冬虫夏草微滴式数字聚合酶链式反应定量检测方法的建立及应用

目的建立一种定量检测冬虫夏草菌的微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)检测方法,探讨其定量检测冬虫夏草的可行性。方法使用冬虫夏草菌特异性引物和探针建立ddPCR检测方法,对冬虫夏草及其常见伪品进行鉴别,对其特异性和自制混伪品进行检测和评估,并采用该方法对市场流通的冬虫夏草产品中的冬虫夏草菌成分进行检测。结果ddPCR检测方法对冬虫夏草菌具有良好的检测特异性,且在掺伪0%~70%范围内定量检测的准确性高;此外,对冬虫夏草及其制剂市售样品的检测结果显示,该方法可用于冬虫夏草的定量检测。结论ddPCR检测方法可成功检测市售冬虫夏草产品中的冬虫夏草菌成分,具有市场应用价值,可为含冬虫夏草成分的保健食品和药品提供定量和鉴伪检测依据。

微滴式数字聚合酶链式反应精准定量检测羊肉中掺杂猪肉

以羊和猪的单拷贝持家基因DNA复制蛋白A1为靶基因设计合成了适用于微滴式数字聚合酶链式反应的特异性引物和探针,通过理论推导获得了单位质量两种肉基因拷贝数之比的固定值,并进行了验证,据此将样品中羊肉和猪肉的拷贝数转换为相对质量分数,从而建立了羊肉中掺杂猪肉的精准定量检测方法。该方法可以很好地应用于羊肉中掺杂猪肉的含量检测,猪肉的最低定量限为1%,在5%~80%范围内绝对误差小于±1.30%,相对误差小于±10%,定量结果准确、重复性高,可以为肉类掺假的监管工作提供有力的技术参考。

微滴式数字聚合酶链式反应在食品安全检测领域的应用

微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)是一种新型核酸扩增技术,可对DNA或RNA分子采用绝对定量的方式进行分析。其结果具有更高的精准度、准确性和灵敏度,大大提升了数字PCR技术的可扩展性与实用性,促进了现代分子生物学在精准定量检测方面的发展和应用。本文重点论述了ddPCR法的技术原理、优势以及在食源性致病微生物定量检测、转基因成分分析、食品源性成分检测等食品安全检测领域的应用研究进展情况。

应用微滴式数字聚合酶链式反应定量检测牛肉制品中的猪源性成分

参照GB/T 25165—2010《明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光聚合酶链式反应法》,以牛的生长激素(growth hormone,GH)基因和猪的朊蛋白(prion protein,PRNP)基因2种核基因为靶基因合成特异性引物和探针。理论推导单位质量牛肉的GH基因与猪肉PRNP基因拷贝数之比为一固定值,通过微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)方法对该固定值进行检测和验证,并以该固定值对牛肉/猪肉人工混合样本和市售牛肉制品中的猪肉成分进行定量检测。结果表明:该方法具有良好的准确性及可重复性;牛肉中掺杂猪肉质量分数在5%～99%范围内时,检测结果绝对误差小于1.28%,变异系数小于6.5%,猪肉成分的回收率为99.09%～102.80%;20份牛肉制品中,4份检出猪肉成分,其中3份的相对含量为29.19%～98.15%,1份为0.12%(低于本方法检出限5%)。因此,dd PCR方法可以较好地应用于牛肉制品中掺杂猪肉成分的定量检测。

微滴式数字聚合酶链式反应对香肠制品中鸡、猪、牛源性成分的定量分析

为实现肉制品中动物源性成分的定量检测,基于微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR),以鸡的转化生长因子β-3基因、猪的朊蛋白基因和牛的生长激素基因为靶基因,建立香肠制品中鸡、猪、牛源性成分的定量检测方法。结果表明:所建立ddPCR方法特异性强,能特异性检测相应的鸡、猪、牛源性成分;根据肉粉质量(mg)与DNA质量浓度(ng/μL)、DNA质量浓度(ng/μL)与基因拷贝数浓度(copies/μL)之间的线性关系,得到鸡肉粉、猪肉粉和牛肉粉质量(x1)与基因拷贝数浓度(y 2)之间的关系式为:鸡:x1=n×y2/273.946-n/886.557+0.216;猪:x1=n×y2/64.950+n/60.644+0.215;牛:x1=n×y2/62.839+n/12.646+1.218(n为稀释倍数);基于建立的ddPCR方法对64份市售不同种类香肠样品进行检测,在1份原料标识仅为“猪肉”的香肠中检出鸡源性成分含量为18.68%。本研究建立的ddPCR方法能够实现香肠中鸡、猪、牛源性成分的准确定量检测,并可以此判断“蓄意掺假”或“无意带入”。

基于微滴式数字聚合酶链式反应技术的肉制品中鸭源性成分的定量检测

为实现肉制品中鸭源性成分的定量检测,基于微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)技术,以鸭生长激素(growth hormone,GH)基因为靶基因,建立肉制品中鸭源性成分的定量检测方法。结果表明:所建立的ddPCR方法能特异性检测鸭源性成分,灵敏性为11.1 copies/μL;根据鸭肉粉质量(mg)与DNA质量浓度(ng/μL)、DNA质量浓度(ng/μL)与鸭GH基因拷贝数浓度(copies/μL)之间的线性关系,建立鸭肉粉质量(x)与鸭GH基因拷贝数浓度(y)之间的关系式为x=(n×y)/725.046-n/1317.06+0.153;模拟混合样本中鸭肉粉质量分数5%-100%时,鸭源性成分检测的绝对误差均小于±1.52%,变异系数均小于10.38%,回收率为98.35%~125.32%;在88份商品化肉制品中,11份肉制品中检出鸭源性成分,检出率为12.5%,且鸭源性成分含量为18.6%~87.4%。本研究所建立的鸭源性成分ddPCR方法有较好的准确性和较强的适用性,能够应用于肉制品中鸭源性成分的定量检测。

微滴式数字聚合酶链式反应技术在新型冠状病毒检测中的应用与评价

目的 分析微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR)对新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome corona virus-2, SARS-CoV-2)的核酸检测结果,并与实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测结果相比较,评价其检测优缺点,为优化新型冠状病毒的核酸检测方案提供数据支持。方法 根据中国疾病预防控制中心公布的SARS-CoV-2特异性引物探针,设计针对SARS-CoV-2的ddPCR检测方法,选取1份样本梯度稀释后进行灵敏度试验;选取季节性H3N2流感病毒等6种呼吸道病毒核酸阳性的样本与SARS-CoV-2阳性样本进行特异性试验;选取5份SARS-CoV-2阳性样本进行重复性试验,并选取SARS-CoV-2阳性30份、阴性20份样本进行多临床样本检测,与qRT-PCR检测结果进行分析比较。结果 ddPCR法能特异检出SARS-CoV-2,并直接得到样本靶基因的原始拷贝数,实现精准定量;对梯度稀释阳性样本灵敏度检测显示,qRT-PCR在样本10-5稀释度部分检出靶基因,10-6稀释度未检出靶基因,而ddPCR在样本10-5、10-6稀释度均全部检出靶基因,ddPCR的检测下限相对qRT-PCR结果有2个数量级的提升,灵敏度高于qRT-PCR;两种方法重复性实验结果比对中,ddPCR变异系数为1.266%~11.814%,低于qRT-PCR的1.729%~26.174%,重复性高于qRT-PCR;对50份临床样本检测比较中,30份新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)确诊病例阳性样本,两种方法均能成功检出SARS-CoV-2,20份COVID-19阴性样本经两种方法检测,结果均为阴性,检测结果符合率为100.00%(50/50)。结论 ddPCR法对SARS-CoV-2能精准定量,特异性强,且灵敏度和重复性均高于qRT-PCR,但也存在一定检测局限性,更适合低载量样本的检测。在实际检测中,可将两种方法合理结合,提高检测准确性。

微滴式数字聚合酶链反应在重症感染病原学诊断中的应用进展

重症感染是导致人类死亡的主要病因之一,尤其对于重症监护病房患者,传统的病原微生物检测手段存在灵敏度和特异度低、耗时长等问题,严重影响脓毒症患者病原学早期快速诊断,导致其病死率增加。近年,随着分子诊断技术在重症感染疾病中的广泛应用,病原学的诊断效率及准确性均显著提高。其中,微滴式数字聚合酶链反应(ddPCR)凭借高灵敏度、高特异度、绝对定量等优势,在病原菌载量动态监测和抗生素疗效评估中具有巨大潜力。因此,ddPCR技术或可提高重症患者的诊断率,改善其预后。

液滴微流控系统在数字聚合酶链式反应中的应用研究进展

数字聚合酶链式反应（ PCR）技术近年来发展迅速。与以实时荧光定量PCR为代表的传统PCR技术相比，数字PCR技术显著提高了定量分析的精确度和灵敏度。数字PCR的快速发展与近年来微流控技术在数字PCR技术中的广泛应用有着密切的联系。早期的研究和商业化产品使用的是大规模集成流路微流控芯片，加工过程复杂且价格高昂。近年来，液滴微流控芯片被应用到数字PCR技术中，它可以在短时间内产生10^2-10^7个微液滴，每一个微液滴都是最多只含有一个目的基因片段的PCR反应器。 PCR扩增后，通过对单个微液滴的观察计数，就可以获得绝对定量的分析数据。本文综述了不同种类的液滴微流控系统在数字PCR技术中的应用，以及液滴数字PCR微流控芯片在生物、医药、环境等领域的应用。

微滴式数字聚合酶链式反应定量检测水产品中溶藻弧菌

目的建立水产品中溶藻弧菌微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)快速定量检测方法。方法采用SN/T 1870—2016《出口食品中食源性致病菌检测方法实时荧光PCR法》中溶藻弧菌的引物探针,建立优化ddPCR反应体系,梯度稀释溶藻弧菌纯培养液,确定ddPCR方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ);通过人工添加试验,比较ddPCR与实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法定量的准确性,以验证ddPCR方法用于检测水产品中溶藻弧菌的可行性。结果所建立的水产品中溶藻弧菌ddPCR检测方法经过溶藻弧菌标准菌株、分离菌株以及其他近源菌株验证,具有良好的特异性;纯培养的LOD和LOQ一致,均为2.2拷贝/反应,相当于110 CFU/ml纯菌液,定值结果与传统平板计数方法相差0.04个对数值。在人工污染模拟试验中ddPCR的定量结果较qPCR更接近理论添加值,检测重复性以及对低浓度样品的检出情况也均优于qPCR。ddPCR对人工污染样品的LOQ可达120拷贝/g。结论溶藻弧菌ddPCR定量检测方法特异性好、灵敏度高、结果准确,可为快速定量检测溶藻弧菌提供参考。

基于微滴式数字PCR技术检测树莓制品的定量分析方法

为了检验树莓制品中是否掺杂其他成分,建立了微滴式数字聚合酶链式反应(Droplet Digital PCR,ddPCR)技术定量检测树莓成分的检验方法。结果表明,实验建立的树莓掺假模型的检测结果准确,为检测市售树莓制品中是否掺假提供了一种新的、更加精确的定量手段。

水产品中广州管圆线虫微滴数字聚合酶链反应定量检测方法的建立

目的建立微滴数字聚合酶链反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)快速、准确定量检测水产品中广州管圆线虫的分析方法。方法选择广州管圆线虫ITS2基因序列作为靶标序列,自主设计特异性引物和探针,建立广州管圆线虫ddPCR定量检测方法,通过对ddPCR反应条件的优化,确立了ddPCR最佳反应条件,从稳定性、特异性、定量限范围、定量检测低限和人工污染样品等方法,综合评价建立的广州管圆线虫ddPCR定量检测方法的效果。结果广州管圆线虫DNA质量浓度在0.320~1000.000 pg/μL的范围内,基因拷贝数与DNA浓度呈良好的线性关系,相关系数r2=1,定量检测低限为0.297拷贝/μL,人工污染样品中3次重复实验分别检出4370、4210、4310拷贝/μL。结论本研究建立的广州管圆线虫ddPCR定量检测方法特异性强、灵敏度高、稳定性好、定量范围广,为水产品中广州管圆线虫的定量检测提供新的检测手段。

微滴式数字聚合酶链反应检测金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌

目的采用微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)技术快速检测饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌,以满足对猪饲料中病原体精准检测需求。方法通过已建立的荧光定量PCR方法中引物和探针,建立优化ddPCR条件,梯度稀释质粒,进行特异性、敏感性、重复性实验以及市售10种样品的本底检测。结果ddPCR法检测金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌具有良好的特异性,最低可检测到88 copies/μL,SD为19.7,RSD为2.03%。稳定性测试组间RSD小于6.5%。结论ddPCR法特异性好,灵敏性较强,具有良好的重复性,可以作为分子生物学方法来诊断饲料中金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌。

一种用于核酸高灵敏检测的液滴式数字聚合酶链式反应芯片

为了实现对核酸的高灵敏度检测,构建了一种新型的液滴式数字聚合酶链式反应(dd PCR)芯片.该芯片由产生液滴的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模块和储存液滴的玻璃腔室构成.实验结果表明,该芯片可以在25 min内产生2×106个直径为20μm的微液滴(体积4.187 p L).利用该芯片定量检测了表皮生长因子受体(EGFR)基因第19号外显子,在DNA浓度为106~101copies/μL范围内呈现良好的线性关系(R2=0.9998);在浓度为106copies/μL的19号外显子野生型DNA中检测105~100copies/μL的突变型DNA,其检测敏感度可达到0.0001%.该方法在同一芯片上实现了液滴产生、核酸扩增和荧光信号读取的功能,在核酸绝对定量及痕量突变基因的检测中具有潜在应用前景.

微滴式数字聚合酶链反应在传染病检测中的应用

1999年,VOGELSTEIN等[1]正式提出了数字聚合酶链反应(dPCR)的概念。目前,dPCR主要分为3类:微反应室/孔板数字PCR、微流控芯片数字PCR和微滴式数字聚合酶链反应(ddPCR)[1-3]。其中,ddPCR是利用微滴发生器将反应体系一次性生成单分子水平的油包水微滴,再独立地进行循环扩增反应,扩增结束后分别对每个反应单元的荧光信号进行采集,有荧光信号的标记为“1”,无荧光信号的标记为“0”,使用泊松概率分布函数进行计算,最终得出反应体系最初的DNA拷贝量。ddPCR与实时荧光定量PCR(qPCR)采用相同的引物及探针,通过有限稀释法和泊松分布原理直接定量分析,计算出DNA水平。

微滴式数字聚合酶链反应在病原体检测中的研究进展

聚合酶链反应是一种分子生物学技术,用于使某些脱氧核糖核酸(DNA)片段扩增,它是一种常见且不可或缺的技术,已应用于许多领域,特别是在临床实验室中。第三代聚合酶链反应,微滴式数字聚合酶链反应(ddPCR),是常规聚合酶链反应方法的生物技术改进,可用于直接定量和克隆扩增DNA。ddPCR现在广泛用于低丰度核酸检测,可用于感染性疾病的诊断。该文介绍了ddPCR检测手段的发展及原理,总结了其在病毒性疾病、细菌性疾病和真菌性疾病临床诊断中的潜在优势:ddPCR对低丰度病原体的检测更灵敏、准确、可重复,可能在未来临床应用中是比定量聚合酶链反应更好的选择。

微滴式数字PCR技术定量检测发酵乳中醋化醋杆菌

建立一种微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)定量检测发酵乳中醋化醋杆菌的技术。根据醋化醋杆菌ITS基因序列设计特异性引物和探针,通过反应温度筛选优化ddPCR扩增条件,通过多种菌株扩增验证方法特异性,通过人工添加醋化醋杆菌验证方法检出限,通过ddPCR法实测结果和计数法测定结果之间的比较对其绝对定量进行系统性研究。结果表明:建立的发酵乳中醋化醋杆菌ddPCR定量检测1方法,反应条件中最适退火温度为54.6℃,方法特异性强,检出限为7.2×10^(1) CFU/mL,灵敏度高,定量偏差率为23.73%。该方法可以满足发酵乳中醋化醋杆菌定量检测需求。

微滴数字聚合酶链反应法检测晚期肺腺癌患者血浆循环肿瘤DNA表皮生长因子受体基因突变的临床价值研究

目的探讨微滴数字聚合酶链反应法(ddPCR)检测晚期肺腺癌患者血浆循环肿瘤脱氧核糖核酸(ctDNA)中表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的临床价值。方法收集2015年5月至2017年4月在北京胸科医院确诊的初治晚期肺腺癌患者共136例,突变扩增系统(ARMS)检测肺癌肿瘤组织中EGFR基因突变情况;ddPCR和ARMS技术检测血浆中EGFR的基因突变情况。EGFR敏感突变患者均接受比较不同检测技术的符合率,EGFR敏感突变患者一线接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)口服治疗。通过生存分析比较不同技术检测EGFR基因突变患者无进展生存时间(PFS)。结果136例肺癌肿瘤组织样本中,共检测到111例EGFR敏感突变(81.6%),其中含Exon21 L858R突变48例(43.2%),含Exonl9 del突变59例(53.2%),其他突变4例(3.6%)。ARMS检测血浆EGFR基因突变的敏感度为58.6%,特异度为96.0%。ddPCR检测血浆EGFR突变的敏感度为79.3%,特异度为100%,与肿瘤组织检测的符合率达83.1%(Kappa=0.685,P<0.001).Kaplan-Meier生存分析显示,在组织检测EGFR基因突变的亚组分析中,与单一技术检测阳性的病例相比,ddPCR和ARMS两种技术均为阳性的患者无进展生存时间最短(11.6个月比14.8个月,Х^2=2.517,P=0.026).结论作为一种可靠的、高敏感度和特异度的技术,ddPCR有望应用于检测血浆ctDNA EGFR基因突变情况.血液检测EGFR基因突变可预测患者对EGFR-TKI的疗效.

微滴式数字PCR技术定量检测发酵乳中金黄色葡萄球菌

基于微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,dd PCR)技术,建立发酵乳中金黄色葡萄球菌定量检测方法。以金黄色葡萄球菌nuc基因为目的片段设计特异性的引物和探针,优化反应体系,通过活菌提取和ddPCR方法对靶标基因的检测特异性和灵敏度进行实验,并对定量结果进行分析。本研究建立了发酵乳中ddPCR技术定量检测金黄色葡萄球菌的方法,检测特异性良好,检测灵敏度为3.3×10~1 CFU/g,定量的偏差率为+10.18%,证明了ddPCR用于绝对定量检测的可行性,为其他食品污染菌和致病菌标准化控制体系提供有益的示范作用。

微滴式数字PCR技术用于生物样品种属鉴定和绝对定量

目的运用微滴式数字PCR技术进行生物样品的种属鉴定和绝对定量。方法选择人mtDNA两个编码基因ND4和16S rRNA,设计特异性引物与探针,用人来源及常见动物样本验证种属特异性,再用重组质粒和2组共16份人来源生物检材,倍比稀释。使用微滴式数字PCR技术进行种属检验和绝对定量,验证其灵敏度和稳定性。结果人重组质粒FAM(ND4)可进行人来源样品的检测,其检测结果与各级稀释梯度基本吻合,微滴式数字PCR技术可以检测出反应体系中低至单拷贝的DNA。结论微滴式数字PCR技术可以进行生物样品的种属鉴定和绝对定量,并具有很高的灵敏度和特异性,可应用于日常法医物证检验。