尼罗罗非鱼无乳链球菌微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

通过设计筛选引物和探针、优化反应浓度和退火温度,构建一种尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的微滴式数字PCR(dd PCR)检测方法,分析该方法的敏感性、特异性及重复性,并应用于临床样品检测。结果显示:当引物、探针浓度分别为0.9μmol·L^(-1)、0.3μmol·L^(-1)且退火温度为56.9℃时,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR方法阴、阳性微滴分布界限明显,平均拷贝数高,有较高扩增反应效率;线性关系线良好(R^(2)=0.997 3),最低检测限为2.56 copies·μL^(-1);与猪链球菌2型、鱼类海豚链球菌和其他5种常见的水生动物疫病病原体无交叉反应;重复变异系数为3.15%;临床样品检测结果与实时荧光PCR方法结果的符合率100%,与细菌分离鉴定方法结果符合率为94.12%。结果表明,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可对罗非鱼无乳链球菌感染的临床样品进行定量检测,为尼罗罗非鱼无乳链球菌的研究提供有益参考。

微滴式数字PCR在检测胃腺癌和结直肠腺癌NTRK基因融合中的应用

目的评估微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)应用于NTRK基因融合检测的可行性。方法回顾性分析830例原发性结直肠腺癌和560例胃腺癌样本,分别运用免疫组织化学(IHC)和荧光原位杂交(FISH)技术检测石蜡包埋肿瘤组织中pan-TRK蛋白表达情况以及NTRK1/2/3基因断裂情况。FISH及IHC阳性样本进一步行二代测序(NGS)检测及ddPCR检测。结果所有石蜡包埋肿瘤样本均成功进行IHC和FISH检测。FISH或IHC阳性样本合计26例,其中FISH阳性21例,IHC阳性18例。26例阳性样本进一步行RNA Seq NGS、DNA Seq NGS及ddPCR检测。DNA Seq NGS合计检测到14例NTRK基因融合,2例扩增。RNA Seq NGS合计检测到3例NTRK基因融合,ddPCR检测结果与RNA Seq NGS完全一致。结论ddPCR可有效区分FISH和DNA Seq NGS检测为NTRK非典型融合的结直肠腺癌和胃腺癌病例,可以作为除FISH之外NTRK基因初筛方法的补充。

血小板HPA-3,HPA-15基因分型微滴式数字PCR检测体系的构建

目的建立血小板HPA-3,HPA-15基因分型的微滴式数字PCR(ddPCR)高灵敏检测方法,并初步探索应用于孕妇外周血胎儿游离DNA HPA抗原相容性检测的可行性。方法针对HPA-3,HPA-15的SNP突变位点,设计特异性引物及MGB探针,优化ddPCR退火温度及引物浓度等扩增条件,建立最佳反应体系,明确检验程序。对该检测方法进行方法学性能评估包括特异性、灵敏度、重复性和稳定性。利用ddPCR技术对2022年6月至2023年6月67例临床血液标本进行检测,将等位基因分型结果与基因测序结果比较,并对52例母体外周血胎儿游离DNA HPA抗原进行检测。结果检测血小板HPA-3,HPA-15的ddPCR方法,引物及探针特异性良好,HPA-3,HPA-15的最佳退火温度分别为:61.6℃,60.2℃;体系最佳引物浓度分别为:900 nM,700 nM;探针终浓度均为250 nM。拷贝数定量检测范围为:2~20000 copies,检测下限为0.1 copies/μL且线性良好。在低拷贝数标本中,HPA-3及HPA-15实际检测值的批内及批间变异系数(CV)均<5%。对67份人血液标本DNA的HPA-3,HPA-15基因型检测,结果与基因测序结果完全一致。应用于胎母血小板HPA-3,HPA-15基因型检测结果符合预期。结论本研究构建的HPA-3,HPA-15 ddPCR检测体系准确性高,重复性及稳定性较好,灵敏度高,可应用于临床血小板HPA-3,HPA-15基因型供者库的建立、基因配型及胎母血小板相容性检测等。

水貂阿留申病毒的微滴式数字PCR方法的建立及初步应用

为建立水貂阿留申病毒(AMDV)微滴式数字PCR (ddPCR)检测方法,本研究根据AMDV VP2基因的保守区设计特异性引物和探针,通过PCR扩增AMDV VP2基因并克隆至p MD19-T载体,构建重组质粒p MD19-T-AMDV,并经PCR和测序鉴定后利用该质粒标准品作为模板,通过各反应条件的优化,初步建立了检测AMDV的ddPCR方法。分别以AMDV、水貂肠炎细小病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒、水貂流感病毒基因组为模板,按照本研究建立的ddPCR方法检测,评估其特异性;将1.43×10^(7)拷贝/μL~1.43×10^(0)拷贝/μL的重组质粒标准品作为模板,采用优化后的ddPCR和文献中的荧光定量PCR (qPCR)检测,评估该方法的敏感性;分别以不同浓度的重组质粒标准品作为模板,采用优化后的ddPCR分别进行批内和批间重复性试验,以变异系数(CV)评估该方法的重复性。优化结果显示,该方法的最佳引物终浓度为400 nmol/L (1.2μL)、探针终浓度为200 nmol/L (0.6μL)、退火温度为60℃。特异性试验结果显示,该方法仅可检测到AMDV和质粒标准品,而其他相关病毒均为阴性结果。敏感性试验结果显示,该方法对重组质粒标准品的检测限为1.43拷贝/μL,qPCR对质粒标准品的检测限为1.43×10^(2)拷贝/μL,前者比后者的敏感性高100倍。重复性试验结果,批内和批间重复性试验的变异系数均小于3%。对采集的70份病貂肝脏、脾、肾脏、环境拭子、肛拭子样品进行ddPCR和qPCR检测,结果显示,ddPCR对AMDV的检出率为24.28%(17/70);qPCR的检出率为15.7%(11/70),二者的阳性符合率为64.7%,阴性符合率为89.83%,总符合率为91.42%。上述结果表明,本研究建立的ddPCR方法特异性强、敏感性高和重复性好,可以检测各种临床样品及含量极低样品中的AMDV,为AMDV早期感染的检测、流行病学调查及AMD的防控提供有力技术手段。

水貂阿留申病毒微滴式数字PCR检测方法的建立与应用

为建立一种准确且灵敏的水貂阿留申病毒(AMDV)微滴式数字PCR检测方法(dd PCR),本研究根据AMDV-G基因保守区,设计特异性引物及探针,并对反应条件进行优化,初步建立检测AMDV的dd PCR方法。同时对该方法的特异性、敏感性和重复性进行分析。结果显示,dd PCR的退火温度为55℃,最佳引物和探针终浓度均为10μmol/μL。绘制的标准曲线结果显示,核酸标准物质稀释倍数的对数与对应检出拷贝数的对数之间呈良好的线性关系(R^(2)=0.9945>0.99)。建立的dd PCR方法的特异性强,除能检测到AMDV以外,对相关病原如水貂犬瘟热病毒、犬细小病毒、貂肠炎病毒、犬冠状病毒、犬腺病毒I型、狂犬病毒的检测结果均为阴性。对AMDV核酸标准物质的检测限为6.2拷贝/μL,敏感性高,比荧光定量PCR(q PCR)敏感性高10倍。对不同稀释度AMDV核酸标准物质的批内和批间重复性试验的变异系数均<5%,重复性好。采用建立的dd PCR方法和荧光定量PCR方法对貂场采集的40份水貂脏器组织样品进行检测,两种检测结果基本一致,但dd PCR敏感性更高。上述结果表明,本研究建立了一种特异性强、灵敏度高、重复性好的AMDV定量检测方法,为水貂阿留申病毒的有效防控提供技术支持。

微滴式数字PCR技术快速诊断侵袭性念珠菌病的方法建立

目的建立基于微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术快速检测重症患者侵袭性念珠菌感染的方法。方法基于微滴式数字PCR平台建立检测体系,设计四种念珠菌(白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带滑念珠菌)特异性引物探针;(1)对无模板对照(no tmplate contral,NTC)样品进行检测,确定空白限(limit of blank,LOB)范围和阳性判断值;(2)通过对阳性样本进行稀释,每个浓度梯度各进行10次重复提取检测,确定检测限(limit of detection,LOD)范围;(3)重复检测稀释后的样本,确定定量限(limit of quantitation,LOQ)范围;(4)对阳性样品进行梯度稀释,确定线性范围;(5)通过2个高低浓度的阳性样本提取检测,进行12次重复性测试,计算结果浓度对数值的变异系数(CV);(6)通过具有真菌培养结果的临床样本进行检测,评估方法可靠度。结果ddPCR检测念珠菌LOB在0~81 copies/mL之间,阳性判断值为≥3个阳性微滴;LOD为3×10^(2) copies/mL;LOQ为3×10^(2) copies/mL;不同浓度梯度检测线性范围是3×10^(2)~3×10^(7)copies/mL,相关系数为:白色念珠菌R^(2)=0.9995、光滑念珠菌R^(2)=0.9989、近平滑念珠菌R^(2)=0.9994、热带滑念珠菌R^(2)=0.999;结果浓度对数值的CV<5%,满足精密度要求;通过检测建立方法初步验证临床标本,结果与临床培养结果一致。结论ddPCR对重症患者侵袭性念珠菌感染的检测灵敏度高、重复性好,特异性高。

SARS-CoV-2 Omicron变异株多重微滴式数字PCR定量方法的建立及应用

【目的】为建立精准、高效的多重微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量分析检测方法,开发可同时鉴别新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)ORF1ab基因、N基因、E基因以及Omicron变异株S基因的检测体系,提高病毒性传染疾病的诊断效率及传播风险监测能力。【方法】通过筛选保守基因序列并设计特异性引物与探针,优化反应体系和扩增程序,对该方法的特异性、灵敏度及稳定性进行评价。以临床样本为实验材料,利用建立的ddPCR方法进行检测和验证,确定阳性检出率。【结果】多重ddPCR反应体系中,各对引物探针对目的片段均能有效扩增,SARS-CoV-2 ORF1ab基因、N基因、E基因以及Omicron变异株S基因灵敏度检测下限分别为0.59、0.68、1.44、1.03 copies/μL。在20份临床样本的核酸检测中,共检出16份阳性样本,阳性率达80%(16/20),经荧光定量PCR方法复测符合率一致。【结论】研究建立的多重ddPCR方法特异性强、灵敏度高,可实现对临床样本中微量新冠病毒的精确定量检测。

微滴式数字PCR定量检测伯氏考克斯氏体方法的建立及应用

为建立伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii,Cb)微滴式数字PCR(Droplet Digital PCR, ddPCR)检测方法,研究以Cb IS1111基因为靶基因,并针对基因保守区域设计了特异性引物和探针,以使反应的条件更加完善,从而构建了ddPCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性及重复性作出了评估。结果显示,所采用的ddPCR方法最低可检测的浓度为0.52 copies/μL,敏感性较高;与动物布鲁氏菌、牛结核分枝杆菌、土拉杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌无交叉反应,特异性强;组内重复和组间重复变异系数均小于10%,重复性好。使用本实验建立的方法检测了42份疑似感染的临床样品,检测结果与荧光PCR鉴定结果一致。表明建立的ddPCR方法的特异性强、敏感性高、重复性和准确性好,可用于Cb的快速检测和精准定量,对Cb感染的防控具有重要意义。

基于微滴式数字PCR技术检测树莓制品的定量分析方法

为了检验树莓制品中是否掺杂其他成分,建立了微滴式数字聚合酶链式反应(Droplet Digital PCR,ddPCR)技术定量检测树莓成分的检验方法。结果表明,实验建立的树莓掺假模型的检测结果准确,为检测市售树莓制品中是否掺假提供了一种新的、更加精确的定量手段。

微滴式数字PCR定量检测包装饮用水中铜绿假单胞菌

建立一种微滴式数字聚合酶链式反应(Droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)定量检测包装饮用水中铜绿假单胞菌的技术。根据铜绿假单胞菌外毒素A(ETA)基因序列合成特异性引物和探针,通过多种菌株扩增验证方法特异性,通过人工添加铜绿假单胞菌验证方法检出限。结果表明,建立的包装饮用水中铜绿假单胞菌ddPCR定量检测方法特异性强,检出限为10 CFU/mL,灵敏度高,适用性好。该方法可以满足包装饮用水中铜绿假单胞菌定量检测需求。

鸡传染性喉气管炎病毒微滴式数字PCR定量检测方法的建立

旨在建立检测鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus, ILTV)绝对定量方法。根据已发表的鸡ILTV的TK基因序列,针对其保守区域分别设计1对特异引物和1条探针,建立检测鸡ILTV的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,建立方法的最佳引物浓度为20μmol/μL,最佳探针浓度为10μmol/μL,最佳退火温度为56℃。特异性检测结果显示,建立的方法只检出ILTV,没有检出其他病原株。敏感性检测结果显示,采用建立的方法定量检出ILTV重组质粒标准品的最低限为4.6拷贝/μL。对3个连续稀释的pMD18-ILTV重组质粒DNA进行检测,3次重复检测结果的变异系数均小于5%。对83份病鸡喉拭子、肺及脾组织样品进行检测,采用建立的ddPCR检出ILTV阳性样品10份,荧光定量PCR检出ILTV阳性样品9份,ddPCR的阳性检出率(12.05%)高于荧光定量PCR的阳性检出率(10.84%)。结果表明,建立的ddPCR方法定量检测ILTV特异性强、敏感性高、重复性好,为绝对定量检测ILTV提供更好的技术支撑。

猪流感病毒通用型微滴式数字RT-PCR绝对定量检测方法的建立

为建立灵敏且可绝对定量检测猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的微滴式数字RT-PCR(ddRT-PCR)方法,以SIV M基因的保守序列为靶基因,设计并合成一套特异性引物和TaqMan探针,建立了可对主要流行的H1N1、H1N2和H3N2亚型SIV绝对定量检测的通用型ddRT-PCR方法。随后,对该方法的敏感性、特异性和重复性进行评价,并利用临床猪鼻咽拭子样品进行检测验证。结果显示:建立的ddRT-PCR方法检测限达到1.6 copies/µL,灵敏度极高;能特异性检出H1N1、H1N2和H3N2亚型SIV,与猪瘟病毒等其他常见猪病病原均无交叉反应;重复检测结果的批内和批间变异系数(CV)分别为0.75%、3.17%,重复性良好;经临床样品检测验证,建立的ddRT-PCR和荧光RT-qPCR方法分别检出阳性样品72、66份,提示前者在检测低病毒拷贝样品时较荧光RT-qPCR更优。结果表明,本研究建立的SIV通用型ddRT-PCR方法灵敏度高,特异性和重复性均良好,且在检测低病毒含量临床样本时更具优势,可作为一种对SIV感染进行早期诊断和绝对定量检测的有效方法。

微滴式数字PCR技术在动物疫病检测中的应用研究进展

数字PCR(dPCR)技术是最近发展起来的第三代PCR技术,其中微滴式数字PCR(ddPCR)技术具有敏感性高、耐受性强,准确性和重复性好,可实现不依赖标准曲线即可对样本目标核酸进行绝对定量的优点,得到研究者的广泛关注。ddPCR技术凭借诸多优势,近年来在动物疫病病原检测领域得到了飞速发展,已被成功应用于病毒、细菌、寄生虫以及支原体、衣原体等多种病原的检测,尤其为低丰度病原调查、实验室检测和病原分型鉴定提供了强有力的技术支撑。本文综述了ddPCR技术的基本原理及其在动物疫病诊断中的应用和发展前景,以期为ddPCR技术在兽医实验室动物疫病诊断方面的推广提供参考。

微滴式数字聚合酶链式反应在血流感染快速诊断中的性能评价及应用

目的使用临床菌株和标准菌株验证微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)试剂检测性能,并评估ddPCR技术临床应用的有效性和实用性。方法使用临床菌株和标准菌株验证ddPCR试剂盒符合率、特异度、精密度、最低检出限等。收集74例疑似血流感染患者的血液样本,同时采用ddPCR和血培养2种方法测定患者血液标本的病原体。结果ddPCR血流感染病原体检测的平均检测时间为3.5 h,能够同时检测十几种常见病原体,ddPCR血流感染病原体检测试剂盒的符合率、特异度、精密度、最低检测限均满足临床要求。疑似血流感染的74例患者中,采用ddPCR方法检测的阳性率为64.86%,采用血培养检测的阳性率为40.54%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论ddPCR可快速﹑批量﹑高效地检测血流感染常见病原体,检测性能可以满足临床需要,血培养联合ddPCR技术检测血流感染有利于临床血流感染患者的早期快速诊断。

微滴式数字PCR技术在菜豆晕疫病菌检测中的应用

为了建立菜豆晕疫病菌(Pseudomonas savastanoi pv.phaseolicola)微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,实现菜豆晕疫病菌的高效率、高精度的检疫鉴定和疫情监控,以菜豆晕疫病菌为研究对象,以位点特异性重组酶作为靶标基因,SSRP_F、SSRP_R、SSRP_P为特异性引物与探针,建立菜豆晕疫病菌ddPCR反应体系,结果表明,菜豆晕疫病菌的ddPCR检测体系的绝对定量检测低限为0.6 copies/μL,ddPCR的检测灵敏度比常规PCR高2个数量级。同时研究了种子携带菜豆晕疫病菌是否具有活性,提高了疫情检出率。

狂犬病病毒微滴式数字PCR检测方法的建立

为了建立可绝对定量狂犬病病毒(RABV)的微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,本试验根据RABV基因组起始区域设计引物和探针,继而优化引物和探针浓度以及退火温度,并对建立的ddPCR方法的灵敏度、特异性和重复性进行分析。结果显示:ddPCR方法的最佳引物和探针浓度分别为900 nmol/L和250 nmol/L,最佳退火温度为55℃;ddPCR方法的标准曲线相关系数(R~2)为0.999,呈现良好的线性关系;灵敏度高,最低可检测到3.37 copies/μL;特异性良好,与常见犬病原无交叉反应;重复性好,检测结果稳定。临床样品的检测结果显示,本试验建立的狂犬病病毒ddPCR方法与实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)方法的符合率为100%。结果表明,本试验建立的狂犬病病毒微滴式数字PCR方法灵敏度高、特异性强,可用于狂犬病病毒的绝对定量检测。

微滴式数字PCR与IHC联合FISH对乳腺癌新辅助化疗前后HER-2检测的分析

目的分析乳腺癌患者在新辅助化疗前后,采用微滴式数字PCR、IHC联合FISH检测人表皮生长因子受体2(epithelial growth factor receptor-2,HER-2)变化的价值。方法筛选96例乳腺癌患者均自2020年1月~2022年1月入院实施新辅助化疗,在化疗前后采用微滴式数字PCR(设为观察组)、IHC联合FISH法(设为对照组)检测HER-2变化,分析两种方案检测结果、与金标准符合率。结果化疗前,观察组检测显示阳性为46(47.92%)例,阴性为50(52.08%)例;对照组检测显示阳性为42(43.75%)例,阴性为54(56.25%)例,两组检测结果显示对比无明显差异(P>0.05),符合率为96.88%、98.96%;化疗后,观察组检测显示阳性为44(45.83%)例,阴性为52(54.17%)例;对照组检测显示阳性为40(41.67%)例,阴性为56(58.33%)例,两组检测结果显示对比无明显差异(P>0.05),符合率为98.96%、98.96%。结论将微滴式数字PCR与IHC联合FISH法应用在乳腺癌新辅助化疗前后HER-2检测过程中,两种方案与金标准符合率较高,可有效弥补常规检测不足之处,并为临床疾病的诊断提供丰富参考,值得借鉴。

非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

为建立非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,以非洲猪瘟病毒P72蛋白编码基因为靶基因设计引物和探针,利用正交试验方法优化反应体系及扩增程序,建立了非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,并对其敏感性、特异性及稳定性进行评估。结果显示:建立的方法最低检出限为0.58 copies/μL,与荧光PCR方法相比更敏感;本方法与布鲁氏菌、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒无交叉反应;对10倍稀释的标准物质检测10次,变异系数为8.44%,重复性好。利用建立的方法对100份临床样品进行检测,结果均为阴性,与荧光PCR检测结果一致;对5份实验室间比对样品进行检测,检测出阳性样品4份,阴性样品1份,与实验室间比对给定的样品盘结果一致。结果表明,本研究建立的微滴式数字PCR方法的敏感性、特异性和稳定性符合要求,适于非洲猪瘟病毒临床检测。

Drop-off微滴式数字PCR检测急性髓系白血病NRAS基因突变及其临床应用

目的:建立检测急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)神经母细胞瘤RAS病毒癌基因同源物(NRAS)基因突变的drop-off微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法,并评价该方法的临床应用价值。方法:针对NRAS G12和G13突变位点设计特异性drop-off ddPCR引物和探针,建立最佳反应体系,并对该方法进行性能验证。应用该方法对140例临床样本进行初筛,其检测结果与Sanger测序进行比较,并用二代测序(next generation sequencing,NGS)进行验证。结果:建立drop-off ddPCR检测NRAS基因G12/G13突变的方法,灵敏度达0.158%,重复性、线性良好,其空白限为5.40拷贝数/μL,最低检测下限为15.84拷贝数/μL。在140例初诊AML患者中,drop-off ddPCR检出NRAS突变28例(20%),其突变负荷为0.26%~52.85%(中位2.14%);而Sanger测序仅检出7例(5%)阳性,为进一步验证,将21例Sanger测序结果阴性而drop-off ddPCR检测阳性的样本进行NRAS基因NGS,检出14例阳性,而另外7例NGS阴性的样本,其drop-off ddPCR检测突变频率为0.53%~1.50%(中位1.10%)。结论:建立了drop-off ddPCR技术检测AML患者中NRAS基因突变的方法,该方法灵敏度高,可用于对NRAS基因G12/G13突变进行定量检测,有望可用于AML患者预后判断和疾病监测。

微滴式数字PCR与荧光定量PCR对真皮间充质干细胞增殖及凋亡相关基因检测的比较研究

目的比较微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd-PCR)和实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)对真皮间充质干细胞(dermal mesenchymal stem cell,DMSC)增殖及凋亡相关指标检测的敏感度。方法利用dd-PCR和RT-qPCR分别对寻常型银屑病患者和健康对照者真皮间充质干细胞(dermal mesenchymal stem cell,DMSC)的增殖及凋亡活性相关指标进行检测。结果dd-PCR和RT-qPCR检测结果显示,银屑病DMSC的增殖(PCNA及CDK4)和凋亡活性相关指标(caspase-3)表达水平均较对照组降低,两种方法结果具有高度一致性;但dd-PCR使用的cDNA模板浓度为RT-qPCR的0.01倍。结论对于DMSC分子活性检测而言,dd-PCR和RT-qPCR具有相似的准确性,但dd-PCR敏感度较高,故在模板量受限的情况下,可以优先选择dd-PCR。