LncRNA-MIAT通过抑制miR-519d-3p激活EZH2促进甲状腺癌的恶性行为

目的:探讨长链非编码RNA MIAT(LncRNA-MIAT)对甲状腺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的调控作用与分子机制。方法:用癌症基因组图谱(TCGA)和甲状腺癌(THCA)mRNA-seq数据分析LncRNA-MIAT和组蛋白甲基化转移酶2(EZH2)在甲状腺癌中的表达。用人正常甲状腺细胞系Nthy-ori 3-1和人甲状腺癌细胞系FTC-133作为靶细胞。qPCR法检测LncRNA-MIAT、miR-519d-3p、EZH2 mRNA的表达水平差异。RNA荧光原位杂交(FISH)检测LncRNA-MIAT在FTC-133细胞中的定位,Western blot检测EZH2蛋白的表达。荧光素酶报告基因检测LncRNA-MIAT和miR-519d-3p以及miR-519d-3p与EZH2的直接作用。将FTC-133细胞分为6组[空白对照组(control组)、空载体组(Empty vector组)、过表达LncRNA-MIAT组(LncRNA-MIAT组)、miR-519d-3p的抑制剂组(miR-519d-3p inhibitor组)、EZH2的抑制剂EPZ-6438处理组(EPZ-6438组)、miR-519d-3p抑制剂联合过表达LncRNA-MIAT组(LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor组)]。用Edu试剂盒和平板克隆法检测细胞增殖。用流式细胞术检测细胞凋亡。用Transwell细胞迁移和侵袭实验检测细胞的行为。结果:LncRNA-MIAT和EZH2在甲状腺癌组织和细胞中的表达均上调,二者具有正相关性(r=0.466,P<0.05),miR-519d-3p在FTC-133细胞中表达下调(P<0.05)。经过双荧光素酶报告基因实验检测发现miR-519d-3p的靶基因是EZH2,且LncRNA-MIAT靶向抑制miR-519d-3p激活EZH2。与Empty vector组相比,LncRNA-MIAT组和miR-519d-3p inhibitor组的Edu阳性细胞百分比、细胞克隆数、细胞侵袭和迁移数均显著上调(P<0.05),细胞凋亡率均减少(P<0.05)。EZH2的抑制剂EPZ-6438则减少Edu阳性细胞百分比、细胞克隆数、细胞侵袭和迁移数(P<0.05),增加细胞凋亡率(P<0.05)。分别与LncRNA-MIAT组或miR-519d-3p inhibitor组比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor组的Edu阳性细胞百分比、细胞克隆数、细胞侵袭和迁移数均显著上调(P<0.05),细胞凋亡率降低(P<0.05)。结论:甲状腺癌细胞中LncRNA-MIAT通过抑制miR-519d-3p激活EZH2促进甲状腺癌的恶性行为。

miR-519d-3p靶向HIF-1α抑制高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞功能障碍及血管生成

目的:明确miR-519d-3p对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)功能障碍与血管生成的影响,并阐明其对低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的调控机制。方法:通过5、30mmol/L葡萄糖分别诱导HRMEC建立正常(NG)和高糖(HG)细胞模型。将HRMEC分为对照组(HG细胞模型转染阴性对照模拟物)、甘露醇组(对照组加入25mmol/L甘露醇)、miR-519d-3p过表达组(HG细胞模型转染miR-519d-3p模拟物)、miR-519d-3p联合HIF-1α过表达组(HG细胞模型共转染miR-519d-3p模拟物和HIF-1α过表达载体)。实时荧光定量PCR法检测各组miR-519d-3p的表达情况。Western blotting法检测各组HIF-1α蛋白的表达情况。荧光素酶报告基因实验检测miR-519d-3p和HIF-1α的结合位点情况。CCK-8法检测各组细胞增殖情况。Hoechst 33342染色法检测各组细胞凋亡情况。ELISA法检测各组细胞外液炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6蛋白的表达情况。小管形成实验检测各组新生毛细血管管腔样结构形成情况。结果:与NG相比,HG细胞模型中miR-519d-3p表达显著减少,而HIF-1α蛋白表达显著增加(均P<0.01)。与对照组比较,miR-519d-3p过表达组中HIF-1α蛋白表达显著降低(P<0.01)。miR-519d-3p中“CGUGAAA”序列可以与HIF-1α3'-非编码区(3'-UTR)中“GCACUUU”序列特异性结合。与对照组比较,miR-519d-3p过表达组细胞24、48、72h吸光度值均显著增加,细胞凋亡率显著减少,细胞外液TNF-α、IL-1β、IL-6浓度均显著减少,新生毛细血管管腔样结构数量显著减少(均P<0.01)。与miR-519d-3p过表达组比较,miR-519d-3p联合HIF-1α过表达组细胞24、48、72h吸光度值均显著减少,细胞凋亡率显著增加,细胞外液TNF-α、IL-1β、IL-6浓度均显著增加,新生毛细血管管腔样结构数量显著增加(均P<0.01)。对照组和甘露醇组中上述各指标比较无差异(均P>0.05)。结论:高糖诱导HRMEC模型中miR-519d-3p表达下调,而HIF-1α蛋白表达上调。HIF-1α是miR-519d-3p的靶基因,miR-519d-3p靶向HIF-1α增加细胞增殖并降低细胞凋亡和炎症反应,从而减轻高糖诱导的HRMEC功能障碍并抑制血管生成。

miR-519d-3p通过调控Toll样受体4/核因子-κB信号通路对前列腺癌细胞的影响机制研究

目的 探讨通过微小RNA-519d-3p(miR-519d-3p)调控Toll样受体4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)信号通路对前列腺癌细胞的机制研究。方法 于2021年6月购买前列腺癌细胞株PC3,培养至对数时期,随机分为对照组、下调miR-519d-3p组、上调miR-519d-3p组。采用聚合酶链反应检测miR-519d-3p表达情况,对比干预24h、48h、72h细胞增殖、细胞迁移、侵袭率;检测细胞TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达状况。结果 与对照组相比,下调miR-519d-3p组细胞增殖率、细胞侵袭数、迁移数、miR-519d-3p表达量、B淋巴细胞瘤-2基因/Bcl-2相关X基因(Bcl-2/Bax)、TLR4/β-actin、NF-κB/β-actin蛋白表达量上升,细胞凋亡率下降(P<0.05);与下调miR-519d-3p组相比,上调miR-519d-3p组细胞增殖率、细胞侵袭数、迁移数、miR-519d-3p表达量、Bcl-2/Bax、TLR4/β-actin、NF-κB/β-actin蛋白表达量降低,细胞凋亡率升高(P<0.05)。结论 上调miR-519d-3p可抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭,其作用机制可能与TLR4/NF-κB信号通路相关。

瑞芬太尼通过miR-519d-3p/STAT3对胃癌细胞增殖、凋亡的影响

背景研究表明,阿片类药物不仅用于肿瘤手术麻醉及术后镇痛,而且对肿瘤细胞恶性生物学行为具有一定抑制作用.瑞芬太尼作为一种高效阿片受体激动剂,已有报道瑞芬太尼可抑制结肠癌、肝癌、肺腺癌等多种肿瘤细胞增殖、迁移并诱导肿瘤细胞凋亡.但目前瑞芬太尼对胃癌(gastric cancer, GC)细胞增殖和凋亡的影响及其机制尚不清楚.目的研究瑞芬太尼对GC细胞增殖、凋亡的影响及其潜在作用机制.方法培养人GC SGC7901细胞, MTT实验检测不同浓度瑞芬太尼对细胞增殖的影响.构建过表达miR-519d-3p的GC细胞,另构建抑制表达miR-519d-3p和过表达STAT3的细胞并给于瑞芬太尼处理,分别于培养24h、48h和72h时采用MTT法测定细胞增殖活性,培养48 h时采用流式细胞仪测定细胞凋亡情况, qRTPCR和Westernblot实验分别用于检测细胞中miR-519d-3p和STAT3蛋白表达水平,双荧光素酶报告基因实验检验miR-519d-3p是否靶向STAT3.结果瑞芬太尼能够有效抑制GC细胞增殖,诱导细胞凋亡,并促进细胞中miR-519d-3p表达;过表达miR-519d-3p抑制GC细胞增殖并诱导细胞凋亡,而抑制miR-519d-3p表达可逆转瑞芬太尼对GC细胞增殖和凋亡的作用;双荧光素酶报告基因实验证实GC细胞中miR-519d-3p靶向负调控STAT3的活性;过表达STAT3逆转了瑞芬太尼对GC细胞增殖和凋亡的作用.结论瑞芬太尼具有抑制GC细胞增殖并诱导细胞凋亡的作用,其作用机制可能与调控miR-519d-3p/STAT3表达有关.

麦冬皂苷D通过调控miR-519d-3p/EIF4E表达对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭的实验研究

背景麦冬皂苷D(ophiopogonin D,OPD)是中药麦冬提取物中重要的单体成分且具有抗癌作用,但是否具有抗肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)作用还未知.本研究假设OPD能够通过上调miR-519d-3p表达进而下调真核细胞翻译起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E,EIF4E)表达发挥抗HCC作用.目的探讨OPD对HCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响及可能的作用机制.方法培养HCC细胞HepG2和MHCC97,不同浓度(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)的OPD作用48 h后,四甲基噻唑蓝染色法(methylthiazoletrazolium,MTT)检测细胞增殖,Transwell检测细胞迁移和侵袭,实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测细胞中miR-519d-3p和EIF4E mRNA表达,Western blot检测细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、MMP-9和EIF4E蛋白表达.双荧光素酶报告基因实验验证miR-519d-3p和EIF4E之间关系.转染miR-519d-3p mimics、si-EIF4E构建miR-519d-3p过表达或EIF4E表达抑制的HepG2和MHCC97细胞,RT-qPCR检测细胞中miR-519d-3p表达或Western blot检测EIF4E蛋白表达验证转染效率.MTT、Transwell、Western blot分别检测过表达miR-519d-3p或抑制EIF4E表达对HepG2和MHCC97细胞增殖、迁移和侵袭,及CyclinD1、p21、MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响.结果与对照组比,OPD组HepG2细胞抑制率显著升高(P<0.05),迁移和侵袭数显著降低(P<0.05),HepG2细胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达显著降低(P<0.05),p21蛋白表达显著升高(P<0.05),miR-519d-3p表达显著升高(P<0.05),EIF4E mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05),且呈浓度依赖性.miR-519d-3p在HepG2细胞中靶向负调控EIF4E表达.miR-519d-3p过表达或抑制EIF4E表达均可抑制HepG2细胞增殖、迁移和侵袭.抑制miR-519d-3p表达部分逆转了OPD对HepG2细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用.结论OPD可能通过调控miR-519d-3p/EIF4E表达抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭.

lncRNA TTN-AS1通过miR-519d-3p/MMP2调控肺腺癌A549细胞的活力和侵袭

目的:观察肺腺癌组织中长链非编码RNA(lncRNA)TTN反义RNA 1(TTN-AS1)的表达情况,以及沉默TTN-AS1表达对肺腺癌A549细胞活力和侵袭的影响。方法:RT-qPCR法检测32例肺腺癌和癌旁正常组织中TTN-AS1、微小RNA-519d-3p(miR-519d-3p)和基质金属蛋白酶2(MMP2)的mRNA表达水平。将未转染的A549细胞设为空白组,转染si-NC的为si-NC对照组,转染沉默TTN-AS1表达的siRNA为si-lncRNA组(n=5),采用CCK8和Transwell方法检测沉默TTN-AS1表达对A549细胞活力和侵袭的影响。使用双萤光素酶报告基因实验、RNA免疫沉淀实验、RT-qPCR和Western blot测定TTN-AS1对miR-519d-3p和miR-519d-3p对MMP2的靶向调控作用。结果:32例肺腺癌组织中TTN-AS1的表达水平显著高于对应癌旁正常组织(P<0.05)。沉默A549细胞中TTN-AS1的表达可抑制细胞的活力和侵袭。TTN-AS1可通过海绵吸附的方式负调控miR-519d-3p的表达;MMP2是miR-519d-3p的靶基因,受其负调控。过表达MMP2可部分逆转沉默TTN-AS1和过表达miR-519d-3p对A549细胞侵袭的抑制作用。结论:肺腺癌组织中lncRNA TTN-AS1呈现高表达情况,它可能通过miR-519d-3p/MMP2调控肺腺癌A549细胞的活力和侵袭能力。

miR-519d-3p靶向KPNA2对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制

目的探讨微小RNA(miR)-519d-3p对核转运蛋白α-2(KPNA2)的靶向作用及其对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其可能作用机制。方法体外培养胶质瘤细胞株U251、U87、T98G与正常胶质细胞株SVGp12,采用qRT-PCR与Western印迹法检测细胞中miR-519d-3p与KPNA2的mRNA及蛋白表达。脂质体将miR-519d-3p mimics、si-KPNA2及其各自阴性对照转染入胶质瘤U251细胞;共转染分组:miR-519d-3p+pcDNA组(miR-519d-3p mimics与pcDNA共转染胶质瘤U251细胞),miR-519d-3p+pcDNA-KPNA2组(miR-519d-3p mimics与pcDNA-KPNA2共转染胶质瘤U251细胞)。MTT实验与Transwell小室检测各组胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭。运用生物信息学方法预测miR-519d-3p与KPNA2的靶向配对关系,采用双荧光素酶报告实验验证miR-519d-3p与KPNA2的作用关系。Western印迹检测CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表达。结果与正常胶质细胞株SVGp12比较,胶质瘤细胞株U251、U87、T98G中miR-519d-3p的表达水平均显著降低(P<0.05),而KPNA2 mRNA及蛋白表达水平均显著升高(P<0.05);miR-519d-3p过表达后胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力均明显减弱,促进p21、p27表达,而抑制CyclinD1、MMP-2、MMP-9、MMP-14表达;抑制KPNA2表达后胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力均明显减弱,促进p21表达,而抑制CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达;miR-519d-3p过表达同时上调KPNA2表达后部分逆转miR-519d-3p过表达对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用。结论miR-519d-3p可通过负向调控KPNA2表达而抑制胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭。

乌头碱调控miR-181d-5p/DDX3轴对宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨乌头碱通过调控微小RNA-181d-5p(miR-181d-5p)/DEAD-box RNA解旋酶3(DDX3)轴对宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡的影响。方法使用不同剂量乌头碱处理宫颈癌HeLa细胞,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖确定给药剂量。将HeLa细胞分为对照组(正常培养,不进行处理),乌头碱低剂量组(4 mg/L)、中剂量组(8 mg/L)、高剂量组(16 mg/L),顺铂组(5 mg/L),乌头碱高剂量+miR-NC组[16 mg/L乌头碱+转染miR-181d-5p siRNA阴性对照(miR-NC)质粒]及乌头碱高剂量+miR-181d-5p低表达组[16 mg/L乌头碱+转染miR-181d-5p小干扰RNA(siRNA)质粒]。平板克隆形成实验及流式细胞仪分别检测各组HeLa细胞克隆形成数与凋亡情况;实时荧光定量PCR检测HeLa细胞中miR-181d-5p和DDX3 mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法检测HeLa细胞中DDX3、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、增殖细胞核抗原(PCNA)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达水平;双萤光素酶报告基因实验验证miR-181d-5p与DDX3的靶向关系。结果以0.5~64 mg/L的乌头碱分别处理HeLa细胞24 h、48 h、72 h后,对HeLa细胞均有不同程度的抑制作用,选择剂量为4 mg/L、8 mg/L、16 mg/L的乌头碱用于后续实验。与对照组比较,乌头碱低、中、高剂量组及顺铂组HeLa细胞克隆形成数、DDX3 mRNA和蛋白、Cyclin D1、PCNA、Bcl-2蛋白表达水平依次降低(P<0.05),凋亡率、miR-181d-5p、Bax、Caspase-3蛋白表达水平依次升高(P<0.05);与乌头碱高剂量组和乌头碱高剂量+miR-NC组比较,乌头碱高剂量+miR-181d-5p低表达组HeLa细胞克隆形成数、DDX3 mRNA和蛋白、Cyclin D1、PCNA、Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.05),凋亡率、miR-181d-5p、Bax、Caspase-3蛋白表达水平降低(P<0.05);双萤光素酶报告基因检测证实miR-181d-5p与DDX3存在靶向关系。结论乌头碱可调控miR-181d-5p/DDX3轴,促进miR-181d-5p表达,抑制DDX3表达,进而抑制宫颈癌HeLa细胞增殖,促进细胞凋亡。

miR-519d-3p靶向TROAP调节Wnt/β-Catenin信号通路对非小细胞肺癌增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

目的:探究微小RNA-519d-3p(miR-519d-3p)是否靶向肌钙蛋白相关蛋白(TROAP)调节Wnt/β-Catenin信号通路影响非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭。方法:RT-qPCR评估miR-519d-3p和TROAP mRNA表达;双荧光素酶分析miR-519d-3p与TROAP之间的靶向关系;Western blotting检测TROAP、β-Catenin、Axin2、C-myc的蛋白表达;集落形成实验、流式细胞术和Transwell法检测A549细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭;BABL/c裸鼠建立移植瘤模型,检测miR-519d-3p对体内肿瘤生长的影响。结果:miR-519d-3p与TROAP存在靶向关系(P<0.05);在体外,miR-519d-3p过表达可抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡。此外,miR-519d-3p过表达可下调TROAP表达并降低β-Catenin、Axin2、C-myc蛋白水平(P<0.05);TROAP过表达对A549细胞的作用与之相反(P<0.05)。同时,过表达TROAP可部分逆转miR-519d-3p过表达对A549细胞恶性行为的影响(P<0.05)。在体内,miR-519d-3p过表达可减小肿瘤体积和肿瘤重量,且显著下调Ki67和N-cadherin表达(P<0.05)。结论:miR-519d-3p靶向TROAP抑制Wnt/β-Catenin信号通路,抑制NSCLC恶性生物学行为。

MicroRNA-519d-3p对肝星状细胞活化及凋亡的影响

目的探讨微小RNA-519d-3p(microRNA-519d-3p)对LX-2(人肝星状细胞株)活化及凋亡的影响。方法将miR-519d-3p分子模拟剂(miR-519d-3p mimics组)、抑制剂(miR-519d-3p inhibitor组)及其阴性对照物(mimics NC、inhibitor NC)转染LX-2细胞,利用实时定量PCR检测miRNA-519d-3p在转染后LX-2细胞中的相对表达量,利用实时定量PCR和Western blot检测转染后LX-2中活化标志物α平滑肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)的mRNA和蛋白的表达水平,分析miR-519d-3p对LX-2细胞活化的影响;用流式细胞术检测转染后LX-2的凋亡率,分析miR-519d-3p对LX-2细胞凋亡的影响。结果miR-519d-3p mimics组与其阴性对照组相比,α-SMA和Collagen I mRNA与蛋白表达水平均降低(P均<0.01);miR-519d-3p inhibitor组与其阴性对照组相比,α-SMA和Collagen I mRNA及蛋白表达水平均增高(P均<0.01);流式细胞术结果表明,miR-519d-3p mimics组可以促进细胞凋亡(P<0.01);miR-519d-3p inhibitor组可以抑制细胞凋亡,与阴性对照组相比差异均有统计学意义(P均<0.01)。结论miR-519d-3p具有抑制肝星状细胞活化,促进肝星状细胞凋亡,抑制肝纤维的作用。

过表达miR-519d-3p通过降低DU-145前列腺癌细胞TRAF4水平抑制其增殖

目的观察微小RNA-519d-3p(miR-519d-3p)对前列腺癌细胞增殖的影响,并探讨可能的分子机制。方法通过荧光实时定量PCR检测PC-3、DU-145、22RV1、PC-3M、LNCa P人前列腺癌细胞和RWPE-1人正常前列腺上皮细胞中miR-519d-3p的表达水平。以miR-519d-3p表达水平最低的DU-145前列腺癌细胞为转染对象,转染miR-519d-3p模拟物或阴性对照微小RNA(miR-NC)并验证转染效率。采用流式细胞术检测miR-519d-3p对前列腺癌细胞细胞周期的影响,MTT法检测前列腺癌细胞的增殖能力。生物信息学软件预测并应用双荧光素酶报告基因实验验证miR-519d-3p的靶基因。荧光实时定量PCR检测miR-519d-3p靶基因的表达水平,Western blot法检测靶基因蛋白及下游转化生长因子β(TGF-β)信号通路蛋白表达水平。结果与正常前列腺上皮细胞相比,miR-519d-3p在前列腺癌细胞的表达水平显著降低,DU-145细胞表达水平最低。DU-145细胞转染miR-519d-3p模拟物后,细胞miR-519d-3p的表达水平显著增加。过表达miR-519d-3p将前列腺癌细胞的细胞周期阻滞于G0/G1期并降低细胞的增殖能力。生物信息学预测及双荧光素酶报告基因证明肿瘤坏死因子受体相关因子4(TRAF4)为miR-519d-3p的靶基因。过表达miR-519d-3p可明显降低前列腺癌细胞中TRAF4基因及下游TGF-β信号通路蛋白的表达水平。结论 miR-519d-3p在前列腺癌细胞中低表达,过表达miR-519d-3p通过抑制TRAF4的表达抑制DU-145前列腺癌细胞的增殖。

lncRNA HOTAIR通过miR-519d-3p/CCND1分子轴促进乳腺癌SKBR3细胞的恶性生物学行为

目的:探究lncRNA HOTAIR/miR-519d-3p/CCND1分子轴对乳腺癌细胞增殖和转移的影响及其可能机制。方法:收集2017年3月至2019年2月南昌市第三医院乳腺外科手术切除的乳腺癌患者的乳腺癌组织及配对癌旁组织各50例,qPCR检测癌及癌旁组织中HOTAIR的表达水平,乳腺正常上皮细胞及乳腺癌细胞系中HOTAIR和miR-519d-3p的表达水平。将乳腺癌SKBR3细胞分为NC组、si-HOTAIR组、miR-519d-3p mimics组,miR-519d-3p mimics+pcHOTAIR组、miR-519d-3p mimics+pcCCND1组和si-HOTAIR+pcCCND1组,CCK-8法检测各组SKBR3细胞增殖能力、Transwell检测细胞侵袭和迁移能力、Western blotting检测SKBR3细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin以及CCND1表达水平。双荧光素酶报告基因检测HOTAIR和miR-519d-3p以及miR-519d-3p和CCND1的靶向关系。结果:HOTAIR在癌组织以及乳腺癌细胞系中呈高表达,且在SKBR3细胞系中表达最高。敲降HOTAIR可显著抑制SKBR3细胞增殖、侵袭和迁移,并显著增加E-cadherin的表达水平、降低N-cadherin和Vimentin的表达水平(均P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测显示,HOTAIR靶向下调miR-519d-3p的表达,miR-519d-3p靶向下调CCND1的表达。敲降HOTAIR可增强miR-519d-3p对CCND1的下调作用,抑制SKBR3细胞EMT、增殖、侵袭和迁移能力(均P<0.05)。结论:敲降HOTAIR可抑制SKBR3细胞增殖和转移,其机制是通过调控miR-519d-3p/CCND1分子轴实现的。

miR-519d-3p通过调控TLR4/NF-κB通路促进脂多糖诱导的肺上皮细胞凋亡

目的探讨miR-519d-3p对脂多糖LPS诱导的肺上皮细胞A549细胞凋亡的影响,并研究其具体作用机制。方法LPS处理A549细胞构建急性肺损伤体外细胞模型,细胞内转染miR-519d-3p拮抗剂或miR-519d-3p激动剂构建miR-519d-3p下调或者上调的细胞模型。NF-κB抑制剂Bay 11-7082预处理用来抑制细胞内NF-κB通路活性。qRT-PCR检测A549细胞内miR-519d-3p水平,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot法检测凋亡相关蛋白和TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达,细胞免疫荧光检测NF-κB p65蛋白细胞核移位情况。结果LPS处理A549细胞后,细胞内miR-519d-3p水平上升,并呈浓度依赖性;上调miR-519d-3p能够促进A549细胞凋亡,而下调则降低细胞凋亡;进一步分子机制研究表明miR-519d-3p通过影响TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达及其磷酸化,诱导NF-κB蛋白细胞核移位而影响细胞凋亡;NF-κB抑制剂可缓解miR-519d-3p上调引起的细胞凋亡。结论miR-519d-3p通过调控TLR4/NF-κB通路影响LPS诱导的肺上皮细胞凋亡。

miR-519d-3p调控TLR4抑制脂多糖所致THP-1源性巨噬细胞炎症的机制研究

目的探究miR-519d-3p在脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞炎症中的作用和分子机制。方法用PMA诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞,LPS刺激细胞产生炎症反应作为后续实验的细胞模型,应用荧光定量PCR检测miR-519d-3p表达;利用antago-miR-519d-3p及antago-NC或者miR-519d-3p mimic及mimic-NC分别转染细胞,构建细胞内miR-519d-3p低表达或者过表达THP-1巨噬细胞系,si RNA构建细胞内TLR4表达敲低模型;利用ELISA检测细胞上清液炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β分泌水平,Western blot检测各细胞系TLR4、p-p65、T-p65、p-IκBα、T-IκBα蛋白水平。结果 LPS诱导的THP-1源巨噬细胞炎症模型miR-519d-3p表达(1.85±0.10)较对照组(1.00±0.25)明显升高(P<0.05);抑制miR-519d-3p表达显著抑制细胞炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β分泌[TNF-α:(1.23±0.34)比(6.33±0.61);IL-6:(1.08±0.18)比(5.75±0.54);IL-1β:(1.17±0.23)比(4.76±0.45),P均<0.05],同时降低p-p65、p-IκBα蛋白水平。抑制miR-519d-3p能明显抑制LPS刺激的巨噬细胞TLR4表达;TLR4敲低的细胞模型研究表明,miR-519d-3p通过TLR4调节炎症反应。结论 miR-519d-3p可能通过调控TLR4表达参与LPS诱导的巨噬细胞炎症反应,进而在急性肺损伤中发挥重要作用。

LINC00087靶向miR-519d-3p对胶质瘤细胞增殖凋亡的影响

目的研究LINC00087和miR-519d-3p对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测45例胶质瘤组织和正常脑组织中lncRNA LINC00087的水平,在胶质瘤U251细胞中转染si-LINC00087和anti-miR-519d-3p以抑制LINC00087和miR-519d-3p表达,CCK8法和流式细胞术分别检测胶质瘤U251细胞存活率和凋亡率,蛋白印迹实验(Western Blot)检测细胞中Ki67和Caspase3蛋白水平,双荧光素酶报告系统验证LINC00087与miR-519d-3p的调控关系。结果与正常脑组织相比,胶质瘤组织组中的LINC00087水平显著升高(P<0.05);在胶质瘤细胞U251中抑制LINC00087可降低细胞存活率和增殖蛋白Ki67含量,提高细胞凋亡率和Caspase3蛋白表达量;LINC00087靶向负调控miR-519d-3p的表达;抑制miR-519d-3p可逆转抑制LINC00087对U251细胞增殖和凋亡的影响。结论LINC00087通过靶向miR-519d-3p调控U251细胞的增殖和凋亡。LINC00087是胶质瘤潜在分子靶点。

宫颈癌组织中lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p的表达变化及其临床意义

目的观察宫颈癌组织中长链非编码RNA同源盒基因D-反义链1(lncRNA HOXD-AS1)、微小RNA-133a-3p(miR-133a-3p)的表达变化,并探讨其临床意义。方法选取手术切除的宫颈癌及其癌旁组织各92例份,采用qRT-PCR法检测上述组织lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p,分析两指标间及其与宫颈癌临床病理参数的关系,Kaplan-Meier曲线分析不同lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表达水平宫颈癌患者术后3年总生存率,Cox回归分析法分析宫颈癌患者预后不良的影响因素。结果宫颈癌组织中lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p相对表达量分别为2.064±0.644、0.947±0.305,癌旁组织分别为1.044±0.275、1.572±0.563,两者比较,P均<0.05。宫颈癌组织中lncRNA HOXD-AS1与miR-133a-3p表达呈负相关(r=-0.663,P<0.05)。lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表达与宫颈癌FIGO分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)。lncRNA HOXD-AS1≥2.064患者(40例)和lncRNA HOXD-AS1<2.064患者(52例)术后3年总生存率分别为30.00%(12/40)、67.31%(35/52),两者比较,P<0.05;miR-133a-3p≥0.947患者(45例)和miR-133a-3p<0.947患者(47例)术后3年总生存率分别为68.89%(31/45)、34.04%(16/47),两者比较,P<0.05。多因素分析显示,FIGO分期Ⅲ~Ⅳ期、淋巴结转移、lncRNA HOXD-AS1≥2.064为宫颈癌患者预后不良独立风险因素,miR-133a-3p≥0.947为独立保护因素(P均<0.05)。结论宫颈癌组织中lncRNA HOXD-AS1表达升高,miR-133a-3p表达降低,两指标可能成为宫颈癌患者预后评估指标,lncRNA HOXD-AS1≥2.064及miR-133a-3p≥0.947时是宫颈癌患者预后不良的影响因素。

干扰lncRNA-C2orf48表达的人肝癌细胞系HepG2增殖、迁移、侵袭能力变化观察

目的 观察干扰长链非编码RNA C2orf48(lncRNA-C2orf48)表达的人肝癌细胞系HepG2增殖、迁移、侵袭能力变化,并探讨可能机制。方法 体外培养人肝癌细胞系HepG2、Huh-7和正常肝细胞系LO2,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法检测各细胞lncRNA-C2orf48相对表达量。取生长状态良好汇合率达90%的HepG2细胞,并分为3组,si-C2orf48组转染lncRNA-C2orf48沉默序列(si-C2orf48),si-NC组转染阴性对照序列(si-NC),Blank组未作处理,采用CCK-8实验测算细胞增殖率,Transwell实验分别测算细胞迁移数、穿膜数,RT-PCR法检测lncRNA-C2orf48、微小RNA 519d-3p(miR-519d-3p)、核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)RNA相对表达量。结果 与L02细胞比较,HepG2和HuH-7细胞lncRNA-C2orf48相对表达量均升高(P均<0.05),HepG2细胞升高更明显,选取HepG2细胞作为后续实验对象。与Blank组和si-NC组比较,si-C2orf48组细胞增殖率降低,细胞迁移数、穿膜数减少,lncRNA-C2orf48、RRM2 RNA相对表达量降低,miR-519d-3p RNA相对表达量升高(P均<0.05)。结论 lncRNA-C2orf48在HepG2细胞过度表达,干扰lncRNA-C2orf48可明显抑制HepG2细胞增殖、迁移、侵袭,可能机制为其可促进miR-519d-3p过度表达,导致RRM2表达下降。

长链非编码RNA HOX转录反义RNA对微小RNA-519c-3p/骨形成蛋白Ⅱ型受体调控骨关节炎进展作用及分子机制

目的探究长链非编码RNA(LncRNA)HOX转录反义RNA(HOTAIR)通过miR-519c-3p/骨形成蛋白Ⅱ型受体(BMPR2)调控骨关节炎进展的作用及分子机制。方法利用生物信息学网站ENCORI、TargetScanHuman 8.0工具分析预测LncRNA HOTAIR的下游miR-519c-3p以及靶基因BMPR2,并通过双荧光素酶报告及RIP实验验证分子间的相互结合。通过慢病毒转染将miR-519c-3p在细胞中过表达后,将构建好的软骨细胞分为NC组和miR-519c-3p过表达组(miR-519c-3p组)。两组细胞分别应用CCK-8检测、蛋白质印迹、实时荧光定量聚合酶链反应、酶联免疫吸附试验等检测探究LncRNA HOTAIR/miR-519c-3p/BMPR2轴对人软骨细胞骨关节炎的进展的影响。结果与NC组比较,miR-519c-3p组细胞生长变慢,降解酶[降基质金属蛋白酶(MMP)3、MMP9、MMP13、含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAMTS)4和ADAMTS5]和促炎因子(白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α)水平显著降低,而COL2A1和SOX9水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。此外,LncRNA HOTAIR可结合miR-519c-3p,并且BMPR2是miR-519c-3p的下游靶基因,回补实验证实LncRNA HOTAIR可通过miR-519c-3p/BMPR2轴调控人软骨细胞生长、降解酶以及促炎因子的分泌。结论LncRNA HOTAIR可通过miR-519c-3p/BMPR2轴调控骨关节炎的进展。

miR-181d-5p对宫颈癌细胞放射敏感性的影响及机制

目的探讨微小RNA-181d-5p(miR-181d-5p)对宫颈癌细胞放射敏感性的影响及机制。方法X射线照射构建放疗抵抗的宫颈癌细胞株HeLa-X,qRT-PCR法检测人宫颈癌细胞SiHa、HeLa、C33A、HCC-94、HeLa、HeLa-X及人正常宫颈上皮细胞HCerEpic中miR-181d-5p表达,使用Lipofectamine^(TM)2000试剂盒对HeLa-X细胞进行转染,分别转染miR-181d-5p模拟物阴性对照、miR-181d-5p模拟物、DDX3 siRNA阴性对照、DDX3 siRNA、DDX3 siRNA和miR-181d-5p抑制物阴性对照、DDX3 siRNA和miR-181d-5p抑制物序列5μL,并用4 GyX射线照射处理,将细胞随机分为空白组、4 Gy组、4 Gy+miR-NC组、4 Gy+miR-181d-5p mimics组、4 Gy+si-NC组、4 Gy+si-DDX3组、4 Gy+si-DDX3+anti-miR-NC组、4 Gy+si-DDX3+anti-miR-181d-5p组,CCK-8法检测各组细胞增殖情况;流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;双荧光素酶报告基因检测实验验证miR-181d-5p与DEAD盒多肽3(DDX3)的靶向关系;Westernblot⁃ting法检测各组细胞中DDX3蛋白表达。结果miR-181d-5p在人宫颈癌细胞SiHa、HeLa、C33A、HCC-94、HeLa中的表达低于人正常宫颈上皮细胞HCerEpic,且HeLa表达最低(P均<0.05);与HeLa细胞比较,HeLa-X细胞中miR-181d-5p表达降低(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验证实DDX3为miR-181d-5p的靶基因,且miR-181d-5p靶向负调控DDX3表达;与空白组比较,4 Gy组HeLa-X细胞OD_(450)值、DDX3蛋白表达降低、细胞凋亡率升高(P均<0.05);与4 Gy组和4 Gy+miR-NC组比较,4 Gy+miR-181d-5p mimics组细胞OD_(450)值降低、细胞凋亡率升高(P均<0.05);与4 Gy组和4 Gy+si-NC组比较,4 Gy+si-DDX3组HeLa-X细胞中DDX3蛋白表达、细胞OD_(450)值降低,细胞凋亡率升高(P均<0.05);与4 Gy+si-DDX3组和4 Gy+si-DDX3+anti-miR-NC组比较,4 Gy+si-DDX3+anti-miR-181d-5p组HeLa-X细胞中DDX3蛋白表达、细胞OD_(450)值升高,细胞凋亡率降低(P均<0.05)。结论miR-181d-5p在宫颈癌细胞中低表达,过表达miR-181d-5p通过靶向下调DDX3表达,进而增强HeLa-X细胞的放射敏感性。

微小RNA-519d-3p靶向DCAF4L2抑制结直肠癌增殖、迁移和侵袭

目的探讨微小RNA-519d-3p(miR-519d-3p)在结直肠癌(CRC)中的表达及对增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法体外培养人结直肠癌细胞系和人正常结肠上皮细胞。将miR-519d-3p模拟物(mimic)分别转染于RKO及SW620,同时设置mimic阴性对照(mimic NC)。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-519d-3p表达及DCAF4L2 mRNA表达水平。细胞计数试剂盒(CCK-8)和平板克隆实验检测细胞增殖活性。划痕愈合实验、Transwell迁移和侵袭实验检测细胞迁移及侵袭能力。蛋白质印迹法(Western blot)检测DCAF4L2蛋白表达水平。符合正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用两样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果miR-519d-3p在人结直肠癌细胞系中显著下降,其中RKO和SW620表达倍数明显低于NCM460[RKO:(0.311±0.165)倍比1.000倍,t=7.783,P<0.05;SW620:(0.354±0.079)倍比1.000倍,t=15.72,P<0.01],差异有统计学意义。成功转染mimic过表达miR-519d-3p,过表达组表达倍数高于对照组[RKO:(2.913±0.602)倍比1.000倍,t=5.409,P<0.01;SW620:(3.194±0.427)倍比1.000倍,t=8.765,P<0.001],差异有统计学意义。通过生物学功能实验证实miR-519d-3p表达升高能显著抑制CRC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。CCK-8检测结果示,过表达组24、48、72、96 h细胞吸光度值低于对照组(RKO:0.248±0.018比0.184±0.012、0.388±0.007比0.277±0.010、0.658±0.033比0.496±0.008、0.877±0.020比0.681±0.021,t=3.064,P<0.01;SW620:0.213±0.018比0.181±0.050、0.375±0.008比0.274±0.014、0.720±0.009比0.482±0.006、0.978±0.115比0.721±0.032,t=2.432,P<0.01),差异有统计学意义。过表达组平板克隆集落形成个数显著低于对照组[RKO:(262.300±11.320)个比(181.700±2.333)个,t=7.127,P<0.05;SW620:(448.000±33.260)个比(190.300±7.446)个,t=9.387,P<0.05],差异有统计学意义。过表达组划痕愈合率低于对照组[RKO:(39.040±0.812)%比(8.979±0.846)%,t=394.900,P<0.01;SW620:(28.840±0.848)%比(5.576±1.435)%,t=21.350,P<0.01],差异有统计学意义。Transwell迁移和侵袭实验中过表达组穿透微孔膜的细胞个数明显低于对照组,迁移实验[RKO:(196.700±6.360)个比(93.330±4.096)个,t=44.290,P<0.01;SW620:(198.300±4.485)个比(101.300±1.764)个,t=16.090,P<0.01],差异有统计学意义;侵袭实验[RKO:(274.700±3.844)个比(85.670±2.728)个,t=33.950,P<0.01;SW620:(263.300±6.566)个比(70.330±4.256)个,t=50.980,P<0.01],差异有统计学意义。在线预测软件(miRWalk、StarBase 2.0和TCGA)预测,并通过qRT-PCR及Western blot验证结果显示,DCAF4L2作为miR-519d-3p靶基因调控CRC,过表达组DCAF4L2的mRNA表达及蛋白表达倍数明显低于对照组,mRNA表达倍数[RKO:(0.170±0.050)倍比1.000倍,t=18.400,P<0.01;SW620:(0.256±0.069)倍比1.000倍,t=26.800,P<0.01],差异有统计学意义;蛋白倍数[RKO:(45.504±6.076)%比100.000%,t=15.540,P<0.01;SW620:(43.567±3.760)%比100.000%,t=26.000,P<0.01],差异有统计学意义。结论结直肠癌细胞中miR-519d-3p表达显著下降,并通过调控DCAF4L2表达抑制结直肠癌增殖、迁移及侵袭能力。