LncRNA DGUOK-AS1调控miR-204-5p对肝癌细胞MHCC97-H增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响

目的 探讨长链非编码RNA(LncRNA)脱氧鸟苷激酶反义RNA(DGUOK-AS)1调控miR-204-5p对肝癌细胞MHCC97-H增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响。方法 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)分析肝癌组织中DGUOK-AS1和miR-204-5p表达量。双荧光素酶报告实验确定DGUOK-AS1与miR-204-5p靶向关系,RT-qPCR检测干扰DGUOK-AS1表达后MHCC97-H细胞miR-204-5p表达量。集落形成实验分析DGUOK-AS1和miR-204-5p表达对MHCC97-H细胞增殖的影响。流式细胞仪分析细胞周期分布和凋亡。Transwell实验分析细胞迁移和侵袭。结果 与癌旁组织比较,肝癌组织中DGUOK-AS1表达量明显上调,而miR-204-5p表达量明显下调(P<0.05)。miR-204-5p是DGUOK-AS1的靶基因。干扰DGUOK-AS1表达后miR-204-5p表达量显著升高(P<0.05)。干扰DGUOK-AS1表达后MHCC97-H细胞克隆形成数、迁移和侵袭细胞数、S期细胞比例显著降低,细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。与干扰DGUOK-AS1表达比较,同时干扰DGUOK-AS1和miR-204-5p表达后MHCC97-H细胞克隆形成数、迁移和侵袭细胞数、S期细胞比例显著升高,细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。结论 干扰DGUOK-AS1通过靶向miR-204-5p可抑制肝癌细胞MHCC97-H增殖、迁移和侵袭,并诱导细胞凋亡。

微小RNA204(miR-204)低表达与肝细胞癌预后不良相关

目的研究微小RNA204(mi R-204)在肝细胞癌中的表达及与预后的关系和可能机制。方法选择50例肝细胞癌患者,收集手术切除后的肝癌细胞以及肝癌旁组织,采用定时定量PCR检测肝细胞癌组织及癌旁组织mi R-204的表达,以mi R-204表达水平中位数为分界点,观察mi R-204的表达与肝细胞癌患者临床病理特征的关系。采用免疫组织化学染色检测Bcl2及SIRT1(sirtuin 1)蛋白的表达,合成mi R-204转染SMMC-7721肝癌细胞,MTT法检测细胞增殖,采用PCR检测SMMC-7721细胞的SIRT1与Bcl2 m RNA的水平。结果 HCC组织mi R-204水平显著降低;与mi R-204低表达的患者相比,mi R-204高表达的患者瘤体直径较小(在5 cm)、肿瘤数少、TNM分期较低,与患者年龄、性别、乙型肝炎病毒(HBV)感染情况无关;mi R-204低表达组中Bcl2及SIRT1蛋白水平显著高于mi R-204高表达组,mi R-204与Bcl2及SIRT1的水平呈负相关;mi R-204转染SMMC-7721细胞后,过表达mi R-204的SMMC-7721细胞SIRT1与Bcl2 m RNA水平不仅显著低于转染阴性对照mi RNA的细胞,也显著低于癌旁肝组织SIRT1与Bcl2 m RNA水平;与阴性对照组相比,转染mi R-204的SMMC-7721细胞的增殖能力明显降低。结论 mi R-204低表达肝细胞癌预后不良相关,上调其表达可下调SIRT1、Bcl2水平,抑制肝癌细胞增殖、促进细胞凋亡。

食管鳞癌中miR-204、miR-205相关ceRNA网络构建及部分lncRNA功能分析

目的用生物信息学方法预测食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)组织中miR-204、miR-205相关竞争性内源RNA(ceRNA)网络。方法通过TCGA数据库筛选癌及癌旁组织差异表达的mRNA、长链非编码RNA(lncRNA)和miRNA,构建miR-204、miR-205相关ceRNA网络,并对筛选出的差异基因进行生存分析,利用GO、KEGG和PPI进一步分相关lncRNA的功能。结果以log FC>2且P<0.05为标准,筛选出和miR-204、miR-205相关差异表达mRNA 13个,lncRNA 38个,并构建了lncRNA-miRNA-mRNA调控网络。LINC00504、FER1L6-AS1与亚洲人ESCC患者生存相关。GO、KEGG和PPI分析显示:7个同时调节miR-204、miR-205的lncRNA可能参与ESCC的形成和进展。结论通过分析ESCC转录组测序数据,预测出以miR-204和miR-205为节点的调控网络,可能是ESCC重要的调控机制和诊疗靶点。

胃腺癌中ceRNA网络的构建和miR-204-5p、HOXC8基因的表达及其相关性检测

目的:构建胃腺癌竞争性内源RNA(ceRNA)网络,并观察miR-204-5p和HOXC8 mRNA之间的相关性。方法:利用生物信息学方法和TCGA转录组数据库筛选胃腺癌差异基因,构建ceRNA网络,检测了miR-204-5p和HOXC8 mRNA在胃腺癌组织和SGC7901细胞株中的表达,并分析了两基因间的相互关系。结果:成功构建胃腺癌ceRNA网络,miR-204-5p是重要节点基因,并预测到其靶基因HOXC8;在32例胃腺癌中检测到miR-204-5p低表达,HOXC8高表达,两者呈负相关关系;上调胃腺癌SGC7901细胞中miR-204-5p的表达可以抑制HOXC8 mRNA的表达。结论:miR-204-5p和HOXC8可能是潜在的胃腺癌诊断指标,两者可能存在ceRNA调控关系。

微小RNA204在人肾透明细胞癌中的表达及临床意义

目的研究微小RNA204(miR-204)在人肾透明细胞癌(RCCC)中的表达及临床意义。方法收集泌尿外科行手术切除的RCCC及对应癌旁正常肾脏组织标本共65例,运用qRT-PCR技术检测miR-204在RCCC及癌旁组织中的表达水平,统计分析miR-204表达水平与患者临床病理资料间的相关性;采用人工合成的miR-204模拟物转染人RCCCCaki-1细胞,分别采用qRT-PCR及Western-Blot检测转染后miR-204下游潜在靶点Bcl-2及SIRT1 mRNA及蛋白的表达变化。结果miR-204在RCCC组织中表达水平显著低于对应癌旁正常肾组织(P<0.05);miR-204低表达与肿瘤体积增大(>3cm,P<0.05)、肿瘤淋巴结转移(P<0.05)及高TNM分期(Ⅲ+Ⅳ期,P<0.05)显著相关;miR-204转染人RCCCCaki-1细胞后可显著降低细胞内Bcl-2及SIRT1mRNA及蛋白的表达水平(P<0.05)。结论 miR-204在RCCC组织中表达下调并与肿瘤恶性临床病理特征有关,miR-204可能通过下调Bcl-2及SIRT1的表达来抑制RCCC的发生、发展过程。

微小RNA⁃204⁃3p通过靶向调控Krüppel样因子6对高糖诱导小鼠足细胞损伤的保护作用

目的探讨微小RNA⁃204⁃3p(miR⁃204⁃3p)对高糖诱导小鼠足细胞MPC5损伤的保护作用及其分子机制。方法采用高糖(30 mmol/L D⁃葡萄糖)处理MPC5细胞。实时定量PCR(qPCR)检测细胞中miR⁃204⁃3p与锌指蛋白Krüppel样因子6(KLF6)mRNA水平。MPC5细胞分为NG组(正常对照),HG组(高糖刺激),HG+miR⁃204⁃3p组、HG+miR⁃NC组、HG+si⁃KLF6组、HG+si⁃NC组,HG+miR⁃204⁃3p+pcDNA⁃KLF6组和HG+miR⁃204⁃3p+pcDNA组。蛋白质印迹法(Western Blot)检测肌动蛋白微丝偶联蛋白(synaptopodin)、结蛋白(desmin)、B细胞淋巴瘤/白血病⁃2(Bcl⁃2)、Bcl⁃2相关X蛋白(Bax)与活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved⁃caspase⁃3)蛋白表达,流式细胞仪检测细胞凋亡,生物学信息预测和双荧光素酶报告基因分析miR⁃204⁃3p和KLF6的靶向关系。结果与正常对照相比,高糖可显著降低MPC5细胞中miR⁃204⁃3p表达量[(0.41±0.04)比(1.02±0.08)],上调KLF6 mRNA[(2.86±0.27)比(1.03±0.08)]和蛋白[(0.89±0.08)比(0.46±0.04)]水平,还可上调KLF6、desmin[(0.81±0.07)比(0.34±0.03)]、Bax、cleaved⁃caspase⁃3蛋白表达及细胞凋亡率[(22.46±2.08)%比(5.26±0.64)%],下调synaptopodin蛋白[(0.34±0.03)比(0.76±0.07)]及Bcl⁃2蛋白表达量(P<0.05)。与HG+miR⁃NC组比较,HG+miR⁃204⁃3p组明显提高synaptopodin[(0.67±0.06)比(0.32±0.03)]及Bcl⁃2蛋白水平,降低desmin[(0.41±0.04)比(0.83±0.08)]、Bax、cleaved⁃caspase⁃3蛋白水平及细胞凋亡率[(11.25±1.65)%比(24.58±2.47)%](P<0.05)。与HG+si⁃NC组比较,HG+si⁃KLF6组明显提高synaptopodin[(0.62±0.06)比(0.28±0.03)]及Bcl⁃2蛋白水平,降低desmin[(0.49±0.05)比(0.86±0.08)]、Bax蛋白水平及细胞凋亡率[(14.69±1.87)%比(25.47±2.68)%](P<0.05)。miR⁃204⁃3p直接靶向KLF6。与HG+miR⁃204⁃3p+pcDNA组比较,HG+miR⁃204⁃3p+pcDNA⁃KLF6组显著增加高糖刺激小鼠肾脏足MPC5细胞中KLF6、desmin[(0.68±0.06)比(0.36±0.04)]、Bax蛋白表达量和细胞凋亡率[(18.41±1.67)%比(11.05±1.02)%],显著减少synaptopodin蛋白[(0.38±0.03)比(0.69±0.07)]和Bcl⁃2蛋白表达量(P<0.05)。结论miR⁃204⁃3p通过直接靶向KLF6抑制高糖刺激的足细胞凋亡,保护细胞损伤。

抑制lncRNA LUCAT1表达通过靶向调控miR-204-3p减轻高糖诱导的心肌H9c2细胞损伤

目的:探讨敲减长链非编码RNA肺癌相关转录本1(LUCAT1)表达减轻高糖(HG)诱导的心肌H9c2细胞损伤是否与其靶向调控微小RNA-204-3p(miR-204-3p)表达有关。方法:将体外培养的大鼠心肌H9c2细胞分为对照组、HG组、HG+siRNA-NC组、HG+siRNA-LUCAT1组、HG+siRNA-LUCAT1+inhibitor-NC组和HG+siR⁃NA-LUCAT1+miR-204-3p inhibitor组,采用生物信息学软件预测和双萤光素酶报告基因实验验证LUCAT1和miR-204-3p的靶向关系,RT-qPCR法检测细胞中LUCAT1和miR-204-3p的表达水平,CCK-8实验检测细胞活力,乳酸脱氨酶(LDH)试剂盒检测LDH漏出量,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中Bcl-2和Bax蛋白的表达水平,比色法检测超氧化物岐化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量。结果:生物信息学软件预测到LUCAT1和miR-204-3p之间存在互补的结合位点,双萤光素酶报告基因实验证实LUCAT1可与miR-204-3p靶向结合。与对照组比较,HG刺激后H9c2细胞中LUCAT1表达水平、LDH漏出量、细胞凋亡率、细胞中Bax蛋白表达水平和MDA含量均明显升高,而细胞中miR-204-3p表达水平、细胞活力、细胞中Bcl-2蛋白的表达水平及SOD和GSH-Px活性均明显降低(P<0.05)。与HG组比较,转染siRNA-LUCAT1可明显逆转HG引起的上述变化(P<0.05),但转染siRNA-NC对H9c2细胞无明显影响(P>0.05);与HG+siRNA-LUCAT1组比较,转染inhibitor-NC后H9c2细胞各指标无明显改变(P>0.05),但转染miR-204-3p inhibitor可明显逆转siRNA-LUCAT1对H9c2细胞的作用(P<0.05)。结论:抑制LUCAT1表达可通过靶向调控miR-204-3p表达抑制心肌H9c2细胞的凋亡和氧化应激,减轻HG诱导的心肌H9c2细胞损伤。

lncRNA MALAT1调控miR-204表达影响胰腺癌细胞的生物学行为

目的:探讨长链非编码RNA(long chain non-coding RNA,lnc RNA)肺腺癌转移相关转录因子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)通过调控miR-204的表达影响胰腺癌细胞恶性生物学行为的作用及其可能机制。方法:收集2016年10月至2016年12月在河南省中医院6例胰腺癌手术切除标本及其对应的癌旁组织标本。用实时荧光定量PCR检测胰腺癌组织和癌旁组织、5种胰腺癌细胞(Bx PC-3、HS-7667、PANC-1、As PC-1和SW-1990)中lnc RNA MALAT1的表达,双荧光素酶报告基因检测MALAT1与miR-204的相互作用,流式细胞术分析MALAT-1对胰腺癌细胞的细胞周期及细胞凋亡的影响;划痕愈合实验和Transwell侵袭实验检测MALAT1和miR-204对胰腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响,Western blotting检测MALAT1对上皮间质转化相关蛋白的影响。结果:lnc RNA MALAT1在胰腺癌组织中表达水平明显高于癌旁组织(1.85±0.52vs 0.34±0.12,P<0.05),MALAT1在SW-1990细胞中的表达水平最高(P<0.05)。lnc RNA MALAT1能与miR-204的3’UTR特异性结合,调控miR-204的表达活性。抑制MALAT1表达后,可诱导SW-1990细胞G2/M细胞周期停滞、促进细胞凋亡,SW-1990细胞的迁移和侵袭能力减弱(均P<0.05),下调SW-1990细胞N-cadherin、E-cadherin和vimentin的表达。过表达miR-204可促进SW-1990细胞迁移和侵袭。结论:lnc RNA MALAT1通过靶向调控miR-204表达影响胰腺癌细胞的恶性生物学行为,在胰腺癌的发生发展过程中起重要作用。

长链非编码RNA LINC00483抑制miR-204-3p对结直肠癌细胞侵袭转移的实验研究

目的探讨长链非编码RNA LINC00483能否通过抑制miR-204-3p表达的方式促进结直肠癌细胞侵袭转移。方法qRT-PCR法检测长链非编码RNA LINC00483及miR-204-3p在结直肠癌组织及细胞系HT29和LOVO中的表达;考察不同LINC00483及miR-204-3p表达水平分别与结直肠癌患者临床病理参数的相关性;在HT29及LOVO中分别转染特异性LINC00483干扰寡核苷酸(siLINC00483)以下调其表达;qRT-PCR法检测下调LINC00483后HT29及LOVO细胞内miR-204-3p表达变化,Transwell实验检测HT29及LOVO细胞侵袭转移能力的变化;共转染siLINC00483及miR-204-3p inhibitor,Transwell实验再次检测HT29及LOVO细胞侵袭转移能力的变化。结果相比于癌旁组织和正常肠上皮细胞系NCM460,LINC00483在结直肠癌组织及细胞系中表达增高而miR-204-3p表达降低(P<0.01);高表达的LINC00483和低表达的miR-204-3p均与结直肠癌患者的不良病理参数密切相关(P<0.01);下调LINC00483可明显抑制HT29和LOVO细胞中miR-204-3p的表达并抑制其侵袭转移(P<0.01);相比于单独转染siLINC00483,共转染siLINC00483及miR-204-3p inhibitor后,HT29及LOVO细胞的侵袭转移能力明显增加(P<0.01)。结论LINC00483在结直肠癌中表达增高且可通过抑制miR-204-3p的方式促进结直肠癌细胞侵袭转移。

环状RNA KMT2E靶向miR-204-5p/MMP9轴对高糖条件下人晶状体上皮细胞凋亡的影响

目的探究环状RNA KMT2E(circ KMT2E)对高糖(HG)诱导的人晶状体上皮细胞(LEC)凋亡的影响及调控机制。方法收集自2018年12月至2020年11月在海南医学院第二附属医院眼科中心进行白内障手术的33例非糖尿病性白内障(DC)患者和33例DC患者的晶状体前囊膜,TUNEL法检测晶状体前囊膜上LEC凋亡率,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测晶状体前囊膜中circ KMT2E、miR-204-5p和基质金属蛋白酶(MMP)9 mRNA表达水平,采用Pearson法分析circ KMT2E、miR-204-5p和MMP9 mRNA表达水平的相关性。取人晶状体上皮细胞系(HLE-B3),CCK-8法筛选最佳HG浓度及作用时间;将HLE-B3细胞分为对照组、HG组、沉默对照组、KMT2E沉默组、过表达对照组、KMT2E过表达组、KMT2E过表达+miR-NC组、KMT2E过表达+miR-204-5p模拟物组,转染后将HLE-B3细胞用HG处理24 h。RT-qPCR检测各组细胞中circ KMT2E、miR-204-5p和MMP9 mRNA表达水平,验证转染效果;CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;Western印迹检测细胞中MMP9、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved Caspase)-3蛋白表达;双荧光素酶报告基因检测circ KMT2E与miR-204-5p的靶向关系。结果与非DC患者相比,DC患者晶状体前囊膜中LEC凋亡、circ KMT2E、MMP9 mRNA表达水平显著升高,miR-204-5p水平显著降低(P<0.05);Pearson相关分析显示,DC患者晶状体前囊膜中circ KMT2E与miR-204-5p呈负相关,MMP9与miR-204-5p呈负相关,MMP9与circ KMT2E呈正相关。200 mmol/L葡萄糖作用24 h时可显著抑制HLE-B3细胞活力(P<0.05)。转染后,与对照组相比,HG组细胞中circ KMT2E、MMP9 mRNA和蛋白表达水平、细胞凋亡率、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达显著升高,miR-204-5p水平、细胞活力、Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05);与HG组相比,KMT2E沉默组细胞中circ KMT2E、MMP9 mRNA和蛋白表达水平、细胞凋亡率、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达显著降低,miR-204-5p水平、细胞活力、Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05),KMT2E过表达组上述指标变化则表现出相反的作用(P<0.05);在过表达KMT2E的基础上,上调miR-204-5p,可降低MMP-9表达,明显逆转circ KMT2E过表达对HLE-B3细胞凋亡的影响。双荧光素酶报告基因检测结果显示,转染miR-204-5p mimic后,KMT2E-WT细胞的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。结论沉默circ KMT2E可能通过靶向上调miR-204-5p,进而抑制MMP9的表达,减少HG诱导的人LEC凋亡。

MiR-204对角膜上皮细胞增生的抑制作用

背景作为人角膜上皮组织的主要细胞成分，角膜上皮细胞通过迁移、增生以及分化等生物学行为在角膜上皮组织的损伤修复中发挥重要作用。微小RNA（miRNA）是内源性表达的单链非编码RNA，参与多种生物活动的调控过程，研究报道miR-204在正常角膜上皮组织内呈高表达，但其生物学功能仍不清楚。目的研究miR-204对角膜上皮细胞增生的调控及其分子机制。方法收集角膜屈光手术过程中患者脱落的角膜上皮组织，同时体外培养人角膜上皮细胞株（HCECs）。采用实时荧光定量PCR技术分别检测角膜上皮组织和HCECs中miR-204的表达情况。将培养的HCECs分为3个组，分别用含miR-204mimic的脂质体或空脂质体转染到HCECs内作为miR-204mimic转染组和阳性对照组，正常培养的细胞作为正常对照组。用平板克隆形成试验检测各组培养细胞的克隆数以评价细胞的增生能力；采用流式细胞仪检测不同细胞周期的细胞百分比；采用Westernblot技术检测各组细胞中磷酸化细胞内细胞周期相关蛋白p-RB、转录因子E2F1、p27、细胞周期蛋白CyclinA、细胞周期蛋白依赖性激酶CDC2、磷酸化CDC2（p-CDC2）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK2）的表达情况。结果miR-204mRNA在正常人角膜上皮组织中的相对表达量为1．077±0．268，明显高于HCECs中的0．041±0．018，差异有统计学意义（t=7．700，P〈0．001）。平板克隆形成试验显示miR-204mimic转染组细胞克隆数明显少于阳性对照组和空白对照组。流式细胞仪检测结果显示，miR-204mimic转染组G1期细胞百分比为47．75％，明显高于阳性对照组的37．23％和空白对照组的40．72％。Westernblot检测表明，miR-204mimic转染组细胞中CDK2和p-CDC2蛋白的相对表达量明显低于阳性对照组，E2F1和P27蛋白的相对表达量明显高于阳性对照组，差异均有统计学意义（t=5．39、10．65、14．87、25．11，均P〈0．01）。结论正常的角膜上皮组织中miR-204的高表达可能参与角膜上皮细胞的非增生状态的维持。miR-204可上调E2F1和p27蛋白在HCECs中的表达，抑制复合物CDK2／Cyclin A和P-CDC2／CyelinA的形成，使角膜上皮细胞停滞在G1期，从而抑制角膜上皮细胞的增生。

miR-204靶向SDF1/CXCR4通路调控非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡及侵袭

目的 探讨miR-204靶向基质细胞衍生因子(SDF1)/CXCR4通路调控非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、凋亡及侵袭的机制。方法 将A549细胞随机分为对照组、miR-204 mimic组、miR-204 inhibitor组,通过转染来抑制或过表达miR-204,分别对各组细胞的生物学行为进行检测,通过双荧光素酶报告来验证miR-204与SDF1/CXCR4的靶向关系。结果 miR-204 mimic组细胞的miR-204水平和凋亡率显著高于对照组,增殖、侵袭、SDF1和CXCR4蛋白水平显著低于对照组(P<0.05);miR-204 inhibitor组细胞的miR-204水平和凋亡率显著低于对照组,增殖、侵袭、SDF1和CXCR4蛋白水平显著高于对照组(P<0.05);双荧光素酶报告实验结果显示miR-204和SDF1/CXCR4之间存在靶向结合。结论 miR-204可能通过靶向SDF1/CXCR4通路抑制NSCLC细胞的增殖和侵袭,并促进凋亡。

胃癌患者血清中miR-204水平变化及与幽门螺杆菌感染的关系

幽门螺杆菌（Hp）感染已经被国际癌症研究机构列为第一类癌病致病原。目前大量研究已证实Hp感染与胃癌发生、发展密切相关,但具体机制尚不清楚。微小RNA（miRNA）是一种单链RNA,目前研究认为其具有非编码性和高度保守性。Calin研究发现有超过半数的miRNA的基因所在区域与肿瘤有关,

急性冠脉综合征患者血浆外泌体NEAT1,miR-204和MMP-9的表达水平及临床意义

目的检验急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)患者血浆外泌体富含核富集的转录物1(Nucleraenriched autosomal transcript,NEAT1),微小核糖核酸(microRNA,miR)-204和基质金属蛋白酶(metalloproteinase,MMP)-9的表达水平,并研究其对ACS的诊断价值,分析其与冠脉病变严重程度的相关性。方法选取2020年5月~2021年5月于首都医科大学附属北京世纪坛医院诊断为ACS的120例患者作为实验组,其中急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)患者72例,不稳定心绞痛(unstable angina,UA)患者48例;另选取行冠脉造影检查无明显狭窄的108例体检者作为Control组。提取所有研究对象的血浆外泌体,并采用透射电镜和Western blot鉴定该外泌体。应用试剂盒提取血浆外泌体总RNA,采用qRT-PCR法检测外泌体NEAT1和miR-204的表达水平,采用Western blot检测外泌体MMP-9蛋白表达水平。应用Pearson相关分析明确外泌体NEAT1,miR-204和MMP-9水平与病变严重程度评分(Gensini评分)之间的相关性。Logistic回归模型判断外泌体NEAT1,miR-204和MMP-9是否可作为诊断ACS的独立危险因素。绘制受试者工作特征(ROC)曲线,根据曲线下面积(AUC)分析三者表达水平对ACS病变严重程度的预测价值。结果透射电镜观察到,血浆外泌体呈椭圆形双层膜囊泡结构,Western blot结果显示,CD63和CD81蛋白在外泌体中呈高表达。Control组NEAT1,miR-204和MMP-9表达水平分别为0.62±0.08,1.02±0.20和0.97±0.15,UA组患者NEAT1,miR-204表达水平分别为0.65±0.11,1.05±0.18,与Control组比较差异无统计学意义(t=2.790,3.225,P>0.05),而MMP-9表达水平(1.15±0.20)较Control组明显升高,差异有统计学意义(t=13.682,P<0.05);AMI组患者血浆外泌体NEAT1,miR-204和MMP-9表达水平分别为0.98±0.15,1.22±0.23和1.37±0.25,较Control组明显升高,差异均有统计学意义(t=12.112,9.885,21.530,均P<0.05)。Pearson相关性分析显示,AMI患者外泌体NEAT1,MMP-9与Gensini评分呈中度正相关,miR-204与Gensini评分呈弱正相关,差异有统计学意义(r=0.179~0.548,均P<0.05)。UA患者外泌体NEAT1与Gensini评分呈弱正相关(r=0.207,P=0.032),MMP-9与Gensini评分呈中度正相关(r=0.574,P<0.05),但miR-204与Gensini评分无相关性(r=0.108,P=0.465)。Logistic回归分析结果显示,外泌体NEAT1,miR-204和MMP-9均可作为AMI预测的独立危险因素,但外泌体miR-204不可作为预测UA的独立危险因素。ROC结果显示,AMI组外泌体NEAT1,miR-204和MMP-9水平及联合检测对应AUC分别为0.821,0.702,0.750和0.905,UA组外泌体NEAT1,miR-204和MMP-9水平及联合检测对应AUC分别为0.776,0.682,0.718和0.883,三者对AMI的诊断价值均高于UA,且联合检测具有更高诊断价值。结论血浆外泌体NEAT1,miR-204和MMP-9具有预测冠状动脉病变严重程度的潜力,并且三者联合检测对AMI具有较高诊断价值,可作为辅助诊断AMI的潜在标志物。

抑制HPV18型E7蛋白的表达对Hela细胞生物学特性及miR-204表达的影响

目的通过小干扰RNA(siRNA)抑制宫颈癌Hela细胞中人乳头瘤病毒(HPV)18型E7的表达,研究E7蛋白对Hela细胞的生物学特性和miR-204表达的影响和关系,探索HPV致癌的分子机制。方法设计合成靶向HPV18型E7基因的siRNA,转染Hela细胞,抑制HPV18-E7的表达;采用RT-PCR和Western blot分别检测Hela细胞中HPV18-E7的mRNA和蛋白水平,用流式细胞术检测Hela细胞的细胞周期和凋亡,通过荧光实时定量PCR检测miR-204的表达水平。结果 pRNAT-HPVE7与两个对照组比较,明显抑制了Hela细胞HPV18-E7的mRNA(t值分别为2.69、2.46,均P<0.05)和蛋白(t值分别为3.93、4.20,均P<0.05)的表达,细胞周期趋于正常,凋亡率增高(t值分别为-6.87、-6.92,均P<0.05),miR-204表达水平也明显升高(t值分别为0.26、0.22,均P<0.05)。结论抑制HPV18-E7基因的表达能改变Hela细胞的生物学特性和上调miR-204表达。

结直肠腺瘤-腺癌发展序列中差异表达miRNAs的筛选及初步验证

目的筛选及初步验证结直肠腺瘤-腺癌发展序列中差异表达的miRNA,初步探索其可能机制。方法 MicroRNA芯片检测15例结直肠腺瘤患者、3例结直肠早癌患者和3例健康对照者血清中差异表达的miRNA。在18例结直肠腺瘤,9例结直肠早癌,5例进展期癌及5例正常对照者中用实时荧光定量PCR进行初步验证。结果早癌组与腺瘤组比较,差异表达的miRNA有15个;早癌组与正常组比较,差异表达的miRNA有13个。选择miR-204、miR-193b与miR-150进行初步验证。进展期癌组血清miR-150表达显著低于正常对照组(P<0.05);早癌组、进展期癌组血清miR-204表达均显著低于正常对照组(分别为P<0.05,P<0.01)。腺瘤组、早癌组和进展期癌组血清miR-193b表达均显著低于正常对照组(分别为P<0.05、P<0.01、P<0.05)。miR-193b mimic转染HCT116细胞后显著抑制其增殖(P<0.05),促进其凋亡(P<0.001)。并可显著抑制K-ras与β-catenin蛋白的表达水平。结论血清miR-204与miR-193b可能成为诊断结直肠癌的生物标志物,miR-193b可能在腺瘤-腺癌序列中发挥抑癌作用。

微小RNA-204对前列腺癌细胞株CL1的生长调节及其机理研究

目的:探讨微小RNA(mi R)-204对前列腺癌细胞株CL1的生长调节及其机理。方法:获得mi R-204高表达的CL1稳转细胞株(CL1-mi R-204)及其阴性对照的CL1稳转细胞株(CL1-对照)后,观察其细胞生长速度,检测丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)磷酸化水平及AKT总蛋白和p27蛋白的表达,并检测磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通道抑制剂LY294002对2种细胞生长的影响。结果:mi R-204能促进CL1的生长;升高AKT在苏氨酸(T308)和丝氨酸(S473)2个位点的磷酸化水平;抑制AKT下游的靶基因p27蛋白表达水平。加入LY294002后,CL1-对照和CL1-mi R-204的生长速度都降低。但CL1-mi R-204的生长速度下降得更明显。结论:mi R-204可能是通过AKT信号通路来促进CL1的生长。

长链非编码RNA UCA1对CCND2的调控作用和对胃癌细胞增殖能力的研究

目的明确长链非编码RNA UCA1通过miR-204对CCND2的调控作用,揭示上述调控轴与胃癌细胞增殖能力的关系。方法收集浙江省金华市人民医院2016年6月-2019年6月确诊的胃癌组织及癌旁健康组织共10例,利用荧光定量PCR(qPCR)检测UCA1在组织标本中的表达情况。胃癌细胞株MNK-45及SGC-7901分别转染阴性对照siRNA(对照组)及UCA1 siRNA(UCA1敲减组)。CCK-8检测两组细胞增殖活性的变化,Western blotting分析Ki-67、PCNA及Cyclin D1的表达。胃癌细胞株MNK-45及SGC-7901分别转染阴性对照miRNA模拟物(对照组)及miR-204模拟物(miR-204过表达组),qPCR检测靶基因CCND2的表达。构建CCND2-3’UTR的荧光素报告,系统分析miR-204对CCND2的体外抑制活性。RNA免疫沉淀(RIP)实验分析UCA1、miR-204与Ago2蛋白的结合情况。胃癌细胞株MNK-45及SGC-7901分别转染UCA1过表达质粒(UCA1过表达组)、miR-204模拟物(miR-204过表达组)、UCA1与miR-204共转染(联合组)及对照组[即pcDNA3.1(+)空载体与阴性对照miRNA模拟物共转染]。CCK-8检测各组细胞增殖差异,qPCR检测各组细胞CCND2的表达。结果MNK-45及SGC-7901中UCA1敲减后细胞增殖活性高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),Ki-67、PCNA及Cyclin D1的表达均显著下调。miR-204过表达组MNK-45及SGC-7901细胞增殖活性低于与对照组(P<0.01),而UCA1过表达组细胞的增殖活性高于对照组(P<0.01),差异均有统计学意义。miR-204与UCA1联合组细胞增殖活性高于单纯miR-204过表达组,差异有统计学意义(P<0.01)。RIP实验表明,UCA1与miR-204与Ago2蛋白共结合。荧光素实验报告表明,miR-204过表达组的野生型CCND2-3’UTR荧光素活性低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),而miR-204过表达组的突变型与对照组荧光素,差异无统计学意义(P>0.05)。miR-204过表达组CCND2表达、细胞活性低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),UCA1过表达组CCND2表达、细胞增殖活性高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),联合组CCND2表达及细胞增殖活性与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论UCA1具有促胃癌细胞增殖的作用,其作用与抑制miR-204并上调其靶基因CCND2表达有关。

miR-204对乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学特性的影响

目的研究microRNA-204(miR-204)对乳腺癌细胞生物学特性的影响。方法在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中转染miR-204模拟物和抑制剂后48h,实时荧光PCR(Real-time PCR)检测细胞中miR-204表达变化。流式细胞仪分析miR-204对MDA-MB-231细胞增殖、凋亡的影响。采用Transwell迁移小室分析法检测miR-204对MDA-MB-231细胞迁移的影响。结果实时荧光PCR分析:miR-204模拟物和抑制剂效果显著,与正常对照比较差异有统计学意义(P<0.01);流式细胞仪分析:与正常对照相比,miR-204模拟物组G1期细胞数目明显减少(P<0.01),G2/M期细胞数目明显增多(P<0.01),而miR-204抑制剂的作用则相反,G1期细胞数目明显增多(P<0.01),G2/M期细胞数目明显减少(P<0.01);miR-204模拟物组明显促进细胞凋亡(P<0.01),而抑制剂组明显抑制细胞凋亡(P<0.01)。Transwell迁移小室分析:miR-204模拟物组穿过Transwell迁移小室的细胞明显减少(P<0.01),而抑制剂组则相反,细胞数目明显增多(P<0.01)。结论 miR-204对乳腺癌MDA-MB-231细胞具有负调控作用,能够抑制乳腺癌细胞增殖和迁移,促进癌细胞凋亡。

孕哺期至成年前持续氟染毒对子鼠空间学习记忆和海马病理改变及miR-204、miR-34b-5P表达的影响

[背景]过量氟可蓄积于脑组织并导致神经系统损伤。微小RNA(miRNA)可通过调控相关蛋白表达,影响学习记忆功能发挥。[目的]探讨孕哺期至成年前氟暴露对子鼠空间学习记忆和海马中miR-204、miR-34b-5P表达的影响。[方法]16只清洁级健康SD孕鼠随机分为4组,每组4只,自由饮水染毒,各组饮水中氟化钠质量浓度(后称浓度)分别为0、60、120、240 mg·L^(-1)。母鼠从妊娠第0天~子鼠出生的第21天(PND21)染毒;各组随机选8只子鼠(雌雄各4只,同一窝别雌雄比为1∶1)在PND22~PND90进行染毒。采用Morris水迷宫实验检测空间学习记忆能力。子鼠处死前收集24 h尿液,心脏采血后处死,测定尿、脑及血清氟,光镜观察海马组织病理变化;分离海马组织保存于-80℃,实时荧光定量PCR检测海马组织中miR-204、miR-34b-5P表达水平。[结果]除出生第6周低氟组外,各染毒组大鼠体重均低于对照组(P<0.05)。Morris水迷宫显示:第2、3、4天子鼠逃避潜伏期与氟化钠的染毒浓度呈正相关(r=0.443、0.519、0.840;均P<0.05);子鼠首次到达平台时间及穿越平台次数分别与氟化钠染毒浓度呈正相关与负相关(r=0.828、-0.599;均P<0.001)。60、120、240 mg·L^(-1)染毒组尿氟浓度分别为(13.08±1.60)、(14.49±1.17)、(25.92±2.38)mg·L^(-1),较对照组[(3.89±0.52)mg·L^(-1)]升高(P<0.001);各染毒组脑氟水平分别(8.20±0.68)、(16.03±0.84)、(25.39±0.62)μg·g^(-1),较对照组(1.28±0.11)μg·g^(-1)升高(P<0.001);各染毒组血清氟浓度分别为(0.04±0.00)、(0.06±0.01)、(0.16±0.12)mg·L^(-1),较对照组[(0.02±0.00)mg·L^(-1)]升高(P<0.001);染毒组子鼠尿、脑及血清氟水平均与氟化钠浓度呈正相关(r=0.948、0.996、0.914;均P<0.001)。HE染色结果显示:与对照组比较,染毒组出现海马神经元体积形态缩小,胞质颜色红染,细胞核固缩,染色加深,结构模糊和核仁消失等病理改变。中、高氟组中miR-204与各染毒组中miR-34b-5P表达水平均较对照组增高(P<0.001),miR-204与miR-34b-5P的表达水平均与氟暴露浓度呈正相关(r=0.984、0.980;均P<0.001)。[结论]持续氟暴露可损害子鼠的学习记忆能力,可能与海马组织中的mi R-204与mi R-34b-5P表达水平升高有关。