微小RNA-520g、微小RNA-532在80例多发性骨髓瘤骨髓组织中的表达

目的观察多发性骨髓瘤病人骨髓组织中微小RNA-520g(miR-520g)和微小RNA-532(miR-532)的表达,并探讨其临床意义。方法选取2015年7月至2019年7月西安市中心医院收治的多发性骨髓瘤病人80例为观察组,同时选取同期进行骨髓穿刺并明确骨髓功能无异常的非血液病病人80例为对照组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测两组骨髓组织中miR-520g、miR-532的表达水平;分析两者与多发性骨髓瘤临床病理特征的关系;采用Pearson法分析miR-520g、miR-532表达的相关性;通过受试者工作特征曲线(ROC)检测miR-520g、miR-532的表达对多发性骨髓瘤的诊断价值。结果观察组病人骨髓组织中miR-520g表达水平(3.70±0.70)均显著高于对照组(2.79±0.65),观察组miR-532表达水平(0.90±0.24)显著低于对照组(1.32±0.31)(P<0.05)。观察组病人骨髓组织中miR-520g、miR-532表达水平与病人临床分期、分化程度、是否发生淋巴结转移相关(P<0.05)。ROC结果显示miR-520g诊断多发性骨髓瘤曲线下面积(AUC)为0.827,敏感度为73.8%,特异性为80.0%,miR-532诊断多发性骨髓瘤的AUC为0.855,敏感度为82.5%,特异性为75.0%,二者联合诊断多发性骨髓瘤的AUC为0.922,敏感度为81.3%,特异性为91.2%。结论多发性骨髓瘤病人骨髓组织中miR-520g呈高表达,miR-532呈低表达,两者呈负相关,且与临床分期、分化程度、是否发生淋巴结转移相关,骨髓组织miR-520g、miR-532表达对多发性骨髓瘤具有一定的诊断价值。

血清微小RNA-520g、微小RNA-520h预测硼替佐米初治多发性骨髓瘤早期反应性价值研究

目的探讨血清微小RNA(miR)-520g、miR-520h水平在预测硼替佐米(BTZ)初治多发性骨髓瘤(MM)患者早期治疗反应性的价值。方法选取自2016年1月至2020年7月收治的122例初诊为MM的患者设为MM组,同时,选取50例健康志愿者设为健康组。MM患者均接受BTZ为基础的一线治疗方案,并根据患者早期治疗反应性分为敏感组(n=78)与难治组(n=44)。收集MM患者年龄、性别、治疗方案、治疗周期、血红蛋白、白蛋白、血肌酐、修订的国际分期系统分期及染色体17P缺失情况等临床资料。采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测健康组与MM组患者血清miR-520g、miR-520h水平。采用多因素Logistic回归模型分析MM患者BTZ早期治疗反应性的影响因素。采用和受试者工作特征(ROC)曲线分析血清miR-520g、miR-520h对BTZ初治MM患者早期反应性的预测价值。结果MM组血清miR-520g、miR-520h表达水平低于健康组,差异有统计学意义(P<0.05)。敏感组与难治组患者患者年龄、染色体17P缺失发生率、修订的国际分期系统分期及血清miR-520g、miR-520h表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归模型分析结果显示,血清miR-520g>0.765、miR-520h>0.685是影响MM患者BTZ治疗早期反应性的独立保护因素(P<0.05)。血清miR-520g、miR-520h联合预测BTZ初治MM早期反应性的AUC高于两项指标单独预测,差异有统计学意义(Z=3.463、2.778,P<0.05)。结论血清miR-520g、miR-520h表达水平越高,MM患者接受BTZ初治的早期反应性越好。检测血清miR-520g、miR-520h水平可预测BTZ初治MM患者的早期反应性,具有一定临床研究价值。

微小RNA-520e对非小细胞肺癌细胞侵袭迁移和JAK1/STAT3信号通路的影响

目的探讨微小RNA-520e(miR-520e)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞侵袭迁移和Janus激酶1(JAK1)/信号转导和转录激活因子3(STAT3)信号通路的影响。方法采用实时定量PCR(QPCR)检测人肺上皮细胞BEAS-2B和NSCLC细胞株H1299、H1975、H1650、A549的miR-520e水平;体外常规培养A549细胞并采用脂质体分别转染模拟物(过表达组)和阴性对照序列(NC组),以仅经脂质体处理的细胞为对照组。采用QPCR、活细胞计数CCK-8、划痕实验和Transwell实验检测miR-520e和含锌指和BTB结构域7A(ZBTB7A)水平、增殖活力、划痕愈合率和穿膜细胞数,Western blotting检测基质金属蛋白酶(MMP)-9、磷酸化JAK1(p-JAK1)和磷酸化STAT3(p-STAT3)水平;双荧光素酶报告基因系统联合荧光素酶报告质粒psiCHECK-2验证miR-520e与ZBTB7A的靶向关系。结果与正常细胞相比,NSCLC细胞的miR-520e水平降低,其中A549细胞最低,差异有统计学意义(P<0.05)。过表达组的miR-520e水平为19.562±1.448,高于对照组的1.002±0.057和NC组的1.053±0.082,ZBTB7A水平为0.173±0.026,低于对照组的1.109±0.091和NC组的1.076±0.136,差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组和NC组相比,过表达组转染36、48 h后的增殖活力及转染48 h后的MMP-9、p-JAK1和p-STAT3水平均降低(P<0.05)。过表达组的划痕愈合率和穿膜细胞数分别为(23.618±3.684)%和(51.644±7.069)个,低于对照组的(57.089±4.569)%和(152.269±12.833)个及NC组的(59.267±5.671)%和(149.075±11.239)个(P<0.05)。MiR-520e模拟物与携带野生型ZBTB7A 3’端非翻译区的psiCHECK-2载体共转染细胞的相对荧光强度降低(P<0.05)。结论 miR-520e在NSCLC细胞中表达下调且可能通过靶向ZBTB7A降低JAK1/STAT3信号通路活性来抑制NSCLC细胞的增殖、侵袭和迁移。

微小RNA-520a-5p通过靶向调控鼠双微体基因影响胶质瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭

目的探讨微小RNA-520a-5p(miR-520a-5p)在胶质瘤发生发展中的作用和机制。方法选取2016年5月至2018年11月在宝鸡高新人民医院治疗的胶质瘤病人肿瘤组织作56例为研究对象。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测56例胶质瘤组织和56例正常脑组织中miR-520a-5p表达水平。体外培养胶质瘤U251细胞,转染miR模拟对照序列(miR-NC)、miR-520a-5p9模拟物(miR-520a-5p mimics)至U251细胞,分别采用四甲基噻唑蓝染色法(MTT)、流式细胞仪、Transwell和蛋白质印迹法检测过表达miR-520a-5p对U251细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭及细胞中鼠双微体基因(MDM2)、细胞周期蛋白D1(cyclinD1)、P21、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白表达的影响。双萤光素酶报告基因实验验证miR-520a-5p与MDM2靶向关系,蛋白质印迹法检测转染miR-520a-5p mimics、miR-520a-5p抑制剂(anti-miR-520a-5p)对U251细胞中MDM2蛋白表达的影响。共转染miR-520a-5p mimics和MDM2过表达载体(pcD⁃NA3.1-MDM2)至U251细胞,上述相同方法观察过表达MDM2能否逆转过表达miR-520a-5p对U251细胞增殖、迁移和侵袭及相关蛋白表达的影响。结果与正常脑组织相比,胶质瘤组织中miR-520a-5p表达降低(P<0.05)。与转染miR-NC的U251细胞比较,转染miR-520a-5p mimics的U251细胞24 h、48 h和72 h的OD值[(0.36±0.04)比(0.50±0.05)、(0.49±0.05)比(0.95±0.09)、(0.71±0.07)比(1.36±0.13)]、迁移细胞数[(67±6.26)比(144±13.38)]、侵袭细胞数[(59±5.47)比(135±13.12)]均降低(P<0.05),凋亡率[(21.17±2.06)%比(7.82±0.77)%]升高(P<0.05),细胞中cyclinD1、Bcl-2和MMP-2的蛋白表达水平均降低(P<0.05),而P21、Bax和E-cadherin的蛋白表达水平均升高(P<0.05)。miR-520a-5p可与MDM2的3’UTR靶向结合,同时转染miR-520a-5p mimics的U251细胞中MDM2蛋白水平显著低于转染miR-NC的细胞,而转染anti-miR-520a-5p的U251细胞中MDM2的蛋白水平显著高于转染anti-miR-NC的细胞。与共转染miR-520a-5p mimics与pcDNA3.1的U251细胞比较,共转染miR-520a-5p mim⁃ics与pcDNA3.1-MDM2的U251细胞24 h、48 h和72 h的OD值、迁移细胞数、侵袭细胞数均升高(P<0.05),凋亡率降低(P<0.05),细胞中cyclinD1、Bcl-2和MMP-2的蛋白表达水平均升高(P<0.05),而P21、Bax和E-cadherin的蛋白表达水平均降低(P<0.05)。结论miR-520a-5p在胶质瘤组织中表达降低,过表达miR-520a-5p可能通过靶向负调控MDM2抑制胶质瘤U251细胞增殖、迁移和侵袭,并诱导其凋亡。

上调微小RNA-520a对胃癌细胞恶性生物学行为和放射增敏性的影响及相关机制

目的探讨上调微小RNA-520a(miR-520a)对胃癌细胞恶性生物学行为和放射增敏性的影响及相关机制。方法将胃癌MGC-803细胞分为空白组、上调组、下调组,空白组加入常规细胞培养液,下调组给予转染p-Genesil,上调组给予转染p-Genesil-miR-520a。鉴定各组细胞转染情况,并检测细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭能力以及Janus激酶3(JAK3)/信号转导及转录激活因子3(STAT3)信号通路蛋白表达量。各组细胞在转染结束后,接受一定剂量的X线照射,观察细胞集落形成情况,并计算平均致死量(D0)、2 Gy剂量X线照射下的细胞存活分数(SF2)和放射增敏比(SER)。结果转染48 h后,上调组miR-520a表达量高于空白组,下调组miR-520a表达量低于空白组及上调组(均P<0.05)。稳定转染后24 h、48 h、72 h,上调组细胞增殖率低于空白组及下调组,下调组细胞增殖率高于空白组;72 h后,上调组及下调组细胞凋亡率均高于空白组,且上调组高于下调组(均P<0.05)。上调组细胞迁移、侵袭数少于空白组及下调组,但下调组细胞迁移、侵袭数多于空白组(均P<0.05)。上调组SF2值、D0值和SER大于空白组及下调组,下调组SF2值、D0值和SER小于空白组(均P<0.05)。上调组JAK3、STAT3、磷酸化JAK3、磷酸化STAT3蛋白表达量均低于空白组及下调组,下调组JAK3、STAT3、磷酸化JAK3、磷酸化STAT3蛋白表达量均高于空白组(均P<0.05)。结论上调miR-520a表达水平可以抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭,促进细胞凋亡,并可增强细胞的放射增敏性,其可能通过影响JAK3/STAT3信号通路的表达发挥作用。

微小RNA-520e通过调控锌指蛋白367抑制肺癌A549细胞的迁移和侵袭

目的探讨微小RNA-520e（miR-520e）对肺癌细胞株A549细胞迁移和侵袭的影响及其分子机制。方法采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测肺癌细胞A549和正常肺上皮细胞BEAS-2B中miR-520e的表达差异，转染miR-520e模拟物（miR-520e mimics）获得miR-520e过表达细胞株，迁移实验及Transwell实验检测miR-520e对A549细胞迁移和侵袭的影响。生物信息学预测miR-520e靶向锌指蛋白367（ZNF367）基因，通过双荧光素酶报告体系进行验证。Western blot检测miR-520e过表达对ZNF367蛋白表达的影响，采用小干扰RNA（siRNA）研究ZNF367对A549细胞迁移和侵袭的影响。结果RT-PCR结果显示，相对于BEAS-2B细胞（1.000±0.135），A549细胞中miR-520e表达量为0.342±0.214（P=0.000）。转染miR-520e mimic后，相对空白对照（NC）组（1.000±0.273），mimic组miR-520e过表达（2.617±0.124，P=0.000）。划痕培养24 h后，与NC组[（100.000±12.347）%]相比，mimic组细胞迁移率为[（43.727±16.746）%]，scramble组细胞迁移率为[（91.722±7.631）%]，过表达miR-520e抑制肺癌细胞迁移（P=0.000）。侵袭实验结果显示，mimic组发生侵袭的细胞数[（36.458±21.301）%]与miR-520e scramble组[（93.783±9.125）%]和NC组[（100.000±15.114）%]比较减少（P=0.000）。荧光素酶报告基因结果显示，转染miR-520e mimics抑制荧光素酶的活性（0.374±0.241，P=0.000）。RT-PCR和Western blot发现miR-520e mimics下调ZNF367的表达（0.426±0.153, P=0.000；0.368 ±0.127，P=0.000）。进一步实验发现，miR-520e靶向ZNF367基因调控肺癌细胞的迁移和侵袭。结论miR-520e通过调控ZNF367抑制肺癌A549细胞的迁移和侵袭。

MiRNA-520e对HeLa细胞FOXL2基因的靶向调控作用及细胞迁移增殖的影响

目的探讨miRNA-520e对人宫颈癌HeLa细胞FOXL2基因的调控作用及对细胞迁移、增殖的影响。方法应用生物信息学分析软件(Target Scan Human 7.1)预测miRNA-520e可能结合于FOXL2 mRNA 3'UTR端,以HeLa细胞作为试验研究对象,将细胞随机分为阴性对照组(加入无关序列NC Fam mimics)、正常对照组(不加任何干预)、miRNA-520e组(加入miRNA-520e mimics)。运用脂质体法通过Lipofectamine 3000 Reagent将各miRNA mimics转染各组HeLa细胞,48 h后通过实时荧光定量PCR及Western blotting法检测FOXL2 mRNA及蛋白表达;转染24 h后采用细胞划痕试验检测细胞迁移能力,使用ACEA xCELLigence RTCA DP细胞分析仪检测细胞增殖能力。结果 miRNA-520e组HeLa细胞FOXL2 mRNA和蛋白的表达量较正常对照组及阴性对照组降低,且miRNA-520e组细胞的迁移和增殖能力较正常对照组及阴性对照组增强(P均<0.05)。结论 miRNA-520e可抑制HeLa细胞FOXL2 mRNA和蛋白的表达,促进细胞迁移和增殖。

胶质瘤组织和胶质瘤干细胞miR-520f-3p表达及临床意义

目的探讨胶质瘤组织和胶质瘤干细胞(CSCs)miR-520f-3p表达及临床意义。方法采用qRT-PCR法检测miR-520f-3p在40例份胶质瘤组织和20例份脑组织中的表达,并分析胶质瘤组织中miR-520f-3p表达与患者临床病理特征的关系。磁珠分选胶质瘤细胞系U87中的CSCs。Western blotting法检测OCT4、Nanog、SOX2干性标志蛋白在CSCs中的表达;miR-520f-3p在CSCs中的表达;经脂质体分别转染对照NC和miR-520f-3p inhibitor,并分为NC组和miR-520f-3p inhibitor组,MTS法检测各组CSCs增殖能力,Transwell实验检测各组CSCs转移能力。采用Targetscan 7.1预测软件预测miR-520f-3p的靶基因。qRT-PCR法检测miR-520f-3p对CSCs中癌症亮氨酸拉链下调因子1(LDOC1)mRNA表达的影响。结果qRT-PCR结果显示,miR-520f-3p在胶质瘤组织中的表达高于正常脑组织,其高表达与肿瘤直径及WHO分级有关(P均<0.05)。OCT4、Nanog、SOX2干细胞标志物在CSCs中表达显著上调;miR-520f-3p在CSCs中的表达高于胶质瘤细胞U87(P<0.05);转染miR-520f-3p inhibitor后,CSCs细胞增殖和转移能力均下降(P均<0.05)。TargetScan7.1预测软件和双荧光素酶报告基因试验证实LDOC1为miR-520f-3p的靶基因,miR-520f-3p inhibitor组LDOC1 mRNA表达增加(P<0.05)。结论miR-520f-3p在胶质瘤组织和CSCs中均呈高表达,且高表达与肿瘤直径及WHO分级有关;miR-520f-3p可能通过负调控LDOC1增加CSCs的干性。

结肠癌组织中miR-520a、RAB22A表达变化及意义

目的观察结肠癌组织中微小RNA(miRNA)-520a和RAB22A的表达变化,并探讨其意义。方法选择77例结肠癌患者,术中分别切取癌组织及其癌旁正常组织。采用荧光实时定量PCR技术检测组织中的miR-520a和RAB22A,分析两指标与结肠癌患者临床病理参数的关系,并分析两者的相关性。结果结肠癌组织及其癌旁正常组织中miR-520a的相对表达量分别为0.56±0.22、1.61±0.53,RAB22A的相对表达量分别为4.12±1.46、1.33±0.54,两者比较P均<0.01。结肠癌组织中miR-520a和RAB22A的表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移以及TNM分期有关(P均<0.05)。结肠癌组织中miR-520a的表达和RAB22A的表达呈负相关(r=-0.756,P<0.01)。结论结肠癌组织中RAB22A表达升高,而miR-520a表达降低,二者可能与结肠癌进展有关。

冠心病病人外周血单个核细胞中USP22、miR-520b表达与冠状动脉CTA钙化积分的相关性分析

目的:探讨冠心病(CHD)病人外周血单个核细胞(PBMC)中泛素特异性蛋白酶22(USP22)、微小RNA(miR)-520b表达与冠状动脉CTA钙化积分(CACS)的相关性。方法:以110例CHD病人为CHD组,同期健康志愿者为对照组,采集外周血测定PBMC中USP22、miR-520b表达水平。CHD组根据CACS分级标准分为:无冠状动脉钙化(CAC)组(20例)、少CAC组(16例)、轻CAC组(23例)、中CAC组(29例)、重CAC组(22例)。比较各组USP22、miR-520b表达水平差异,分析CHD病人发生CAC的影响因素。Pearson系数分析USP22、miR-520b表达水平与CACS的相关性。结果:CHD组USP22表达水平(1.87±0.28)显著高于对照组(1.12±0.16)(P<0.01),miR-520b表达水平(0.64±0.12)低于对照组(1.06±0.15)(P<0.01)。CHD组不同钙化程度分组间:USP22表达水平符合无CAC组<少CAC组<轻CAC组<中CAC组<重CAC组(P<0.01),miR-520b表达水平符合无CAC组>少CAC组>轻CAC组>中CAC组>重CAC组(P<0.01)。CHD组PBMC中USP22表达水平与CACS呈正相关关系(r=0.560,P<0.01),miR-520b表达水平与CACS呈负相关关系(r=-0.593,P<0.01)。随着冠状动脉病变支数增加,USP22表达水平升高,miR-520b表达水平降低(P<0.01)。PBMC中USP22、miR-520b是影响CHD病人发生CAC的相关因素(P<0.01和P<0.05)。结论:CHD病人PBMC中USP22表达水平升高,miR-520b表达水平降低,且与CAC存在显著相关性,并对临床预测CHD病人CAC有一定参考价值。

唑来膦酸对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制

目的研究唑来膦酸对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并探讨其作用机制。方法将对照组(未做任何处理)、唑来膦酸(ZOL)组(50μmol/L唑来膦酸处理)、miR-con组(转染miR-con)、miR-520a-3p组(转染miR-520a-3p mimics)、ZOL+anti-miR-con组(转染anti-miR-con再用唑来膦酸处理)、ZOL+anti-miR-520a-3p组(转染anti-miR-520a-3p再用唑来膦酸处理),均用脂质体法转染至人骨肉瘤细胞(HOS);MTT法检测各组细胞的增殖;Transwell法检测各组细胞的迁移、侵袭;实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测各组细胞中miR-520a-3p的表达;蛋白质印迹法(Westernblotting)检测各组细胞中T细胞特异性转录因子7(TCF7)的蛋白表达。双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞的荧光活性。结果与对照组相比,ZOL组HOS细胞的吸光度[(1.05±0.11)比(0.73±0.07)]、迁移细胞数[(86.49±9.17)个比(31.67±4.29)个]、侵袭细胞数[(64.17±7.72)个比(17.82±3.19)个]显著降低,miR-520a-3p的表达明显下调(P<0.05);过表达miR-520a-3p可升高HOS细胞的吸光度[(1.09±0.12)比(0.68±0.09)]、迁移细胞数[(88.49±9.17)个比(35.76±5.14)个]、侵袭细胞数[(64.17±7.72)个比(19.48±4.27)个];TCF7是miR-520a-3p的靶标。抑制miR-520a-3p可逆转ZOL对HOS细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用,且可部分逆转ZOL对HOS细胞中TCF7表达的抑制作用。结论唑来膦酸可能通过调控miR-520a-3p/TCF7轴抑制骨肉瘤HOS细胞的增殖、迁移和侵袭。

miR-520通过靶向调节BAMBI抑制肝星状细胞增殖的研究

目的:研究微小RNA-520(miR-520)对肝硬化过程中肝星状细胞增殖的影响及其作用机制。方法:采用CCl_4法建立大鼠肝硬化模型,实时荧光定量PCR法检测肝脏组织中miR-520及骨形态发生蛋白(BMP)和其激活素膜结合抑制剂(BAMBI)的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测miR-520模拟物及抑制剂对肝星状细胞HSC-T6增殖的影响,双荧光素酶报告基因法检测miR-520与BAMBI的靶向关系,蛋白质印迹法检测miR-520抑制剂转染后BAMBI、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)、转化生长因子β1(TGF-β1)、哺乳动物类似基因(Smad)3和Smad7的表达。结果:在大鼠肝硬化模型中,miR-520表达显著上升,BAMBI表达显著下降。MiR-520抑制剂可显著抑制HSC-T6细胞的增殖,miR-520模拟物作用则反之。而且miR-520模拟物转染可显著降低荧光素酶报告基因的荧光强度(P<0.05)。蛋白质印迹结果表明,miR-520抑制剂可显著增加BAMBI和Smad7的表达,降低α-SMA、COL-1、TGF-β1、Smad3的表达。结论:miR-520抑制剂通过靶向上调BAMBI的表达,抑制TGF-β/Smad信号通路,进而抑制HSC-T6细胞的增殖,并且可能对肝硬化起到缓解作用。