长链非编码RNA H19靶向微小RNA-675对结肠癌细胞增殖的影响及其机制

目的观察长链非编码RNA(lncRNA)H19靶向微小RNA(miRNA,miR)-675/EHZ2对结肠癌细胞增殖的影响。方法收集2013年7月到2018年7月郑州大学附属肿瘤医院结肠癌组织及其对应的癌旁组织各150例,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析LINC00052和miR-330-3p表达水平。待细胞完全贴壁后,采用lncRNAH19 shRNA、lncRNA control shRNA、miRNA Control和miR-675慢病毒感染SW480细胞,感染12 h更换含嘌呤霉素(1 mg/L)的杜尔伯科改良伊格尔(DMEM)培养基处理24 h,存活的细胞即为稳定细胞株,分别命名为Lnc Control组、lncRNAH19 KD组、miR-Control组和miR-675组。采用生物信息学和双荧光素酶报告基因分析lncRNAH19和miR-675关系以及miR-675的靶基因。在结肠癌细胞株SW480建立lncRNAH19沉默细胞株和miR-765过表达细胞株,采用5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(EdU)法和细胞计数试剂盒(CCK-8)法测定不同处理结肠癌细胞的增殖能力。体内异体移植瘤实验分析不同处理对成瘤的影响。采用t检验分析两组数据的统计学意义。结果与癌旁组织lncRNAH19和miR-675[(1.12±0.18)、(1.09±0.17)]比较,结肠癌组织中lncRNAH19表达水平(3.49±0.27)显著增加,miR-675表达水平(0.32±0.11)显著下调,差异均有统计学意义(t=3.109、2.981,P<0.05)。与Lnc-Contrtol组和miR-Control组结肠癌细胞EdU阳性率[(89.44±10.25)%、(85.41±12.33)%]比较,lncRNAH19 KD组和miR-675组结肠癌细胞EdU阳性率[(30.14±6.89)%、(41.72±8.32)%]显著下调,差异有统计学意义(t=2.981、2.981,P<0.05)。CCK-8实验显示,与Lnc-Contrtol组和miR-Control组结肠癌细胞增殖能力比较,lncRNAH19 KD组和miR-675组结肠癌细胞能力显著下调,差异有统计学意义(F=2.441、2.592,P<0.05)。与Lnc-Contrtol组和miR-Control组结肠癌细胞体内增殖能力比较,lncRNAH19 KD组和miR-675组结肠癌细胞能力显著下调,差异有统计学意义(F=1.980、2.019,P<0.05)。生物信息学和双荧光素酶分析显示lncRNAH19能与miR-675互补结合,EHZ2是miR-675的靶蛋白。与Lnc-Contrtol组和miR-Control组结肠癌细胞EHZ2蛋白表达水平[(1.19±0.13)、(1.04±0.14)]比较,lncRNAH19 KD组和miR-675组结肠癌细胞EHZ2蛋白表达水平[(0.32±0.13)、(0.47±0.13)]显著下调,差异有统计学意义(t=3.109、3.011,P<0.05)。结论lncRNAH19通过靶向miR-675/EHZ2调控结肠癌细胞的增殖。

石蒜碱对胃癌AGS细胞恶性生物学行为的影响及机制研究

目的探讨石蒜碱对胃癌AGS细胞恶性生物学行为的影响并初步探讨其可能的作用机制。方法用不同浓度的盐酸石蒜碱(LH)(0μmol/L、0.015μmol/L、0.0625μmol/L、0.25μmol/L、1μmol/L、4μmol/L、16μmol/L)干预AGS细胞0 h、24 h和48 h,采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)试验计算干预48 h时药物半数抑制浓度(IC50),以确定后续试验的LH浓度。将AGS细胞分为对照组(0.1%二甲基亚砜处理)、LH-L组(0.125μmol/L LH处理)、LH-M组(0.5μmol/L LH处理),LH-H组(2μmol/L LH处理),以及微小RNA(miRNA)-675-nc组(转染慢病毒空白载体)、miRNA-675-mimic组(转染慢病毒miRNA-675过表达载体)和LH+miRNA-675-mimic组(转染慢病毒miRNA-675过表达载体+2μmol/L LH处理)。应用CCK-8试验、平板克隆试验、细胞划痕愈合试验和Transwell试验分别检测各组细胞的增殖、迁移和侵袭能力;应用实时荧光定量PCR检测miRNA-675和糖原合成酶激酶(GSK)-3βmRNA的相对表达水平;应用蛋白质印迹法检测GSK-3β和β-联蛋白(β-catenin)蛋白相对表达水平。结果在0.015~16μmol/L范围内,LH可时间-浓度依赖地抑制AGS细胞的增殖能力(P<0.05),干预48 h时,药物IC50为(0.81±0.13)μmol/L。对照组、LH-L组、LH-M组、LH-H组干预14 d后细胞克隆数,干预24 h、48 h后划痕愈合率,干预24 h后侵袭细胞数、迁移细胞数,干预48 h后miRNA-675相对表达水平均依次降低;干预48 h后LH-M组细胞的GSK-3βmRNA相对表达水平高于对照组,LH-H组细胞的GSK-3βmRNA相对表达水平高于对照组、LH-L组、LH-M组;干预48 h后LH-M组GSK-3β蛋白相对表达水平高于对照组,LH-H组GSK-3β蛋白相对表达水平高于对照组和LH-L组;干预48 h后LH-H组β-catenin蛋白相对表达水平低于对照组和LH-L组(均P<0.05)。miRNA-675-mimic组的光密度值(48 h)、细胞克隆数(14 d)、细胞侵袭数(24 h)、细胞迁移数(24 h)、β-catenin蛋白相对表达水平(48 h)均高于miRNA-675-nc组、LH+miRNA-675-mimic组;miRNA-675-mimic组GSK-3β蛋白相对表达水平(48 h)低于miRNA-675-nc组、LH+miRNA-675-mimic组(均P<0.05)。结论石蒜碱能有效地抑制胃癌AGS细胞增殖、侵袭和迁移能力,该作用可能通过调控miRNA-675/GSK-3β/β-catenin轴实现。

微小RNA675在胃癌组织的表达对胃癌生物学行为的影响

目的观察胃癌正常组织与癌组织中微小RNA(miRNA,miR)-675的表达及其对患者预后的影响,检测miR-675对胃腺癌细胞株(SGC-7901)生物学行为的影响,探讨miR-675在胃癌发生发展中的作用。方法下载肿瘤基因图谱(TCGA)胃癌数据库中miRNA数据并分析miR-675在胃癌的癌及癌旁组织中的表达水平及对患者预后的影响。采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测30对胃癌组织与癌旁组织miR-675的表达水平。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)试剂盒检测miR-675抑制剂(inhibitor)对SGC-7901细胞增殖能力的影响。采用流式细胞术检测miR-675抑制剂对SGC-7901细胞凋亡的影响。应用SPSS17.0统计软件分析,计量资料以均值±标准差(Mean±SD)表示。生存分析采用Kaplan-Meier方法。采用单因素方差分析呈正态分布且方差齐的多组间差异比较样本,两组独立样本均值比较采用t检验。结果TCGA数据库中及收集的胃癌患者miR-675在癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织(3.78±0.10比2.66±0.23,t=3.236,P<0.01),差异有统计学意义。miR-675高表达患者其中位生存期显著低于miR-675低表达患者(675d比1294d,χ^2=7.711,P<0.01),差异有统计学意义。CCK-8实验显示与空白对照及转染miRNA无关序列(miR-scramble)组比较,miR-675抑制剂组SGC-7901细胞增殖能力受到抑制(t=3.875,P<0.01),差异有统计学意义。流式细胞术结果显示miR-675抑制剂组显著增加SGC-7901细胞的凋亡(18.13±3.39)%。结论miR-675在胃癌的发生、发展中发挥重要作用。

LncRNA H19/miRNA-675通路在疾病中的研究进展

长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)及微小RNA(micro-RNA,miRNA)均为蛋白质非编码RNA(non-coding RNA,NcRNAs),作为重要的调控分子参与生命活动的不同过程。其中lncRNA H19及其衍生物miRNA-675能够参与多种疾病的发生发展,现将近几年有关lncRNA H19和miRNA-675在一些疾病中的研究进行综述。

长链非编码RNA H19对促进甲状腺癌转移的影响

目的 观察长链非编码RNA（lncRNA） H19在甲状腺癌的进展过程中的影响.方法 侵袭小室实验和划痕实验检测H19 RNA表达对甲状腺癌侵袭和迁移的影响;荧光酶素实验和Western blot分析H19/微小RNA （miR）-675/钙黏素13 （CDH13）途径在甲状腺癌中的作用.结果 通过小干扰RNA （siRNA）干扰H19 RNA能够阻断甲状腺癌细胞的侵袭（迁移倍数分别为0.44±0.11、1.01 ±0.22和0.51±0.15、1.00 ±0.16,P＜0.01）.H19 RNA与miR-675表达水平呈正相关,H19RNA减少阻断了miR-675的表达（相对表达量分别为0.39 ±0.09和0.52 ±0.14,P＜ 0.05）.Western blot分析和荧光酶素实验结果显示miR-675通过与CDH13基因的3＇端非编码区域（3＇-UTR）结合,调控CDH13的表达.结论 H19 RNA通过提供miR-675,结合于CDH13基因,阻断CDH13表达,进而促进甲状腺癌细胞的侵袭和迁移能力.