聚合酶链反应及微板杂交法对人乳头瘤病毒分型检测

目的 :为适应临床人乳头瘤病毒分型检测 ,建立了通用引物扩增 (GP -PCR)及微孔板杂交 -ELISA检测法。方法 :先进行GP -PCR ,其中一条引物 5’端标记有地高辛 ,探针标记有生物素 ,通过包被在微孔板上的亲和素预先固定 ;将扩增产物加入预先包被有HPV型特异寡核苷酸探针和HPV基因组混合探针的聚苯乙烯微孔板中 ,42℃杂交仅需 2 0～30min ;最后 ,用酶底物与所标记的酶进行显色反应 ,通过测定吸光度来判断结果。结果 :本法HPV各型之间无交叉杂交 ;杂交灵敏度比PCR -琼脂糖凝胶电泳检测高 10 0倍 ,最佳杂交时间为 2 0～ 30min ,重复性好 ,CV为 8 75 % ;6 0例子宫颈癌标本的总检出率为 92 5 % ,2 0例正常宫颈石蜡标本本法测定均为阴性。结论 :该法特异性强 ,灵敏度高 ,操作简单 ,无放射性和E .B .污染 ,杂交时间短 ,检测成本低 ,便于临床常规应用。

微孔板杂交法检测结核分枝杆菌的初步临床应用

目的 :对 PCR-微孔板杂交法的临床应用进行评价。方法 :取临床标本 2 6 8份分别进行抗酸染色、培养、PCR扩增产物电泳、PCR微孔板杂交四种方法的比较。结果 :在 2 16份临床高度怀疑有结核分枝杆菌感染的患者标本中 ,PCR-微孔板杂交法检出阳性为 98例 ,其检出率高于 PCR-电泳法 (91/ 2 18)、培养法 (81/ 2 18)和抗酸染色法(5 6 / 2 18)。5 0份临床证实无结核分枝杆菌感染的病人标本 ,四种方法均未能检出结核分枝杆菌。结论 :PCR-微孔板杂交法是高度敏感。

PCR-微孔板杂交-ELISA法检测巨细胞病毒感染

建立PCR-微孔板杂交-ELISA法检测人血清标本中巨细胞病毒DNA。将5’端标记生物素的PCR扩增产物与5’端标记地高辛的探针呈液相混合,90℃ 2min,55℃,1min杂交。杂交后产物被链霉亲和素酶标板固定,经酶标记抗地高辛标记抗体结合显色。本试剂检测灵敏度为2.5×104 copies/mL,比传统PCR和ELISA敏度性高,特异性强,与单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型,风疹病毒、EB病毒、腺病毒核酸无交叉反应,批内CV为8.9%,批间CV为10.5%。该法可用于定性和定量检测HCMV DNA。

微孔板杂交法检测肺癌端粒酶活性的研究

目的 :研究肺癌端粒酶活性及其临床应用价值。方法 :采用端粒重复序列扩增—微孔板杂交法 ,对 10 0例切除肺癌标本 ,分别取癌中央组织、癌旁 1cm、远癌组织 3块组织 ,进行端粒酶活性分析 ,同时送病理检查。结果 :端粒酶在肺癌组织中央部位的阳性检出率为 10 0 % ,癌旁 1cm为 84% ,远癌组织为 8% ,不同病理类型的肺癌端粒酶活性水平 ( A/mg蛋白 )分别为 :鳞癌 2 8例 0 .12 2 ,腺癌 6 8例 0 .12 5 ,小细胞癌 4例 0 .12 7,无显著性差异。结论 :端粒酶活性在切除肺癌标本中的测定 。

聚合酶链反应-微孔板杂交法检测结核杆菌的临床应用及其评价

目的 对聚合酶链反应 ( PCR) -微孔板杂交法检测结核杆菌的临床适用性和可行性进行评价。方法 收集 1130份临床标本 ,分别用抗酸染色、培养、PCR电泳及 PCR微孔板杂交法进行结核杆菌检测 ,并结合临床诊断和疗效观察对实验结果进行分析。结果 10 0份临床证实无结核病的体液标本经抗酸染色和 PCR电泳 ,分别有 1例和 2例假阳性 ,但经培养和 PCR微孔板杂交法未查出阳性 ;其余 10 30份高度怀疑含有结核杆菌的体液标本的检测结果 ,以 PCR微孔板杂交阳性检出例数最高 ( 481/ 10 30 ) ,其次为 PCR电泳 ( 40 6 / 10 30 )、培养 ( 36 5 /10 30 )以及抗酸染色 ( 2 5 6 / 10 30 ) ;χ2 检验结果显示 ,PCR微孔板杂交的结核杆菌阳性检出例数与其它三种方法比较均呈显著或极显著性差异 ( P<0 .0 0 83及 P<0 .0 0 17)。结论 PCR-微孔板杂交方法是特异、灵敏、准确、快速的结核杆菌检测方法 。

微板酶联夹心杂交法定量检测人IL-18 mRNA

目的 :建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的微孔板酶联夹心杂交技术 ,定量检测人IL 18mRNA。方法 :针对人IL 18mRNART PCR产物一条链的不同区域序列设计一对特异探针 ,其中一条为捕获探针 ,5’端为氨基修饰 ,可以与微量DNA结合板表面的NOS基团共价结合 ,“竖直”地包被在微孔板内 ;另一条为检测探针 ,3’端标记生物素。提取人外周血单个核细胞中总RNA ,进行RT PCR扩增IL 18mRNA ,产物热变性后加入已包被捕获探针的微孔板内进行杂交 ,再加入检测探针与已杂交的产物结合 ,最后经亲和素 辣根过氧化物酶 (SAV HRP)系统检测杂交信号。结果 :该法检测IL 18mRNART PCR产物的灵敏度明显高于琼脂糖凝胶电泳 ,重复性良好 ,且结果数据化。结论 :该方法具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优点 ,适合于PCR扩增产物的定量检测。

半巢式聚合酶链反应-微孔板杂交法检测沙眼衣原体

目的 应用半巢式聚合酶链反应 -微孔板杂交法 (半巢式PCR -MPH)检测泌尿生殖道沙眼衣原体 (Ct)。方法 分别用质粒和主要外膜蛋白基因引物进行扩增。将下游引物用生物素标记 ,经半巢式PCR扩增Ct主要外膜蛋白基因后 ,扩增产物被包被有链霉亲和素的微孔板捕获 ,经碱变性后与标有荧光素的特异性探针进行杂交。然后通过辣根酶标记的抗荧光素抗体与杂交分子反应 ,经过酶底物显色 ,通过测定吸光度来判断结果。结果 主要外膜蛋白基因引物半巢式PCR较质粒引物PCR更敏感 ,比半巢式PCR产物酶切后电泳法高 1 0倍 ,半巢式PCR -MPH法特异性强。该法重复法好 ,批内CV值 <1 0 % ,批间CV值 <1 5 % ;该法在包被浓度为 4mg L、产物 1∶2 0稀释、与微孔板结合 2 0min后加入 1 0pmol mL探针杂交 3 0min ,用 1∶3 0 0 0稀释的酶显色条件下有最佳结果。结论 该法操作简便、敏感性和特异性均高 ,无放射性和EB染料污染 ,适于临床样本的常规检测。

端粒重复扩增-微孔板杂交法检测妇科肿瘤端粒酶活性的研究

目的 :探讨妇科几种常见恶性肿瘤与端粒酶活性的关系。方法 :采用端粒重复扩增 (TRAP)扩增端粒酶产物 ,通过生物素 -亲和素将扩增产物结合于微孔板 ,并与荧光素 (FITC)标记的特异性探针杂交 ,经酶标抗荧光素抗体结合而显色。结果 :妇科恶性肿瘤端粒酶活性检出 2 5例 (89.3% ) ,而肿瘤边缘组织检出 14例 (5 0 .0 % ) ,正常对照组织检出 10例 (35 .7% )。恶性肿瘤端粒酶活性显著高于肿瘤远端组织和正常对照组织 (P<0 .0 5 )。结论 :端粒酶激活可能在妇科恶性肿瘤的发生、发展中起重要作用。 TRAP-微孔板杂交法是检测端粒酶活性灵敏而特异的一种方法。

PCR-微孔板反向杂交法在结核分枝杆菌检测中的应用

目的 评价PCR 微孔板反向杂交法检测临床标本中结核分枝杆菌 (MTB)的应用价值。方法 应用集菌涂片镜检法、培养法、PCR法、PCR 微孔板反向杂交法分别对 5 5份肺结核病患者和 30份非结核呼吸系统病患者痰标本平行检测。结果 涂片法对结核病患者临床标本中MTB检出率为 2 1.82 % ,培养法检出率为2 5 .4 6 % ,PCR法检出率 36 .36 % ,PCR 微孔板反向杂交法检出率 4 7.2 7%。对 30例非结核呼吸系统疾病患者检测MTB ,PCR法出现 2例假阳性 ,其余 3种方法均阴性 ,PCR 微孔板反向杂交法比单纯PCR法灵敏度高、特异性强。结论 PCR 微孔板反向杂交法具有简便、快速、抗污染、灵敏度高、特异性强的优点 ,缺点是存在假阴性 ,应改进标本前处理方法 ,在对结核病的辅助诊断中应与细菌学方法相结合 。

应用PCR-微孔板杂交法快速检测矽肺患者痰中结核分枝杆菌

矽肺患者是结核病的易感人群，结核能促使矽肺病变的进展，而矽肺也能影响结核产治疗效果并加剧其恶化，结核是矽肺患者最常见的并发症，也是矽肺患者主要的死亡原因之一。因此快速、早期诊断矽肺合并结核感染，对保护工人健康、降低矽肺患者的死亡率是十分必要的。

宫颈脱落细胞高危型人乳头状病毒核酸扩增微板杂交捕获检测的临床意义

目的:探讨核酸扩增(PCR)微板杂交捕获检测宫颈脱落细胞内高危型人乳头状病毒(HPV)感染的临床意义,建立快速、灵敏的检测方法。方法:采用PCR微板杂交捕获检测140例宫颈脱落细胞高危型HPV(HPV16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68)感染状况。结果:细胞学诊断低度鳞状上皮内病变(LSIL)56例,高危型HPVDNA阳性18例(阳性率为32.5%);细胞学诊断高度鳞状上皮内病变(HSIL)42例,高危型HPVDNA阳性25例(阳性率为59.5%);未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞(ASCUS)31例,高危型HPVDNA阳性11例(阳性率为35.5%);鳞状细胞癌9例,高危型HPV阳性8例(阳性率88.9%)。结论:PCR微板杂交捕获检测宫颈脱落细胞内高危型HPV感染,具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点,适用于大规模筛查和临床常规工作。

两种结核杆菌基因扩增杂交方法的比较

聚合酶反应是一种新的体外基因扩增方法，其用于结核杆菌的检测已体现了快速、灵敏、特异的特点，但其在临床应用时，易出现假阴性和假阳性结果，故最近发展趋势是样本处理、基因扩增和产物分析三方面进行改进，其中传统的电泳方法鉴定产物蔽病尤为突出，其改进进展也最快...

微孔板双探针杂交法快速鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌

目的建立微孔板双探针杂交法,快速鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌,并应用于临床分离株的快速鉴定。方法利用真菌保守区核糖体基因和可变区内转录间隔区基因为靶序列,应用生物素标记的通用引物进行念珠菌DNA的PCR扩增,并将该PCR产物分别与固定在微孔板上的都柏林念珠菌和白念珠菌特异性探针杂交,经酶联显色反应测其A值。结果能特异地鉴别白念珠菌和都柏林念珠菌标准菌株。对108株常规培养方法从临床标本分离的白念珠菌检测,结果显示106株菌株仅白念珠菌探针检测阳性,另2株菌株仅都柏林念珠菌探针阳性。结论微孔板双探针杂交法能快速、特异地鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌。

聚合酶链反应产物微孔板杂交技术

聚合酶链反应产物微孔板杂交技术魏军张正聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测方法自１９８４年创建以来［１］，已经成为分子生物学领域的核心技术，广泛应用于遗传病诊断、微生物检测，法医学鉴定及人类学、考古学研究诸方面。ＰＣＲ产物的鉴定以及进一步分型主要是通过凝胶电泳...

愈肝颗粒治疗慢性乙型肝炎基本核心区启动子变异患者的疗效观察

目的:观察中药制剂愈肝颗粒治疗慢性乙型肝炎（CHB）基本核心区启动子（BCP）变异患者的疗效。方法:用微孔板杂交法和酶联免疫吸附试验联合检测乙型肝炎病毒（HBV）BCP变异,变异阳性组（简称P组,46例）和变异阴性组（简称N组,69例）。所有患者均给予愈肝颗粒治疗,观察患者治疗前后临床表现及实验室有关指标。结果:治疗结束后,两组患者症状积分显著减低,血清ALT、TBiL水平明显下降。P组HBeAg阴转率（60％）显著高于N组（30％,P<0.05）,而HBV-DNA阴转两组比较差异无显著性,两组综合疗效相似。结论:愈肝颗粒能够显著改善CHB患者的症状,降低血清ALT和TBiL水平,同时具有抗HBV作用,且对于BCP变异株感染与野生株感染同等有效。

多西他赛对结肠癌LoVo细胞增殖的抑制作用

目的 探讨多西他赛治疗结肠癌的作用机制。方法 采用不同浓度的多西他赛处理结肠癌LoVo细胞后 ,应用四唑蓝比色试验检测细胞增殖 ,采用端粒重复扩增 -微孔板杂交法检测端粒酶活性 ,分别用琼脂糖凝胶电泳和TUNEL方法检测细胞凋亡 ,采用流式细胞仪测细胞周期。结果 多西他赛对结肠癌LoVo细胞增殖具有较强的抑制作用。多西他赛能够抑制端粒酶活性 ,可诱导结肠癌细胞凋亡 ,均呈浓度和时间依赖性。结论多西他赛抑制结肠癌细胞恶性增殖与抑制端粒酶活性、诱导凋亡及细胞周期阻滞有关。