成骨细胞来源的外泌体介导微小RNA-494影响骨质疏松症大鼠骨代谢与骨重建平衡

目的探讨成骨细胞来源的外泌体(Exo)中微小RNA(miR)-494对骨质疏松症(OP)大鼠骨代谢与骨重建平衡的影响及其机制。方法从MC3T3-E1成骨细胞系中分离鉴定Exo,并将miR-494电转至Exo,Real-time PCR测定miR-494表达水平。40只SD大鼠随机分为对照组、模型组、miR-494模拟剂(miR-494)组和miR-494抑制剂组,每组10只。除对照组外,其余3组大鼠切除卵巢构建OP模型。模型制作成功后,miR-494组与miR-494抑制剂组分别接受含相应miRNA的Exo尾静脉注射,剂量为3×10^(9)个微粒。4周后,Micro-CT检测各组大鼠的骨参数,ELISA测定血清骨标志物,HE染色观察骨组织病理变化,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)染色检测破骨细胞数量,Western blotting测定骨重建相关蛋白及Toll样受体4(TLR4)相关通路蛋白表达水平。结果成功从MC3T3-E1细胞中分离得到典型杯状或圆形,直径约100 nm的Exo,其含有CD63、CD9、肿瘤易感性基因101(TSG101)、热休克蛋白70(HSP70)蛋白,且能被MC3T3-E1细胞摄取。经电转处理后,miR-494模拟剂和miR-494抑制剂的Exo中miR-494的相对表达量明显升高和降低(P<0.05)。与模型组相比,miR-494组大鼠骨参数降低,血清骨标志物骨钙蛋白(BGP)、TRACP、Ⅰ型胶原C端肽(CTX-Ⅰ)升高,骨保护蛋白(OPG)、Ⅰ型前胶原N端肽(PⅠNP)降低,骨小梁结构紊乱,破骨细胞增加,骨组织内骨形态发生蛋白2(BMP-2)、Runt相关转录因子2(RUNX2)下调,核因子κB受体激活剂配体(RANKL)上调,TLR4、核因子κB(NF-κB)p65及髓样分化主要响应蛋白88(MyD88)上调(P<0.05)。而miR-494抑制剂组情况则相反,骨参数和OPG、PⅠNP升高,BGP、TRACP、CTX-Ⅰ降低,骨结构恢复正常,破骨细胞减少,骨组织内BMP-2、RUNX2上调,RANKL下调,TLR4、NF-κB p65及MyD88下调(均P<0.05)。结论Exo传递miR-494可加重OP大鼠骨代谢异常,并抑制骨重建平衡,推测其作用机制可能与调控TLR4通路有关。

血清外泌体miR-494水平与妊娠期胎儿生长受限的关系

目的探讨血清外泌体微小RNA-494(miR-494)水平与妊娠期胎儿生长受限(FGR)的关系。方法收集妊娠期妇女182例,RT-PCR法检测血清外泌体miR-494。对研究对象追踪至分娩结束,以是否发生FGR将研究对象分为FGR者及非FGR者。比较发生与未发生FGR孕妇的临床资料,采用多因素Logistic回归分析妊娠期发生FGR的影响因素及其交互作用。结果182例孕妇中22例发生FGR、160例未发生FGR,FGR发生率为12.09%。发生FGR孕妇BMI、第27周血清外泌体miR-494水平、孕期增重过度比例、贫血比例、脐血流异常比例、羊水过少比例、脐带扭转比例、胎盘灌注不良比例、瘢痕子宫比例、不良孕产史比例及合并甲亢、甲减、免疫血栓相关疾病、肝内胆汁淤积症比例均高于未发生FGR孕妇,血细胞比容、血红素水平低于未发生FGR孕妇(P均<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示,第27周高血清外泌体miR-494、脐带扭转、不良孕产史、孕期增重过度、胎盘灌注不良是妊娠期发生FGR的独立危险因素(P均<0.05);第27周高血清外泌体miR-494与脐带扭转、不良孕产史、孕期增重过度及胎盘灌注不良均对妊娠期发生FGR具有相加交互作用(P均<0.05)。结论血清外泌体miR-494在发生FGR的孕妇中水平升高,是FGR发生的独立危险因素;在FGR发生中,高血清外泌体miR-494与脐带扭转、不良孕产史、孕期增重过度、胎盘灌注不良等危险因素存在相加交互作用。

环状RNA circ-TNRC6A靶向miR-494-3p抑制膀胱癌细胞增殖和迁移

目的探讨环状RNA circ-TNRC6A在膀胱癌组织中的表达水平及其调控膀胱癌细胞增殖和迁移的作用机制。方法采用癌症基因组图谱数据库分析circ-TNRC6A在膀胱癌组织中的表达水平及其与膀胱癌患者临床分期的关系。实时荧光定量PCR(qPCR)分析circ-TNRC6A在人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1和膀胱癌细胞系(MGH-U3、5637、RT-4、T24、J82)中的表达水平。在膀胱癌5637细胞中分别转染circ-TNRC6A质粒(circ-TNRC6A组)和对照质粒(NC组),细胞克隆形成实验和细胞划痕实验分别检测circ-TNRC6A对膀胱癌细胞增殖和迁移的影响。生物信息学技术预测并采用荧光素酶报告基因实验证实circ-TNRC6A和微小RNA(miR)-494-3p的靶向关系。qPCR检测circ-TNRC6A对miR-494-3p表达的影响。蛋白质印迹法检测circ-TNRC6A对Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路关键蛋白表达的影响。结果与癌旁组织比较,circ-TNRC6A在膀胱癌组织中低表达(P<0.01)。circ-TNRC6A表达水平与膀胱癌患者临床分期有关(P<0.05)。与SV-HUC-1细胞比较,circ-TNRC6A在膀胱癌细胞系中低表达(均P<0.05),5637细胞中circ-TNRC6A表达水平最低(P<0.01)。与NC组比较,过表达circ-TNRC6A可抑制5637细胞的增殖(P<0.01),并降低细胞的迁移能力(P<0.01)。circ-TNRC6A能够靶向结合miR-494-3p(P<0.01)。与NC组比较,过表达circ-TNRC6A组降低miR-494-3p表达水平(P<0.01),并抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活(P<0.01)。结论circ-TNRC6A靶向下调miR-494-3p抑制膀胱癌细胞的增殖和迁移,circ-TNRC6A可能成为膀胱癌新的治疗靶点。

膀胱癌患者尿液外泌体中miR-494-3p,LncRNA MAGI2-AS3表达水平及临床价值研究

目的探讨膀胱癌患者尿液外泌体中微小核糖核酸(microRNA,miR)-494-3p,长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA)MAGI2-反义RNA 3(MAGI2-antisense RNA 3,MAGI2-AS3)表达水平及临床应用价值。方法选取重庆两江新区第一人民医院2021年7月~2023年6月收治的105例膀胱癌患者为癌变组,另选取同期膀胱良性疾病患者101例作为良性组。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测尿液外泌体miR-494-3p和LncRNA MAGI2-AS3水平。Kappa检验分析尿液外泌体miR-494-3p和LncRNA MAGI2-AS3与病理活检诊断膀胱癌的一致性;受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析尿液外泌体miR-494-3p和LncRNA MAGI2-AS3水平对膀胱癌的诊断价值。结果癌变组尿液外泌体miR-494-3p水平(1.41±0.32)高于良性组(1.02±0.24),LncRNA MAGI2-AS3水平(0.79±0.19)低于良性组(1.05±0.22),差异具有统计学意义(t=9.866,9.089,均P<0.05)。miR-494-3p高表达组肿瘤直径>3 cm,T3~T4期以及淋巴结转移的占比显著高于miR-494-3p低表达组,差异具有统计学意义(χ^(2)=5.806,6.999,8.289,均P<0.05)。LncRNA MAGI2-AS3低表达组T3~T4期及发生淋巴结转移的比例明显高于LncRNA MAGI2-AS3高表达组,差异具有统计学意义(χ^(2)=9.244,7.795,均P<0.05)。尿液外泌体miR-494-3p和LncRNA MAGI2-AS3联合与病理活检诊断膀胱癌的一致性较高(Kappa值=0.718,P<0.05)。ROC曲线显示,尿液外泌体miR-494-3p和LncRNA MAGI2-AS3水平单独诊断膀胱癌的AUC(95%CI)分别为0.812(0.752~0.863)和0.779(0.716~0.833),尿液外泌体miR-494-3p和LncRNA MAGI2-AS3水平联合诊断膀胱癌的AUC(95%CI)[0.877,(0.824~0.918)]显著高于两者分别单独诊断(Z=2.053,2.647,P=0.040,0.008)。结论膀胱癌患者尿液外泌体中miR-494-3p水平升高,LncRNA MAGI2-AS3水平下降,二者联合对膀胱癌的诊断价值较高。

miR-494-3p在胃癌患者血清外泌体中的表达及价值

目的探究微小RNA-494-3p(miR-494-3p)在胃癌患者血清外泌体中的表达水平及临床意义。方法采用TaqMan探针法RT-qPCR检测44例胃癌患者和44例健康人对照组血清外泌体中miR-494-3p的表达水平,采用ROC曲线分析并评估其对胃癌的鉴别诊断价值。同时,在14例胃癌组织和16例胃良性疾病对照患者胃组织中进行进一步验证。结果与健康人对照组(1.00±0.36)相比,胃癌组血清外泌体中miR-494-3p的相对表达水平(0.21±0.03)显著降低,差异有统计学意义(Z=3.64,P<0.01);胃癌组织中miR-494-3p的相对表达水平(0.22±0.07)亦显著低于胃良性疾病对照组(1.00±0.39),差异有统计学意义(Z=2.66,P<0.01)。血清外泌体miR-494-3p筛查胃癌和健康人的ROC曲线下面积(AUC ROC)为0.725(95%CI:0.622~0.829,P<0.01),当cut-off值为0.370时,其敏感性为50.0%,特异性为86.4%,阳性预测值为63.3%,阴性预测值为78.6%,准确性为68.2%。结论miR-494-3p在胃癌患者血清外泌体中呈低表达,有望成为胃癌筛查和辅助鉴别诊断的潜在生物学标志物。

脓毒症并发ARDS患儿血清miR-424和miR-494表达变化及其临床意义

目的探讨脓毒症并发急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患儿血清微小RNA-424(miR-424)、微小RNA-494(miR-494)表达变化及其临床意义。方法选择脓毒症并发ARDS患儿213例(并发ARDS组),病情程度:轻度54例、中度86例、重度73例,住院28天内临床结局:死亡62例、存活151例。同期另选单纯脓毒症患儿45例(单纯脓毒症组)、体检健康儿童42例(对照组)。所有研究对象入组后采集外周静脉血,离心留取血清,采用RT-qPCR法检测血清miR-424、miR-494表达。比较三组血清miR-424、miR-494表达以及不同病情程度脓毒症并发ARDS患儿血清miR-424、miR-494表达。分析脓毒症并发ARDS患儿血清miR-424、miR-494表达与氧指数(OI)的关系。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清miR-424、miR-494表达对脓毒症并发ARDS患儿预后不良的预测价值。结果对照组、单纯脓毒症组、并发ARDS组血清miR-424相对表达量依次降低,血清miR-494相对表达量依次升高(P均<0.01)。随着脓毒症并发ARDS患儿病情加重,血清miR-424相对表达量逐渐降低,血清miR-494相对表达量逐渐升高(P均<0.01)。213例脓毒症并发ARDS患儿OI为13.42(7.96,17.46)。Spearman相关分析显示,脓毒症并发ARDS患儿血清miR-424相对表达量与OI呈负相关关系(r=-0.715,P<0.01),血清miR-494相对表达量与OI呈正相关关系(r=0.779,P<0.01)。ROC曲线分析显示,血清miR-424、miR-494表达预测脓毒症并发ARDS患儿预后不良的曲线下面积分别为0.793(95%CI:0.732~0.845)、0.795(95%CI:0.734~0.847),二者联合预测脓毒症并发ARDS患儿预后不良的曲线下面积为0.906(95%CI:0.858~0.941)。血清miR-424、miR-494表达联合预测脓毒症并发ARDS患儿预后不良的曲线下面积显著高于血清miR-424、miR-494表达单独(Z分别为4.051、4.065,P均<0.01)。结论脓毒症并发ARDS患儿血清miR-424低表达、血清miR-494高表达,二者表达变化与脓毒症并发ARDS病情加重密切相关;miR-424、miR-494有可能成为预测脓毒症并发ARDS患儿预后不良的血清生物标志物。

微小RNA-494-3p靶向配子生成素结合蛋白2促进结直肠癌细胞侵袭、迁移及上皮间质转化的实验研究

目的研究微小RNA-494-3p(miR-494-3p)影响结直肠癌细胞迁移、侵袭及上皮间质转化(EMT)的分子机制。方法于2019年1—12月体外培养购自美国ATCC的结直肠上皮细胞NCM460和结直肠癌细胞系T84、LS1034和HCT116,实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测细胞中miR-494-3p和配子生成素结合蛋白2(GGNBP2)mRNA的表达量,蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞中GGNBP2蛋白表达。将LS1034细胞分为对照(NC)组、miR-494-3p抑制剂(anti-miR-494-3p)组、抑制剂阴性对照(anti-miR-con)组、GGNBP2过表达载体(pcDNA-GGNBP2)组、空载体(pcDNA-con)组、anti-miR-494-3p+GGNBP2小干扰RNA(si-GGNBP2)组和anti-miR-494-3p+小干扰RNA阴性对照(si-con)组,甲基噻唑基四唑(MTT)法测定LS1034细胞存活率,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭,Western blot检测相关蛋白细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表达。双荧光素酶报告系统验证miR-494-3p和GGNBP2的调控关系。结果与NCM460细胞相比,结直肠癌细胞T84、LS1034和HCT116中miR-494-3p表达量均显著升高[(1.91±0.11)、(2.23±0.14)、(2.08±0.12)比(1.00±0.04),P<0.001],GGNBP2 m RNA表达量均显著下降[(0.51±0.08)、(0.38±0.06)、(0.45±0.07)比(1.00±0.11),P<0.001],GGNBP2蛋白表达量均显著下降(P<0.001)。与anti-miR-con组相比,anti-miR-494-3p组LS1034细胞存活率、迁移数和侵袭数均显著下降[(41.29±3.89)%比(84.36±7.28)%,(132.56±7.56)个比(246.3±10.64)个,(55.64±5.64)个比(145.62±9.56)个,均P<0.001],细胞中Cyclin D1、MMP-2、Vimentin蛋白表达量均显著下降,均P<0.001,E-cadherin蛋白表达升高、蛋白表达降低(P<0.001)。与pcDNA-con组相比,pcDNA-GGNBP2组LS1034细胞存活率、迁移数和侵袭数均显著下降,P<0.05,细胞中Cyclin D1、MMP-2、Vimentin蛋白表达均下降,均P<0.001,E-cadherin蛋白表达升高,蛋白表达降低,P<0.001。miR-494-3p靶向负调控GGNBP2的表达。与anti-miR-494-3p+si-con组相比,anti-miR-494-3p+si-GGNBP2组LS1034细胞存活率、迁移数和侵袭数均显著上升,细胞中Cyclin D1、MMP-2和Vimentin蛋白表达均升高,E-cadherin蛋白表达下降,均P<0.001。结论miR-494-3p通过靶向抑制GGNBP2促进结直肠癌LS1034细胞迁移、侵袭及EMT。

miR-494通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进胰岛β细胞增殖、抑制其凋亡增加胰岛素分泌

目的 探究微小RNA-494 (miR-494)与胰岛β细胞功能和妊娠糖尿病之间的关系。方法 选择20例妊娠糖尿病患者和健康体检者,反转录PCR测定其外周血miR-494的含量;培养INS-1胰岛细胞瘤细胞,分别采用含低糖(3.3 mmol/L)和高糖(16.7 mmol/L)处理后,采用ELISA测定胰岛素含量来评价胰岛细胞基础和高糖刺激的胰岛素分泌能力;采用miR-494模拟物对照、miR-494模拟物、miR-494抑制物对照、miR-494抑制物分别处理INS-1细胞24、48、72 h,收集细胞。采用噻唑蓝(MTT)法检测INS-1细胞的活性,流式细胞术检测细胞凋亡;反转录PCR检测INS-1细胞Wnt3a、β联蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和c-Myc的mRNA表达;Western blot法检测细胞Wnt3a、β-catenin、cyclin D1、c-Myc蛋白表达。结果 与正常对照组相比,妊娠糖尿病患者空腹胰岛素、空腹血糖、1 h血糖和2 h血糖显著升高;外周血miR-494含量降低。过表达miR-494的INS-1细胞上清液胰岛素浓度增加,当给予高糖后,过表达miR-494进一步促进胰岛素分泌。过表达miR-494明显促进INS-1细胞活性,抑制INS-1细胞凋亡;miR-494能够显著性促进Wnt3a、β-catenin、cyclin D1、c-Myc的mRNA和蛋白表达,miR-494抑制物处理则结果相反。结论 miR-494通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进胰岛β细胞增殖、抑制其凋亡增加胰岛素分泌。

miR-494在乳腺癌中的表达及其临床意义

目的探讨miR-494在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中的表达及其与乳腺癌临床分期、转移和预后的关系。方法实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测5种乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-453、HCC-1937、MDA-MB-468、MCF-7和乳腺上皮细胞系HBL-100中miR-494的表达水平;收集54对乳腺癌组织和癌旁组织,用qRT-PCR法检测其miR-494的表达水平,并分析其与乳腺癌临床分期、转移和预后的关系。结果 qRT-PCR检测结果显示,与正常乳腺上皮细胞HBL-100相比,MDA-MB-231、MDA-MB-453、HCC-1937、MDA-MB-468、MCF-7乳腺癌细胞系中miR-494的表达水平均明显降低(t分别为212.9、37.73、27.53、10.61、19.46,P均<0.05)。此外,miR-494在乳腺癌组织中的表达水平亦明显低于癌旁组织(t=5.80,P<0.01),且与临床分期(χ2=17.41,P<0.05)、组织病理分级(χ2=5.33,P<0.05)、C-erb B-2表达情况(χ2=9.83,P<0.05)、Ki-67阳性细胞百分比(χ2=6.13,P<0.05)有关。结论 miR-494在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中低表达,且与乳腺癌临床分期、转移和预后关系密切,可成为乳腺癌辅助诊断和预后判断的分子标志。

miR-494和ATF3 mRNA在脑膜瘤组织中的表达关系及意义

目的分析微小RNA-494(miR-494)、激活转录因子3信使RNA(ATF3 mRNA)在脑膜瘤组织中的表达及其意义。方法选取2013年10月—2018年1月于首都医科大学附属北京友谊医院神经外科脑膜瘤切除患者79例为脑膜瘤组,另取因脑外伤切除脑组织患者79例为对照组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测2组miR-494、ATF3 mRNA表达水平;分析脑膜瘤组织miR-494、ATF3 mRNA表达水平与脑膜瘤患者临床病理特征及预后的关系;Pearson法分析脑膜瘤组织miR-494表达水平与ATF3 mRNA的相关性;COX回归分析脑膜瘤患者预后的影响因素。结果脑膜瘤组miR-494、ATF3 mRNA表达水平均显著高于对照组(t/P=7.038/0.000、8.271/0.000)。脑膜瘤组织miR-494、ATF3 mRNA低表达亚组有淋巴结转移、WHO分级Ⅲ级、TNM分期Ⅲ~Ⅳ期患者比例低于高表达亚组(miR-494:χ^(2)/P=5.346/0.021、6.627/0.010、12.381/0.000;ATF3 mRNA:χ^(2)/P=12.868/0.000、14.799/0.000、12.166/0.000);脑膜瘤组织miR-494表达水平与ATF3 mRNA水平呈正相关(r/P=0.578/0.000);脑膜瘤患者miR-494、ATF3 mRNA低表达亚组术后36个月累积生存率分别明显高于miR-494、ATF3 mRNA高表达亚组(χ^(2)/P=21.798/0.019、13.015/0.000)。多因素分析结果显示,发生淋巴结转移、TNM分期增加及miR-494、ATF3 mRNA表达水平升高是影响脑膜瘤患者预后的独立危险因素[OR(95%CI)=2.572(1.582~4.182)、2.463(1.554~3.904)、2.257(1.478~3.447)、2.385(1.547~3.678)]。结论脑膜瘤组织中miR-494、ATF3 mRNA表达水平显著升高,两者可能相互作用共同影响脑膜瘤发生发展,检测miR-494、ATF3 mRNA水平有利于判定患者预后情况。

过表达MiR-494抑制脑胶质瘤细胞U87的增殖

目的观察微小RNA-494(miR-494)对脑胶质瘤细胞U87增殖能力的影响。方法通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测5例瘤旁组织和14例胶质瘤样本中miR-494的表达水平,并且检测其在6种胶质瘤细胞系中的表达;将100 nmol/L miR-494 mimics瞬时转染至脑胶质瘤U87细胞,qRT-PCR检测miR-494表达情况;采用四唑盐比色法(MTT)检测U87细胞增殖情况;流式细胞术(FCM)检测对U87细胞周期的影响。结果与瘤旁脑组织相比,miR-494在胶质瘤中呈现低表达;U87细胞转染48 h后,miR-494 mimics组miR-494表达为对照组的357倍(P<0.05);与对照组相比,miR-494 mimics转染后抑制了U87细胞的增殖能力(P<0.05);S期细胞显著减少,而G1期细胞则明显增多。结论 miR-494在胶质瘤中低表达,过表达miR-494 mimics有效抑制了U87细胞的增殖,调节细胞周期S期降低G1期增多,提示miR-494有望成为胶质瘤治疗的分子靶点。

MicroRNA-494参与多种疾病发生发展的分子机制研究进展

微小 RNA （ microRNA， miRNA， miR ）是一种由20～22个核苷酸组成的内源性非编码小分子单链RNA，它可以在后转录水平通过以完全互补或不完全互补的形式与mRNA的3＇ UTR区结合调控细胞增殖、分化及凋亡等多个生理病理过程。其中， miR-494是一种来源于染色体14q32．31的 mi-RNA。近年来的研究发现miR-494参与人体多个生理及疾病的发生发展过程，在肿瘤、缺血缺氧疾病中其表达水平发生上调或下调。本文就miR-494在多种疾病中的表达变化、作用及机制研究进行综述。

MiR-494通过激活PI3K/AKT通路减轻大鼠肝缺血-再灌注损伤

目的探讨微小核糖核酸(miRNA)-494对肝缺血-再灌注损伤(HIRI)的影响及相关作用机制。方法 24只雄性SD大鼠随机均分为4组(每组6只):假手术组行腹部手术而未行肝脏缺血-再灌注;HIRI组大鼠行部分肝缺血60 min后,再灌注6 h;HIRI+agomir-miR-494组在术前7 d内每日腹腔注射agomir-miR-494(20μL);HIRI+agomir-NC组在术前7 d内每日腹腔注射等量的agomir-NC。采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法检测各组肝组织中miR-494的信使核糖核酸(mRNA)表达水平。采用相关试剂盒检测各组的肝损伤指标和氧化应激指标表达水平。观察各组肝组织病理学改变。采用试剂盒检测各组大鼠肝组织中凋亡细胞数和胞质组蛋白相关DNA片段。采用免疫印迹法检测各组凋亡相关蛋白以及磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶(AKT)通路相关蛋白的表达量。结果 HIRI+agomir-miR-494组大鼠肝组织miR-494的mRNA水平显著高于HIRI+agomir-NC组(P<0.01)。HIRI+agomir-miR-494组的血清肝损伤指标以及血清氧化应激指标均显著低于HIRI+agomir-NC组(均为P<0.01)。与HIRI+agomir-NC组相比,HIRI+agomir-miR-494组肝细胞坏死明显减少和细胞完整性提高(P<0.05),TUNEL阳性细胞数量明显减少(P<0.05)。HIRI+agomir-miR-494组的cleaved-多聚二磷腺苷核糖聚合酶(PARP)、cleaved-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、Bax水平明显低于HIRI+agomir-NC组(均为P<0.05)。HIRI+agomir-miR-494组大鼠DNA片段显著少于HIRI+agomir-NC组(P<0.01)。HIRI+agomir-miR-494组大鼠肝脏p-AKT、p-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和p-p70S6K表达量明显高于HIRI+agomir-NC组(均为P<0.05)。结论 miR-494可以减轻大鼠HIRI,其作用机制与激活PI3K/AKT信号通路有关。

前列腺癌组织中LncRNA LINC00355、miR-494-3p、CCND2的表达及临床意义

目的探讨前列腺癌组织中长链非编码RNA(LncRNA)LINC00355、微小RNA-494-3p(miRNA-494-3p)、细胞周期素D2(CCND2)的表达及临床意义。方法选取安徽省第二人民医院2015年1月至2017年12月收治的91例前列腺癌患者,qRT-PCR检测患者癌组织和癌旁正常组织中LncRNA LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA表达。Kaplan-Meier曲线分析不同LncRNA LINC00355、miR-494-3p、CCND2 mRNA表达前列腺癌患者的术后3年生存率。结果前列腺癌组织中LncRNA LINC00355、CCND2 mRNA表达高于癌旁正常组织,miR-494-3p表达低于癌旁正常组织(P<0.05)。前列腺癌组织中LncRNA LINC00355与miR-494-3p表达呈负相关,与CCND2 mRNA表达呈正相关(r=-0.502、0.458,P<0.001),miR-494-3p与CCND2 mRNA表达呈负相关(r=-0.493,P<0.001)。LncRNA LINC00355高表达、miR-494-3p低表达、CCND2 mRNA高表达患者术后3年总生存率低于LncRNA LINC00355低表达、miR-494-3p高表达、CCND2 mRNA低表达患者(P<0.05)。结论前列腺癌组织中LncRNA LINC00355、CCND2表达上调,miR-494-3p表达下调,LncRNA LINC00355可能通过抑制miR-494-3p上调CCND2表达,促进前列腺癌进展。

微小RNA-494通过抑制Survivin诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡

目的观察微小RNA（miRNA）-494对人前列癌Pc-3细胞中Survivin基因的表达抑制及对Pc-3细胞增殖与凋亡的影响。方法TargetScan5．2预测miRNA-494与SurvivinmRNA配对评分为mjrSVR score：-0．4916、PhastConsscore：0．4876；定量聚合酶链反应（qPCR）分析PC-3相对于正常前列腺上皮细胞株RWPE-1中miRNA-494的上下调情况；构建过表达miRNA-94的腺病毒载体，应用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）、Westernblot、噻唑蓝（MTT）法、流式细胞仪分析分别检测感染前后Survivin基因及蛋白的表达差异、细胞增殖及生长周期和凋亡变化。结果miRNA-494在PC-3中的表达为RWPE-1中的（0．547±0．032）倍；Ad—pre—miRNA-494构建成功；实验组细胞增殖抑制呈现时间依赖性；和对照组比较，72h后实验组Survivin蛋白表达为（21．69±4．62）％，与空载体组比较，差异有统计学意义（P〈0．01），流式细胞仪检测结果显示实验组Pc-3细胞G2／M期阻滞率及细胞凋亡率显著增加。结论miRNA-494通过抑制前列腺癌PC-3细胞中Survivin基因的表达而诱导前列腺癌PC-3凋亡。

微小RNA-494过表达与RNA干扰抑制Survivin基因对前列腺癌移植瘤生长的比较

目的比较过表达微小RNA（microRNA）-494与采用RNA干扰抑制前列腺癌PC．3细胞中Survivin基因的表达，对前列腺癌移植瘤生长的影响。方法将过表达mieroRNA-494的腺病毒载体Ad494及负载Survivin短发卡RNA（shRNA）腺病毒载体Ad-sur分别或联合感染PC-3细胞后，将相应PC-3细胞接种于裸鼠右前肢皮下，建立前列腺癌移植瘤模型。并以磷酸盐缓冲液（PBS）组及空载体组（Ad-GFP）作为对照。动态测量肿瘤体积。55d后处死各组裸鼠，瘤体称重计算抑瘤率。Westernblot检测肿瘤组织中Survivin表达变化。免疫组织化学测定Survivin、B淋巴细胞／白血病-2（bcl-2）、bcl-2相关x蛋白（bax）及半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶（Caspase）-3表达变化。结果Ad-sur组、Ad-494组、Ad-sur＋Ad-494组裸鼠前列腺癌移植瘤的生长明显被抑制。第35天时即表现差异。其中Ad-sur＋Ad-494组瘤体积最小，为（40．69±0．69）mm3，Ad-sur、Ad-494组瘤体体积分别为（102．11±5．32）mm3、（99．03±3．50）mm3，3组肿瘤体积均明显小于PBS组（572．72±10．46）mm3、Ad．GFP组（544．85±10．28）mm3（P〈0．05）。但Ad-sur组与Ad_494组间瘤体大小差异无统计学意义（P〉0．05）。55d后，Ad-sur、Ad-494、Ad-sur＋Ad-494组对移植瘤抑制率分别64．62％、65．98％、86．67％，Ad-sur＋Ad-494组具有抑瘤增效的相加作用（Q=0．99）。同对照组比较，实验各组的Survivin基因均表达下降，差异有统计学意义（P〈0．05）。其中，Ad-494组与Ad-sur组间差异无统计学意义（P〉0．05），Ad．sur＋Ad-494组较Ad-494、Ad-sur组更为显著；实验各组中的bax、Caspase-3表达上调，bcl-2表达下调，且Ad-sur＋Ad-494组效果优于Ad-sur、Ad-494组。结论过表达microRNA-494与RNA干扰方法均可抑制前列腺癌裸鼠移植瘤Survivin基因表达，从而抑制移植瘤的生长，且两者联合效果更加显著。

微小RNA-494通过抑制第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酯酶基因的表达促进乳腺癌MCF-7细胞的增殖和转移

目的 探讨微小RNA（miRNA,miR）-494对乳腺癌细胞MCF-7的增殖和转移的调控作用以及机制.方法 在乳腺癌细胞株MCF-7转染miR-494模拟物及抑制剂、阴性对照,然后采用噻唑蓝（MTT）方法检测miR494对MCF-7细胞活力的影响,并通过Transwell转移实验检测miR-494对MCF-7转移能力的影响.通过双荧光素酶实验检测miR-494的靶基因,并且用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot进行验证.结果 转染miR-494 mimics后,细胞活力明显提高,24 h细胞活力比值为1.28,48 h后为1.80,（P＜0.05）,转染miR-494 inhibitor后,细胞活力显著下调,24h细胞活力比值为0.80,48 h后为0.68（P ＜0.05）.对照组细胞均数为67个/视野,转染miR-494mimics后的MCF-7细胞的均数为：122个/视野（P＜0.05）,转染miR-494 inhibitor后的MCF-7细胞的均数为：47个/视野（P＜0.01）.野生型载体模拟物组相对荧光素酶活性：0.69（P＜0.01）,抑制剂组：1.90（P＜0.01）;突变型载体模拟物组相对荧光素酶活性：1.09,抑制剂组：1.19.miR-494过表达后PTEN的mRNA和蛋白水平确实出现明显下降,相反地,miR-494的抑制却导致PTEN蛋白水平和mRNA水平的上调.结论 高表达miR-494可显著促进乳腺癌细胞株MCF-7的增殖与转移能力,抑制miR-494可显著降低MCF-7的增殖与转移能力,并且证实miR-494是通过靶向第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酯酶基因（PTEN）的3＇端非编码区域（3＇-UTR）来调节乳腺癌细胞株MCF-7的增殖和转移能力.

外周血中miR-494和LRG1表达水平对肥胖儿童糖尿病的诊断意义

目的 探究外周血中微小RNA-494(miR-494)、富亮氨酸α2-糖蛋白1(LRG1)表达水平对肥胖儿童糖尿病的诊断意义。方法 选取2017—2019年在金华市婺城区人民医院儿科就诊的肥胖儿童167例为研究对象,根据肥胖儿童空腹8~10 h行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)结果将其分为非糖尿病组129例和糖尿病组38例。采用荧光定量PCR技术检测血清miR-494水平,酶联免疫吸附法检测血清LRG1、转化生长因子-β1(TGF-β1)水平,利用贝克曼AU5800全自动生化分析仪检测其他血清指标。Pearson法分析肥胖儿童糖尿病患儿外周血miR-494、LRG1水平之间及与其他血清指标水平的相关性;多因素logistic回归分析肥胖儿童发生糖尿病的影响因素,利用受试者工作特征曲线(ROC)评价血清指标对肥胖儿童糖尿病的诊断价值。结果 与非糖尿病组相比,糖尿病组空腹血糖(FGB)、糖化血红蛋白(HbA1c)、miR-494、LRG1、TGF-β1水平均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。肥胖儿童糖尿病外周血miR-494、LRG1水平呈正相关(P<0.05),miR-494、LRG1水平与FGB、HbA1c、TGF-β1水平均呈正相关(P<0.05)。多因素回归分析结果显示,外周血miR-494、LRG1、TGF-β1是肥胖儿童是否发生糖尿病的预测因素(P<0.05)。ROC结果显示,外周血miR-494、LRG1、TGF-β1评估肥胖儿童糖尿病的曲线下面积分别为0.870(95%CI:0.821~0.915)、0.830(95%CI:0.764~0.883)、0.847(95%CI:0.795~0.897),三者联合预测肥胖儿童糖尿病的曲线下面积为0.951(95%CI:0.910~0.975),与3个指标单独检测比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 肥胖儿童糖尿病外周血miR-494、LRG1均呈高表达,且对肥胖儿童糖尿病均有一定的诊断价值,联合诊断可明显提高诊断效能,具有一定的临床意义。

微小RNA-494对促进脊髓损伤后功能恢复和抑制细胞凋亡的研究

目的探讨微小RNA(miRNA,miR)-494在脊髓损伤中的作用及其意义。方法应用脊髓表面挫伤的方法建立大鼠脊髓损伤模型。分为1个假损伤对照组和5个脊髓损伤组,每组5只大鼠(购自复旦大学实验动物中心)。用miRNA芯片分析脊髓损伤后不同时间miRNA的表达。用agomiR-494鞘内治疗后,评定大鼠运动功能。正态性采用Shapiro-Wilk正态检验,组间差异采用单因素方差分析和双侧t检验。结果与假损伤对照组比较,有14个miRNA上调,有46个miRNA下调2倍,而miR-494是最显著下调的miRNA之一。与单纯SCI组比较,agomiR-494鞘内治疗后的SCI+agomiR-494组,大鼠运动功能明显改善,剩余组织(甲酚紫染色评估)增多,TUNEL阳性细胞减少。agomiR-494对miR-494的上调可促进脊髓损伤后大鼠的功能恢复,减小病变大小并抑制凋亡细胞。脊髓组织中miR-494的表达与第10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酯酶基因(PTEN)的表达呈负相关(r=-0.834,P<0.05)。此外,miR-494通过直接靶向BV-2细胞中的3’端非编码区(3’UTR)来抑制蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途径的负调节剂PTEN。结论在大鼠脊髓损伤模型中miR-494的过表达通过抑制PTEN的表达来激活Akt/mTOR信号通路,对脊髓损伤具有保护作用。

基于NF-κB/miR-494信号调控MUC5AC和CFTR研究小青龙汤与清气化痰丸改善病理性气道黏液的机制

目的观察小青龙汤和清气化痰丸对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的人肺癌细胞H292黏液高分泌模型及核转录因子-κB/微小RNA-494(NF-κB/miR-494)信号通路相关分子的影响,探讨两者改善病理性气道黏液的作用机制。方法采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测不同浓度小青龙汤、清气化痰丸对IL-1β诱导的H292细胞活性的影响并选择合适浓度进行后续实验。将细胞随机分为空白组、模型组(5μg/L IL-1β)、NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(PDTC)组(5μg/L IL-1β+100μmol/L PDTC)、小青龙汤组(5μg/L IL-1β+1000 mg/L小青龙汤)和清气化痰丸组(5μg/L IL-1β+1000 mg/L清气化痰丸);采用5μg/L IL-1β诱导H292细胞24 h建立气道上皮黏液高分泌细胞模型。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞分泌黏蛋白5AC(MUC5AC)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-8水平及细胞内MUC5AC和囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)蛋白含量;采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测MUC5AC mRNA、CFTR mRNA和miR-494的表达;采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测NF-κB信号通路关键蛋白p65和NF-κB抑制因子(IκB)的蛋白表达。结果选择浓度为1000 mg/L的小青龙汤和清气化痰丸进行后续实验。与空白组比较,模型组细胞分泌MUC5AC、TNF-α和IL-8水平显著升高,细胞内MUC5AC蛋白含量和mRNA表达也显著升高,细胞内CFTR蛋白含量和mRNA表达均显著降低,且细胞内p65蛋白表达显著上调,IκB蛋白表达显著下调,miR-494表达显著升高。与模型组相比,PDTC组、小青龙汤组和清气化痰丸组细胞分泌MUC5AC、TNF-α、IL-8水平显著降低,细胞内MUC5AC蛋白含量和mRNA表达也显著降低,且细胞内p65蛋白表达均显著下调,IκB蛋白表达均显著上调,miR-494表达均显著降低;PDTC组和清气化痰丸组细胞内CFTR蛋白含量和mRNA表达均显著升高。与PDTC组相比,小青龙汤组细胞分泌TNF-α水平显著升高(ng/L:22.77±3.14比11.09±3.37,P<0.05),细胞内CFTR蛋白含量和mRNA表达、IκB蛋白表达均显著降低〔CFTR蛋白(ng/L):97.38±6.62比227.04±19.48,CFTR mRNA(2^(-ΔΔCt)):0.99±0.08比1.21±0.08,IκB/β-actin:1.69±0.11比2.00±0.18,均P<0.05〕;清气化痰丸组细胞分泌TNF-α水平显著升高(ng/L:19.08±3.71比11.09±3.37,P<0.05)。与小青龙汤组相比,清气化痰丸组细胞内CFTR蛋白含量和mRNA表达、IκB蛋白表达均显著升高〔CFTR蛋白(ng/L):235.01±22.71比97.38±6.62,CFTR mRNA(2^(-ΔΔCt)):1.32±0.15比0.99±0.08,IκB/β-actin:1.94±0.16比1.69±0.11,均P<0.05〕。结论小青龙汤改善气道上皮黏液高分泌炎症的机制可能与抑制NF-κB/miR-494炎症信号介导的MUC5AC高分泌有关,而清气化痰丸则可能与抑制NF-κB/miR-494炎症信号介导的MUC5AC高分泌及CFTR功能障碍有关,因此,二者治疗病理性气道黏液的机制差异主要在对CFTR基因和蛋白的调控上。