Let7a微小RNA和长链非编码RNAH19在甲状腺癌中的表达及预后预测

目的检测Let7a微小RNA(miRNA let7a)和长链非编码RNA H19(lncRNA H19)在甲状腺癌中的表达情况,探讨其与甲状腺癌临床病理特征及预后的相关性。方法收集2009-01~2012-01在我院手术的131例甲状腺癌组织和癌旁组织为病例组,另外同期选取122例甲状腺良性肿瘤的正常甲状腺组织作为对照组。采用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法检测实验组与对照组甲状腺组织中miRNA let7a和lncRNA H19的表达水平。然后进行5年的跟踪随访。通过受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)评估miRNA let7a和lncRNA H19对甲状腺癌的诊断价值。应用Kaplan-Meier方法计算5年累积生存率,预后相关单因素分析采用Log-rank检验,多因素分析采用Cox回归模型,分析miRNA let7a和lncRNA H19表达水平与甲状腺癌临床病理特征及生存预后的关系。结果与甲状腺良性肿瘤组织及癌旁组织相比,甲状腺癌组织中miRNA let7a表达下降,lncRNA H19表达升高(P<0.05)。miRNA let7a和lncRNA H19诊断甲状腺癌ROC曲线下面积(AUC)分别为0.116和0.801,诊断阈值分别为0.87和3.58,敏感度分别为84.0%和72.5%,特异度分别为77.0%和75.4%,约登指数分别为0.610和0.479。miRNA let7a低表达者和lncRNA H19高表达者5年生存率下降。miRNA let7a和lncRNA H19表达水平、肿瘤直径、TNM分期和淋巴结转移是影响甲状腺癌预后的独立风险因素(P<0.05)。结论 miRNA let7a表达水平下调和lncRNA H19表达水平上调与甲状腺癌临床病理特征及生存预后差相关,提示二者之间可能具有调控作用,并在甲状腺癌发生发展过程中有重要作用,可为甲状腺癌早期的无创诊断及治疗靶点的寻找提供重要的理论依据。

let-7a通过抑制MAP4K3/MKK4/JNK信号通路减少脑出血大鼠神经元调亡

目的:研究微小RNA let-7a对脑出血(ICH)大鼠神经元凋亡的影响及其分子机制。方法:从48只健康SD大鼠中随机选取8只作为假手术组,将2μLⅦ型胶原酶注入其余大鼠苍白球以构建ICH模型。将造模后的大鼠随机分为模型(2μL生理盐水)组、let-7a激动剂(agomir)组、阴性对照(NC)agomir组、let-7a拮抗剂(antagomir)组和NC antagomir组,每组8只,在侧脑室注射相应药物。7 d后进行神经功能评分;HE染色观察病理损伤;RT-qPCR和Western blot检测相关蛋白表达水平;TUNEL染色检测神经元凋亡情况;利用生物信息学软件预测let-7a与丝裂原活化的蛋白激酶激酶激酶激酶3(MAP4K3)的靶向关系,并在HEK293T细胞中用双萤光素酶报告基因实验进一步验证。结果:动物实验中,let-7a过表达时,神经功能评分降低,病理损伤减轻,胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)低表达,神经元凋亡减少,cleaved caspase-3和cleaved PARP低表达(P<0. 05)。细胞实验中,MAP4K3是let-7a的靶基因之一,且两者为负向调控;let-7a过表达抑制MAP4K3/MKK4/JNK的表达。结论:let-7a通过抑制MAP4K3/MKK4/JNK信号通路,减少ICH大鼠神经元凋亡。

微小RNA-7对肝癌HepG2细胞增殖和侵袭能力的影响

目的探讨过表达微小RNA－7（miR－7）对肝癌HepG2细胞体外增殖和侵袭能力的影响及调控机制。方法采用实时荧光定量PCR法检测肝癌组织和癌旁正常组织中miR－7 mRNA和Raf1 mRNA的表达，分析miR－7 mRNA的表达与肝癌患者临床病理特征的关系。将肝癌HepG2细胞分为空白对照组、miR－7阴性对照组和miR－7模拟物转染组，采用脂质体转染技术将miR－7模拟物和阴性对照瞬时转染HepG2细胞，以实时荧光定量PCR法检测miR－7 mRNA的表达，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测不同时间点各组细胞的增殖活性，采用Transwell侵袭实验检测各组侵袭细胞数目。通过TargetScan在线预测miR－7作用的靶基因，采用荧光素酶报告基因实验验证miR－7对预测靶基因Raf1的3′非翻译区的靶向作用。采用Western blot法检测肝癌组织、相邻正常组织和各组细胞中Raf1蛋白的表达。采用Pearson法分析miR－7 mRNA与Raf1 mRNA表达的相关性。结果肝癌组织和相邻正常组织中miR－7 mRNA的相对表达水平分别为0.49±0.02和1.21±0.05，差异有统计学意义（P〈0.01）；miR－7 mRNA的表达水平与肿瘤大小、是否转移和预后有关（均P〈0.05）。miR－7模拟物转染组HepG2细胞中miR－7 mRNA的相对表达量为12.67±0.40，明显高于空白对照组（0.49±0.01，P〈0.01）。与空白对照组比较，转染48和72 h时，miR－7模拟物转染组的吸光度明显降低（P〈0.01），侵袭细胞数目明显减少（P〈0.01），野生型Raf1报告基因的荧光素酶活性明显降低（P〈0.01）。肝癌组织和相邻正常组织中Raf1蛋白的相对表达量分别为3.15±0.10和0.53±0.03，差异有统计学意义（P〈0.01）。miR－7阴性对照组和miR－7模拟物转染组HepG2细胞中Raf1蛋白的相对表达量分别为0.98±0.02和0.24±0.01，差异有统计学意义（P〈0.01）；肝癌组织中miR－7与Raf1的表达呈负相关（P〈0.05）。结论miR－7在肝癌组织中的表达明显降低，与肝癌患者的较差预后相关；miR－7能通过调控Raf1基因的表达抑制肝癌HepG2细胞的体外增殖和侵袭能力。

miR-let-7b对卵泡颗粒细胞发育的作用

目的:目前为止,尚不清楚micro-RNA(miR)-let-7b是否通过MAP3K1调节卵泡颗粒细胞(FGCs)凋亡,本研究拟运用PCR和Western blotting方法对此进行实验验证.方法:应用CCK-8测定细胞存活率.设计合成miR-let-7b和MAP3K1 mRNA特异性引物,利用qRT-PCR和Western Blotting分析FGCs中miR-let-7b和MAP3K1 mRNA基因与蛋白的表达水平.结果:随着miR-let-7b模拟物剂量(40、60、80、100、120μM)的增加,FGC的增殖活性逐渐降低,MIM-4组的增殖活性明显低于CG和MIM-1组(P<0.05).miR-let-7b表达水平随着模拟物剂量的增加而逐渐降低,MIM-3和MIM-4组的miR-let-7b水平低于MIM-1(P<0.05或P<0.01).MIM-3和MIM-4组MAP3K1 mRNA和蛋白水平显著低于CG,而且MIM-4组MAP3K1 mRNA和蛋白水平低于MIM-1组(P<0.05).结论:miR-let-7b可明显降低FGC增殖活性.下调FGC中miR-let-7b mRNA表达水平,miR-let-7b处理可剂量依赖性地降低MAP3K1 mRNA和蛋白质表达水平.

下调let－7微小RNA对卡波西肉瘤相关疱疹病毒裂解复制和丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶4及其下游因子的影响

目的 探讨下调let－7微小RNA（miRNA）的表达对卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）裂解复制的影响。方法 采用miRNA海绵技术抑制let－7 miRNAs的表达，脂质体法将pEGFP－C2－let－7 sponge质粒转染到BCBL－1和293T细胞中。实时荧光定量PCR法检测let－7 miRNAs的表达，丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶4（MAP4K4）、环氧合酶2（COX－2）和基质金属蛋白酶13（MMP－13）mRNA的表达以及KSHV开放读码框（ORF）50和ORF72基因DNA复制水平。Western blot法检测MAP4K4和COX－2蛋白的表达以及p38丝裂原活化蛋白激酶、细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）和c－Jun氨基末端激酶（JNK）蛋白的表达及磷酸化水平。结果 在BCBL－1细胞中，let－7 sponge组中let－7 miRNAs的相对表达水平与空载体组比较，差异均有统计学意义（均P〈0.05）；在293T细胞中，let－7 sponge组中let－7a、let－7b、let－7c、let－7d、let－7e、let－7f、let－7g和let－7i的相对表达水平与空载体组比较，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。质粒转染BCBL－1细胞48 h后，空载体组和let－7 sponge组中KSHV ORF50 DNA的相对复制水平分别为1.00±0.10和2.33±0.18，差异有统计学意义（P〈0.001）; KSHV ORF50 mRNA的相对表达水平分别为1.08±0.48和3.22±0.27，差异有统计学意义（P〈0.001）。空载体组和let－7 sponge组中KSHV ORF72 DNA的相对复制水平分别为1.07±0.49和1.67±0.45，mRNA相对表达水平分别为1.01±0.19和1.54±0.11，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。转染质粒48 h后，空载体组和let－7 sponge组中MAP4K4 mRNA的相对表达水平分别为1.00±0.05和5.73±0.96，COX－2 mRNA的相对表达水平分别为1.00±0.05和2.68±0.19，MMP－13 mRNA的相对表达水平分别为1.00±0.02和2.69±0.25，差异均有统计学意义（均P〈0.001）。let－7 sponge组与空载体组比较，MAP4K4和COX－2的蛋白表达水平也明显提高。在BCBL－1细胞中let－7 miRNAs的表达下调时，KSHV ORF50和ORF72 mRNA的表达水平增加，KSHV ORF50和ORF72 DNA的复制水平增加，MAP4K4、COX－2和MMP－13 mRNA的表达上调。在293T和BCBL－1细胞中，let－7 sponge组的ERK1/2磷酸化水平高于空载体组，但p38和JNK磷酸化水平无变化。结论 抑制细胞let－7 miRNAs的表达可激活KSHV复制，其可能是通过上调其靶基因MAP4K4的表达，上调MAP4K4下游因子COX－2和MMP－13的表达水平及ERK1/2磷酸化水平来诱发KSHV的激活，最终导致卡波西肉瘤的发生和发展。

微小RNA let-7a对基底细胞样乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的检测微小RNA(miRNA,miR)let-7a在基底细胞样乳腺癌(BLBC)细胞株中的表达,探讨miR let-7a在BLBC细胞增殖、迁移及侵袭中的作用及其机制。方法BLBC细胞株MDA-MB-468、MDA-MB-231及非BLBC细胞株MCF-7购自中国科学院上海细胞生物学研究所,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测miR let-7a在以上细胞中的表达;使用Lipofectamin™2000脂质体转染miR let-7a至BLBC,Real-time PCR证实转染成功后,通过细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测对细胞生存率的影响,通过划痕实验及Transwell实验检测对细胞迁移和侵袭能力的影响;通过蛋白质印迹法(Western blot)检测STAT3蛋白的表达。应用SPSS 16.0统计软件分析,数据以均值±标准差(Mean±SD)表示。两组比较采用t检验,多组比较采用ANOVA。结果miR let-7a在BLBC细胞株MDA-MB-468、MDA-MB-231中的表达明显低于非BLBC细胞MCF-7(0.13±0.02比1.01±0.23,t=9.690,P<0.01;0.31±0.08比1.01±0.23,t=7.270,P<0.01),差异有统计学意义;与对照组比较,过表达miR let-7a后,MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞生存率较前下降(80.80±5.60比96.80±3.54,t=4.200,P<0.01和76.42±5.62比96.00±2.83,t=5.760,P<0.01),差异有统计学意义,过表达miR let-7a后,与对照组相比,MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞的迁移(24.17±2.93比41.33±2.80,t=10.110,P<0.01和18.50±3.27比34.17±3.19,t=6.770,P<0.01)与侵袭能力(55.17±11.64比78.50±5.91,t=3.460,P<0.01和48.33±6.10比68.50±3.09,t=3.440,P<0.01)下降,差异均有统计学意义;过表达miR let-7a后,MDA-MB-468与MDA-MB-231细胞中STAT3蛋白的表达量明显降低(0.53±0.08比1.00±0.12,t=8.390,P<0.01和0.38±0.06比1.00±0.13,t=8.600,P<0.01),差异有统计学意义。结论miR let-7a在基底细胞样乳腺癌中呈低表达;上调miR let-7a的表达,可以引起基底细胞样乳腺癌的增殖和侵袭转移力下降,其机制可能是通过抑制STAT3分子相关通路实现的。

Let-7g微小RNA在甲状腺乳头状腺癌的表达及其临床意义

目的观察Let-7g微小RNA（miRNA，miR）在甲状腺乳头状腺癌组织中的表达，探讨Lin28／Let-7g轴在甲状腺乳头状腺癌中作用。方法采用实时定量聚合酶链反应（Real．timePCR）方法检测Lin28和Let-7gmiRNA在甲状腺乳头状腺癌组织中的含量，进行定量分析，并运用免疫组织化学技术检测Lin28基因产物在甲状腺乳头状腺癌中的表达水平，探讨两者与甲状腺乳头状腺癌的关系。结果免疫组织化学分析显示，Lin28蛋白在甲状腺乳头状腺癌组织呈阳性反应，其棕色效应产物定位于细胞质中，细胞核无表达；在对照组织中，Lin28在细胞质和细胞核中均无表达。在Real—timePCR中，Lin28A在37例甲状腺乳头状腺癌组织的表达为3．587±2．472，较13例甲状腺瘤组织的1．263±1．273升高（P〈0．01），Lin28B在37例甲状腺乳头状腺癌组织的表达为4．908±5．222，较13例甲状腺瘤组织的1．070±0．252升高（P〈0．01），Let-7gmiRNA在37例甲状腺乳头状腺癌组织的表达（0．8512±0．7490）较13例甲状腺瘤组织（1．7140±0．6540）降低（P〈0．01）。结论在甲状腺乳头状腺癌中Lin28上调而Let-7g下调，提示Lin28／Let-7g轴调节异常可能是甲状腺乳头状腺癌发生发展的分子调节机制之一。

室旁核微小RNA 7a-5p在自发性高血压大鼠交感神经兴奋亢进中的作用及机制

目的探讨下丘脑室旁核内微小RNA 7a-5p(miR-7a-5p)在自发性高血压大鼠(SHR)交感神经兴奋亢进中的作用及机制。方法取12周龄正常血压大鼠(WKY)和SHR各24只,分别随机分为4组,每组6只:室旁核注射miR-7a-5p-空载病毒(Null)组、过表达miR-7a-5p基因重组腺相关病毒(rAAV)+敲减miR-7a-5p基因rAAV阴性对照(miR-7a-5p+NC antimiR-7a-5p)组、过表达miR-7a-5p基因rAAV+敲减miR-7a-5p基因rAAV(miR-7a-5p+antimiR-7a-5p)组、敲减miR-7a-5p基因rAAV+过表达miR-7a-5p基因rAAV阴性对照(antimiR-7a-5p+NC miR-7a-5p)组;另取12周龄WKY大鼠和SHR各24只,分别随机分为4组,每组6只:室旁核注射γ-氨基丁酸A型受体功能性α_(1)亚基(GABRA1)-Null组、过表达GABRA1基因rAAV+敲减GABRA1基因rAAV阴性对照(GABRA1+NC siGABRA1)组、过表达GABRA1基因rAAV+敲减GABRA1基因rAAV(GABRA1+siGABRA1)组和敲减GABRA1基因rAAV+过表达GABRA1基因rAAV阴性对照(siGABRA1+NC GABRA1)组,4周后观察血流动力学指标、肾交感神经活动(RSNA)和血浆去甲肾上腺素(NE)水平变化;采用免疫荧光检测室旁核内原癌基因AP-1转录因子亚基FosB(FosB)及GABRA1阳性神经元数量;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测室旁核内miR-7a-5p和GABRA1mRNA表达水平;免疫印迹法检测室旁核内GABRA1蛋白表达量;分离培养新生Wistar大鼠原代下丘脑神经细胞和传代培养NG108神经细胞系,并转染miR-7a-5p激动剂(agomiR-7a-5p)、抑制剂(antagomiR-7a-5p)或miR-7a-5p激动剂阴性对照(NC agomiR-7a-5p),48h后检测miR-7a-5p基因表达水平和GABRA1蛋白表达量,TargetScan软件预测和双荧光素酶报告系统检测miR-7a-5p和GABRA1的靶向关系。结果室旁核注射rAAV 4周后,过表达miR-7a-5p导致WKY和SHR的RSNA增强(均P<0.05),FosB阳性神经元数量上调,GABRA1阳性神经元数量下调(均P<0.01)。室旁核过表达GABRA1导致WKY和SHR的RSNA减弱(均P<0.05)。与WKY大鼠相比,过表达或敲减miR-7a-5p/GABRA1基因对SHR的RSNA的影响更显著(均P<0.05)。与WKY大鼠相比,SHR室旁核内miR-7a-5p表达上调(2.50±0.20比1.01±0.06,t=7.11,P<0.01),GABRA1蛋白表达水平下调(0.60±0.06比1.00±0.04,t=5.31,P<0.01)。在原代下丘脑神经细胞或NG108细胞内转染agomiR-7a-5p可导致GABRA1蛋白表达下调。TargetScan预测发现,miR-7a-5p和GABRA1mRNA的3’非翻译区(3’UTR)存在序列结合,双荧光素酶报告基因证实miR-7a-5p靶向调控GABRA1基因。结论SHR室旁核内上调的miR-7a-5p可通过靶向抑制GABRA1蛋白表达引起交感神经过度兴奋,从而影响高血压的发生发展。

微小RNA let-7在子痫前期患者中的表达及相关性分析研究

目的探讨let-7基因家族microRNA let-7a、let-7d、let-7g、let-7f在产前子痫前期孕妇外周血中表达水平的差异。方法收集2017年10月至2018年11月在内蒙古自治区妇幼保健院产科就诊的子痫前期及重度子痫前期孕妇的外周血标本各50例,同时随机取健康妊娠孕妇50例作为对照组。提取外周血RNA,反转录合成cDNA,采用实时荧光定量PCR法检测基因的表达水平。结果同正常妊娠组相比,let-7a、let-7d、let-7g、let-7f在子痫前期组、重度子痫前期组中表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.01);4组基因在子痫前期组和重度子痫前期组孕妇外周血中的表达量相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论同健康妊娠组相比,let-7基因家族microRNA let-7a、let-7d、let-7g、let-7f可能与子痫前期的发病相关,有作为子痫前期预测的生物标记物的潜在价值,为日后深入研究子痫前期致病机制提供了理论依据。

let-7c调控非小细胞肺癌细胞生长和自噬的研究

目的:探讨let-7c在非小细胞肺癌细胞生长和自噬中的作用。方法:采用测序方法找寻肺癌组织中表达差异显著的miRNAs,通过RT-qPCR验证测序结果,采用细胞转染技术对非小细胞肺癌进行过表达构建,随后使用RT-qPCR检测转染效率,并经CCK8实验、Western blot实验及免疫荧光实验验证let-7c对肺癌细胞生长和自噬调控因子的影响。结果:let-7c在肺癌组织以及肺癌细胞中的表达降低,过表达let-7c不仅抑制非小细胞肺癌细胞增殖,同时还抑制非小细胞肺癌细胞自噬的发生。结论:let-7c在非小细胞肺癌中发挥抑癌基因作用,有望成为潜在的治疗靶点。