对照组(P<0.05)。不同分级的心绞痛患者血清miR-33a水平差异有统计学意义(P<0.05)。心绞痛组血脂指标中血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白水平高于对照组,而高密度脂蛋白水平则低于对照组(P<0.05)。心绞痛组血清炎性因子指标中肿瘤坏死因子(TNF-α)、高敏C-反应蛋白(hsCRP)、白细胞介素-6(IL-6)的水平高于对照组。心绞痛组血清miR-33a与低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白均呈正相关,与高密度脂蛋白呈负相关(P<0.05)。心绞痛组血清miR-33a水平与TNF-α、IL-6呈正相关(P<0.05)。生物信息学分析显示,miR-33a具有调控一些转录组基因的功能,参与核酸代谢、信号传导、细胞生长、氨基酸转运等过程。结论miR-33a在稳定型心绞痛患者血清中存在表达增高现象,与一些血脂及炎性因子指标有相关性,miR-33a可能通过较为复杂的分子网络机制调控各项指标在稳定型心绞痛的病情进展中发挥作用。

血清LncRNA XIST与miR-33a在膀胱癌中的表达及临床意义

目的:探究血清长链非编码RNA X染色体失活特异转录本(Lnc RNA XIST)与微小RNA-33a(mi R-33a)在膀胱癌中的表达及临床意义。方法:选择2017年4月至2019年8月青岛大学附属医院诊治的95例膀胱癌患者作为膀胱癌组,选择同期体检的95例健康者作为健康组。采用荧光定量PCR检测两组的血清LncRNA XIST与mi R-33a表达水平,分析患者的临床病理参数与血清LncRNA XIST、mi R-33a表达水平的关系,采用受试者工作特征曲线(ROC)分析血清LncRNA XIST与mi R-33a对膀胱癌的预测价值。结果:与健康组相比,膀胱癌组的血清LncRNA XIST表达水平明显升高(P<0.05),而血清mi R-33a表达水平明显下降(P<0.05)。血清LncRNA XIST与mi R-33a表达均与膀胱癌患者的TNM分期和淋巴结转移情况相关(P<0.05)。血清LncRNA XIST联合mi R-33a(AUC=0.830,敏感性=90.47%,特异性=89.85%)预测膀胱癌的临床价值明显高于血清LncRNA XIST(AUC=0.716,敏感性=81.36%,特异性=80.74%)及血清mi R-33a(AUC=0.736,敏感性=82.19%,特异性=81.09%)单独检测。结论:血清LncRNA XIST表达异常升高、血清mi R-33a表达降低与膀胱癌发生密切相关,联合检测有助于预测膀胱癌发生的风险,从而为临床制定针对性干预和治疗方案提供参考。

非小细胞肺癌患者癌组织中SDC3和miR-33a-5p表达水平及其临床诊断价值

目的分析非小细胞肺癌(NSCLC)组织中多配体蛋白聚糖3(SDC3)、微小RNA-33a-5p(miR-33a-5p)表达水平,并探讨其对NSCLC的临床诊断价值。方法2015年1月-2016年11月于咸阳市第一人民医院收集80例NSCLC患者术中切除的NSCLC组织和癌旁组织。采用实时荧光定量PCR法检测所有组织miR-33a-5p表达水平。免疫组化法检测组织SDC3表达。分析miR-33a-5p、SDC3与NSCLC患者临床病理特征的关系。采用Spearman法分析miR-33a-5p与SDC3的相关性。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-33a-5p、SDC3对NSCLC的诊断价值。Kaplan-Meier法分析miR-33a-5p、SDC3表达与NSCLC患者预后的关系;多因素Cox回归分析影响NSCLC预后的因素。结果与癌旁组织比较,NSCLC组织中miR-33a-5p相对表达水平[(1.04±0.21)vs.(0.41±0.11)]较低,SDC3阳性表达率(17.50%vs.67.50%)较高,差异均有统计学意义(t=23.769,χ^(2)=40.921,P均<0.05)。miR-33a-5p、SDC3均与淋巴结转移、TNM分期相关(P均<0.05)。Spearman法分析显示,NSCLC组织中miR-33a-5p与SDC3表达水平成负相关(r=-0.587,P<0.001)。ROC曲线显示,miR-33a-5p联合SDC3诊断NSCLC的曲线下面积(AUC)为0.853,其敏感度、特异性分别为78.80%、83.70%。Kaplan-Meier法分析显示,miR-33a-5p低表达患者中位生存时间为(31.69±2.46)月,显著短于miR-33a-5p高表达患者(46.59±2.04)月,差异有统计学意义(χ^(2)=12.224,P<0.001);SDC3阴性表达患者中位生存时间为(51.96±1.52)月,显著长于SDC3阳性表达患者(32.92±2.09)月,差异有统计学意义(χ^(2)=15.964,P<0.001)。多因素分析表明,miR-33a-5p低表达、SDC3阳性表达是NSCLC患者不良预后的独立危险因素(P均<0.05)。结论在NSCLC组织中miR-33a-5p表达下调,SDC3表达上调,二者对NSCLC具有诊断价值,是NSCLC患者不良预后的危险因素。