血清微小RNA-34a、沉默信息调节因子2相关酶1水平与老年脑梗死病人颈动脉粥样硬化斑块稳定性的关系研究

目的探讨血清微小RNA-34a(miR-34a)、沉默信息调节因子2相关酶1(Sirt1)水平与老年脑梗死病人颈动脉粥样硬化(CAS)斑块稳定性的关系。方法选取2017年6月至2019年6月邯郸明仁医院收治的老年脑梗死病人170例作为脑梗死组,同期该院体检健康者150例作为对照组。均接受颈动脉超声检查,根据检查结果将脑梗死组病人分为无斑块组、稳定斑块组、不稳定斑块组。使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血清miR-34a水平,使用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清Sirt1水平,使用AU5800全自动生化分析仪检测三酰甘油、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),并采用多因素logistic回归分析影响老年脑梗死病人CAS不稳定斑块形成的危险因素。结果脑梗死组病人血清miR-34a(1.88±0.53)水平明显高于对照组(1.01±0.29)(P<0.05),血清Sirt1水平(0.92±0.26)μg/L明显低于对照组(2.08±0.57)μg/L(P<0.05)。不稳定斑块组病人年龄明显大于无斑块组(P<0.05);不稳定斑块组、稳定斑块组病人总胆固醇、LDL-C明显高于无斑块组(P<0.05),不稳定斑块组病人总胆固醇、LDL-C明显高于稳定斑块组(P<0.05)。脑梗死组病人不同CAS斑块性质血清miR-34a水平高低依次为:不稳定斑块组、稳定斑块组、无斑块组,血清Sirt1水平高低依次为:无斑块组、稳定斑块组、不稳定斑块组,两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。年龄、miR-34a为老年脑梗死病人CAS不稳定斑块形成的独立危险因素(P<0.05),Sirt1为保护性因素(P<0.05)。结论血清miR-34a水平升高、Sirt1水平降低可能与老年脑梗死发生及CAS不稳定斑块形成有关。

微小RNA-29a通过沉默信息调节因子2相关酶类1基因调控肝细胞脂肪变性的机制

目的探讨人肝细胞株L02脂肪变性时微小RNA-29a(miR-29a)的表达变化及其靶向沉默信息调节因子2相关酶类1(silent mating type information regulation 2 homolog-1,Sirt1)调节脂肪肝细胞脂肪沉积的机制。方法采用油酸和棕榈酸混合物诱导建立非酒精性脂肪肝细胞模型,验证模型成功后,PCR检测miR-29a和Sirt1的表达变化;生物学预测miR-29a的靶基因;分别转染miR-29a模拟物和抑制剂,过表达miR-29a和抑制miR-29a后再建立人脂肪肝细胞模型。油红O染色观察细胞中脂质蓄积情况并测定甘油三酯含量,荧光定量PCR和免疫印迹法检测Sirt1基因和蛋白表达变化。结果脂肪肝细胞模型组miR-29a相对表达量和甘油三酯含量显著高于对照组(P<0.01),Sirt1相对表达量显著低于对照组(P<0.01);生物学预测Sirt1是miR-29a的靶基因,过表达miR-29a后,细胞内脂滴明显增多,脂肪沉积加重,甘油三酯含量显著增加(P<0.05),细胞中miR-29a的表达显著上调(P<0.01),而Sirt1 mRNA表达显著下调(P<0.05),Sirt1蛋白表达呈下降趋势;与之相反,抑制miR-29a后,细胞中脂滴相对减少,脂肪沉积减轻,甘油三酯含量显著下降(P<0.05),细胞中miR-29a的表达被有效抑制(P<0.01),而Sirt1 mRNA的表达显著上调(P<0.05),Sirt1蛋白表达较对照组呈上升趋势。结论 miR-29a在非酒精性脂肪肝细胞中表达显著上调,miR-29a通过表达上调负调控Sirt1表达从而促进脂肪肝细胞中脂肪沉积。

大黄素对肺炎链球菌肺炎大鼠氧化应激损伤及miR-34a/SIRT1轴的影响

目的探究大黄素对肺炎链球菌肺炎大鼠氧化应激损伤及微小RNA-34a/沉默信息调节因子2相关酶1(miR-34a/SIRT1)轴的影响。方法60只雄性SD大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组、低剂量(20 mg/kg)、中剂量(40 mg/kg)和高剂量(80 mg/kg)大黄素组,每组12只。采用气管滴加肺炎链球菌法制备肺炎模型,建模成功后24 h,大黄素干预组分别腹腔注射大黄素溶液,每天1次,连续7 d。HE染色观察肺组织病理变化,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测肺组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平,可见分光光度法检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平,qPCR检测肺组织miR-34a、SIRT1 mRNA水平,Western blot检测肺组织SIRT1蛋白表达。结果假手术组大鼠肺组织正常,无明显病理改变;模型组大鼠肺泡塌陷,有大量炎性细胞浸润;低、中、高剂量大黄素组肺组织炎性病变均减轻。与假手术组比较,模型组肺组织TNF-α、IL-6、MDA、miR-34a水平显著增加(P<0.05),肺组织SOD、GSH-Px、SIRT1 mRNA及蛋白水平显著降低(P<0.05)。与模型组比较,中、高剂量大黄素组大鼠肺组织TNF-α、IL-6、MDA、miR-34a水平显著降低(P<0.05),肺组织SOD、GSH-Px及SIRT1 mRNA及蛋白水平显著增加(P<0.05),其中高剂量大黄素组变化最明显。结论大黄素可减轻肺炎链球菌肺炎大鼠炎症反应及氧化应激损伤,可能与调控miR-34a/SIRT1轴有关。

MicroRNA-34a靶向SIRT1参与阿霉素诱导的心肌细胞凋亡

目的:研究微小RNA-34a(microRNA-34a,miR-34a)在阿霉素诱导的心肌细胞凋亡中的作用及其作用靶基因。方法:建立阿霉素(doxorubicin,Dox)诱导的大鼠H9c2心肌细胞凋亡模型;TUNEL染色观察H9c2细胞凋亡;双萤光素酶报告实验检测miR-34a与潜在靶基因沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)3'端非翻译区(3'-untranslated region,3'UTR)的结合作用;实时荧光定量PCR检测miR-34a和SIRT1 mRNA表达水平,Western blot检测SIRT1和凋亡相关蛋白表达水平。结果:阿霉素处理H9c2细胞之后,细胞发生凋亡,miR-34a的表达显著增强;双萤光素酶报告实验提示miR-34a与SIRT1 3'UTR可相互作用,并证实miR-34a可在转录后水平抑制SIRT1的表达,SIRT1蛋白水平在阿霉素处理的心肌细胞中显著下调;过表达miR-34a及沉默SIRT1均能一致性抑制Bcl-2表达,促进Bax和p66shc的表达,而过表达SIRT1能有效抑制阿霉素诱导的H9c2细胞凋亡。结论:SIRT1是miR-34a的靶基因,并介导了miR-34a在阿霉素诱导的心肌细胞凋亡中的作用。

长链非编码RNA牛磺酸上调基因1靶向miR-34a-5p/沉默信息调节因子2相关酶1对糖尿病肾脏疾病氧化应激损伤调控作用的研究

目的探讨长链非编码RNA牛磺酸上调基因1(lncRNA TUG1)靶向miR-34a-5p/沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)对DKD氧化应激损伤的调控作用。方法采用体外实验,将小鼠肾小球系膜细胞分为正常对照组(Con)、高糖组(HG)、过表达空白对照组(pcDNA-NC)、过表达TUG1组(pcDNA-TUG1)、沉默空白对照组(si-NC)、沉默TUG1组(si-TUG1),沉默SIRT1组(si-SIRT1)、模拟物空白对照组(mimics NC)、miR-34a-5p模拟物组(miR-34a-5p mimics)、抑制空白对照组(inhibitor NC)、miR-34a-5p抑制组(miR-34a-5p inhibitor)、过表达TUG1联合miR-34a-5p模拟物组(pcDNA-TUG1+miR-34a-5p mimics)、过表达TUG1联合沉默SIRT1组(pcDNA-TUG1+si-SIRT1);体内实验将小鼠分为假手术组(S)、模型组(DKD)、慢病毒载体(LV)空白对照组(LV-NC)、LV-TUG1组、LV-TUG1+miR-34a-5p组和LV-TUG1+LV-si-SIRT1组。采用qRT-PCR检测TUG1、miR-34a-5p、SIRT1 mRNA水平,ELISA法检测丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)含量,HE染色观察肾组织病理学改变。结果与Con组比较,HG组TUG1表达水平降低(P<0.01)。与S组比较,DKD组TUG1表达水平降低(P<0.01)。过表达TUG1后,肾组织和肾小球系膜细胞ROS、MDA表达水平降低(P<0.01),SOD表达水平升高(P<0.01)。沉默SIRT1或过表达miR-34a-5p均可逆转过表达TUG1对氧化应激损伤的抑制作用。结论TUG1靶向miR-34a-5p/SIRT1调控DKD氧化应激损伤。

甘草甜素对喉癌Hep-2细胞侵袭和迁移的影响及机制研究

目的:探究甘草甜素(Gly)对喉癌Hep-2细胞侵袭和迁移的影响及作用机制。方法:体外培养正常人喉黏膜上皮细胞和喉癌Hep-2细胞,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和蛋白印迹实验检测微小RNA-205-5p(miR-205-5p)、沉默信息调节因子2相关酶3(SIRT3)mRNA和蛋白表达水平。将喉癌Hep-2细胞分为对照组、Gly低浓度组、Gly中浓度组、Gly高浓度组、Gly高浓度+空载质粒组、Gly高浓度+miR-205-5p抑制剂组。各组给予相应浓度的Gly干预或转染对应质粒培养48 h。Transwell实验和划痕实验分别检测各组Hep-2细胞侵袭和迁移能力。RT-qPCR法和蛋白印迹实验检测各组Hep-2细胞miR-205-5p、SIRT3 mRNA和蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验分析miR-205-5p与SIRT3的靶向关系。结果:与人喉黏膜上皮细胞比较,喉癌Hep-2细胞miR-205-5p水平降低,SIRT3 mRNA和蛋白水平升高(均P<0.05)。与对照组比较,Gly低、中、高浓度组穿膜细胞数和划痕愈合率、SIRT3 mRNA和蛋白水平依次降低,miR-205-5p水平依次升高(均P<0.05)。与Gly高浓度组和Gly高浓度+空载质粒组比较,Gly高浓度+miR-205-5p抑制剂组穿膜细胞数和划痕愈合率、SIRT3 mRNA和蛋白水平升高,miR-205-5p水平降低(均P<0.05)。miR-205-5p可靶向调控SIRT3表达。结论:Gly能够抑制Hep-2细胞侵袭和迁移,其机制可能与上调miR-205-5p表达,进而靶向下调SIRT3表达有关。

miR-21 SIRT1在早发性卵巢功能不全中的表达及相关性分析

目的分析微小核糖核酸-21(miR-21)、沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)在早发性卵巢功能不全中的表达及相关性。方法选取60例2019年8月—2020年9月早发性卵巢功能不全患者于天津医科大学第二医院进行就诊作为研究组,同时期进行健康体检的正常女性60例作为正常组,实时定量PCR检测miR-21表达,SIRT1表达采用蛋白免疫印迹法,化学发光法检测性激素表达,超声检查子宫体积、卵巢体积、内膜厚度变化情况。受试者特征曲线(ROC)分析miR-21、SIRT1在早发性卵巢功能不全中诊断价值。结果研究组miR-21、SIRT1、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E_(2))、子宫体积、卵巢体积及内膜厚度分别为(0.61±0.17)、(0.59±0.13)、(42.59±9.39)U/L、(32.98±10.03)U/L、(109.59±31.26)pmol/L、(24.98±7.36)cm^(3)、(3.02±1.23)cm^(3)、(4.12±1.36)mm,正常组miR-21、SIRT1、FSH、LH、E_(2)、子宫体积、卵巢体积及内膜厚度分别为(1.03±0.30)、(1.12±0.36)、(7.59±2.81)U/L、(6.14±2.01)U/L、(269.59±80.69)pmol/L、(43.12±12.59)cm^(3)、(7.26±2.36)cm^(3)、(5.83±1.59)mm,研究组miR-21、SIRT1、E_(2)表达以及子宫体积、卵巢体积、内膜厚度低于正常组,FSH、LH表达高于正常组,差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-21与FSH、LH呈负相关(r=-0.431,P<0.01;r=-0.421,P<0.01),与E_(2)、子宫体积、卵巢体积、内膜厚度呈正相关(r=0.551,P<0.01;r=0.542,P<0.01;r=0.544,P<0.01;r=0.498,P<0.01)。SIRT1与FSH、LH呈负相关,与E_(2)、子宫体积、卵巢体积、内膜厚度呈正相关(P<0.05)。ROC分析miR-21、SIRT1诊断早发性卵巢功能不全的曲线下面积(AUC)低于两项联合,两项联合检测对早发性卵巢功能不全患者诊断效能较高(P<0.05)。结论miR-21、SIRT1在早发性卵巢功能不全中低表达,二者具有相关性,低表达miR-21、SIRT1是预测早发性卵巢功能不全发病的重要指标。

脑缺血后大鼠室管膜下区miR-34a及其相关靶基因Sirt1、Nrf2的动态表达及意义

目的观察大鼠脑缺血后室管膜下区微小RNA 34a(miR-34a)及其相关靶基因沉默信息调节因子2相关酶1(Sirt1)、核因子E2相关因子2(Nrf2)的表达变化,探讨miR-34a对脑缺血后内源性神经干细胞增殖的影响。方法40只SD大鼠按随机数字表法分为对照组、脑缺血1 d组、脑缺血3 d组、脑缺血7 d组,每组10只。后3组采用线栓法制备成大脑中动脉栓塞局灶性脑缺血模型,并分别于造模1、3、7 d后取室管膜下区进行实验。采用免疫荧光染色检测各组大鼠神经干细胞标志物巢蛋白(nestin)的表达,采用荧光定量PCR检测miR-34a、Sirt1、Nrf2 mRNA的表达水平,采用Western blotting检测Sirt1、Nrf2蛋白的表达水平。结果(1)脑缺血1 d组、脑缺血3 d组、脑缺血7 d组nestin阳性细胞计数逐渐增加[(2.013±0.526、4.821±1.154、6.394±1.027)个/视野],差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)脑缺血1 d组、脑缺血3 d组、脑缺血7 d组miR-34a mRNA的表达水平逐渐增高(0.295±0.145、0.701±0.075、1.136±0.018),Sirt1 mRNA的表达水平逐渐下降(0.835±0.024、0.620±0.153、0.278±0.110),Nrf2 mRNA的表达水平逐渐下降(1.032±0.256、0.833±0.187、0.630±0.123),Sirt1蛋白的表达水平逐渐下降(0.832±0.018、0.731±0.156、0.454±0.132),Nrf2蛋白的表达水平逐渐下降(1.003±0.133、0.813±0.111、0.671±0.071),差异均有统计学意义(P<0.05)。(3)相关性分析显示,脑缺血后nestin阳性细胞计数与miR-34a mRNA的表达水平呈正相关关系(r=0.887,P=0.003),与Sirt1 mRNA和蛋白的表达水平呈负相关关系(r=-0.746,P=0.005;r=-0.521,P=0.013),与Nrf2 mRNA和蛋白的表达水平呈负相关关系(r=-0.344,P=0.025;r=-0.863,P=0.000)。结论MiR-34a有可能通过Sirt1/Nrf2途径调控脑缺血后内源性神经干细胞的增殖。

miR-9-5p通过抑制SIRT1调控骨关节炎发病进程中软骨细胞的凋亡

为研究miR-9-5p靶向沉默信息调节因子2相关酶1(silent information regulator factor 2-related enzyme 1, SIRT1)对骨关节炎(osteoarthritis, OA)软骨细胞凋亡的影响及相关机制,对小鼠的原代软骨细胞进行分离、培养并构建OA细胞模型(加入IL-1β)和OA小鼠模型,检测miR-9-5p的表达、Caspase-3活性、细胞活性及凋亡。确定miR-9-5p和SIRT1存在靶向关系后检测SIRT1活性和上述指标。用番红O-固绿对OA小鼠组织进行染色并分析,在OA小鼠模型中再次验证miR-9-5p通过抑制SIRT1对软骨细胞凋亡的影响。结果显示,miR-9-5p mRNA在OA组织及IL-1β处理的软骨细胞中表达显著升高(P<0.001), miR-9-5p可抑制OA软骨细胞活性(P<0.001)并促进其凋亡(P<0.01)。miR-9-5p靶向作用于SIRT1,并通过抑制SIRT1抑制OA软骨细胞活性(P<0.001),促进其凋亡(P<0.05)。在OA动物模型的验证中得到相同的结果。该研究提示,miR-9-5p可通过靶向SIRT1抑制OA软骨细胞活性,促进OA软骨细胞凋亡,参与OA的发生和发展。

miR-217和SIRT1在老年白内障晶状体上皮细胞中的表达水平及意义

目的探讨微小RNA-217(miR-217)与沉默信息调节因子相关酶1(SIRT1)在老年白内障晶状体上皮细胞(LECs)中的表达关系及意义。方法选取2017年12月至2018年3月沧州市中心医院医疗集团收治的65例老年性白内障患者作为研究组,并根据不同类型将其分为皮质性组(30例)、核性组(22例)、后囊下组(13例),另选取同期于本院进行角膜移植术的其他眼部疾病(无白内障)患者38例为对照组。采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测LECs中miR-217与SIRT1 mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(WB)检测SIRT1蛋白表达情况;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化脂质(LPO)水平;采用ABTS比色法检测总抗氧化能力(TAC)。采用Pearson法进行相关性分析。结果与对照组相比,研究组miR-217表达水平较高,而SIRT1 mRNA及蛋白表达水平较低,差异有统计学意义(P<0.05)。研究组血清SOD、TAC水平均显著低于对照组,而MDA、LPO水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。与皮质性组相比,核性组与后囊下组miR-217表达水平均显著升高,而SIRT1 mRNA及蛋白表达水平均显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。Pearson结果显示,miR-217与SIRT1呈负相关,与MDA、LPO呈正相关,而与SOD、TAC呈负相关(P<0.05);SIRT1与SOD、TAC呈正相关(P<0.05),而与MDA、LPO呈负相关(P<0.05)。结论miR-217在老年白内障患者LECs中异常高表达,而SIRT1呈低表达,二者呈负相关且均可能通过参与老年白内障氧化应激反应过程进而促进疾病发生及发展。

肌肉减少症患者血清AMPK-αmRNA、SIRT1、GDF-8的水平及其临床意义

目的研究肌少症患者血清腺苷酸活化蛋白激酶-α微小RNA(AMPK-αmRNA)、血清沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)及血清生长分化因子-8(GDF-8)的水平。方法选择2019年1月—2020年6月杭州市第三人民医院收治的老年患者81例,根据四肢肌肉质量指数、握力及步行速度将患者分为肌肉减少症组(41例)和非肌肉减少症组(40例),检测血清AMPK-αmRNA、SIRT1及GDF-8等。采用Pearson、Spearman相关性分析相关性;采用ROC曲线分析GDF-8的诊断价值。结果肌少症组与非肌少症组患者各项指标[AMPK-αmRNA:0.26(0.24,0.29)vs.0.29(0.27,0.32);SIRT1(ng/L):582.68±35.92 vs.646.50±39.08;GDF-8(μg/L):20.97±5.10 vs.14.76±1.59]比较差异均有统计学意义(均P<0.001)。SIRT1、AMPK-αmRNA与GDF-8呈负相关(P<0.001,P=0.001)。握力与AMPK-αmRNA及SIRT1呈正相关(P=0.028,P<0.001);握力与GDF-8呈负相关(P=0.001)。GDF-8诊断肌少症的临界值是17.25μg/L,AUC值为0.884(P=0.040)。结论肌少症患者AMPK-αmRNA及SIRT1降低,GDF-8增高,GDF-8可作为肌少症诊断的辅助参考指标。

miR-30a-5p靶向SIRT1调控骨关节炎软骨细胞增殖和凋亡的研究

为研究miR-30a-5p对骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨细胞增殖和凋亡的影响并探讨其机制,运用实时荧光RT-PCR检测人原代OA软骨细胞及正常软骨细胞中miR-30a-5p、沉默信息调节因子2相关酶Ⅰ(silent information regulator 1, SIRT1)的表达。研究分为正常对照组(正常软骨细胞)、OA+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、OA+anti-miR-30a-5p组(转染anti-miR-30a-5p)、OA+pcDNA组(转染pcDNA)、OA+pcDNA-SIRT1组(转染pcDNA-SIRT1)、OA+anti-miR-30a-5p+si-NC组(anti-miR-30a-5p和si-NC共转染)、OA+anti-miR-30a-5p+si-SIRT1组(anti-miR-30a-5p和si-SIRT1共转染),用脂质体法进行细胞转染,Western blotting检测各组细胞中SIRT1的表达,MTT试验检测细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞的凋亡情况,双荧光素酶报告基因检测试验检测细胞的荧光活性。结果显示,与正常软骨细胞比较,OA软骨细胞中miR-30a-5p表达显著升高(P<0.05),SIRT1表达显著降低(P<0.05);抑制miR-30a-5p、过表达SIRT1均可促进OA软骨细胞增殖,抑制其凋亡。miR-30a-5p靶向SIRT1。敲减SIRT1表达可逆转抑制miR-30a-5p对OA软骨细胞的增殖促进和凋亡抑制作用。提示miR-30a-5p可促进OA软骨细胞增殖,抑制其凋亡,其机制可能与靶向SIRT1有关,这可为OA的靶向治疗提供依据。