基于微滴式数字PCR技术检测树莓制品的定量分析方法

为了检验树莓制品中是否掺杂其他成分,建立了微滴式数字聚合酶链式反应(Droplet Digital PCR,ddPCR)技术定量检测树莓成分的检验方法。结果表明,实验建立的树莓掺假模型的检测结果准确,为检测市售树莓制品中是否掺假提供了一种新的、更加精确的定量手段。

微滴式数字PCR技术在动物疫病检测中的应用研究进展

数字PCR(dPCR)技术是最近发展起来的第三代PCR技术,其中微滴式数字PCR(ddPCR)技术具有敏感性高、耐受性强,准确性和重复性好,可实现不依赖标准曲线即可对样本目标核酸进行绝对定量的优点,得到研究者的广泛关注。ddPCR技术凭借诸多优势,近年来在动物疫病病原检测领域得到了飞速发展,已被成功应用于病毒、细菌、寄生虫以及支原体、衣原体等多种病原的检测,尤其为低丰度病原调查、实验室检测和病原分型鉴定提供了强有力的技术支撑。本文综述了ddPCR技术的基本原理及其在动物疫病诊断中的应用和发展前景,以期为ddPCR技术在兽医实验室动物疫病诊断方面的推广提供参考。

微滴式数字PCR技术定量检测发酵乳中醋化醋杆菌

建立一种微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)定量检测发酵乳中醋化醋杆菌的技术。根据醋化醋杆菌ITS基因序列设计特异性引物和探针,通过反应温度筛选优化ddPCR扩增条件,通过多种菌株扩增验证方法特异性,通过人工添加醋化醋杆菌验证方法检出限,通过ddPCR法实测结果和计数法测定结果之间的比较对其绝对定量进行系统性研究。结果表明:建立的发酵乳中醋化醋杆菌ddPCR定量检测1方法,反应条件中最适退火温度为54.6℃,方法特异性强,检出限为7.2×10^(1) CFU/mL,灵敏度高,定量偏差率为23.73%。该方法可以满足发酵乳中醋化醋杆菌定量检测需求。

微滴式数字PCR技术检测非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因突变

目的分析微滴式数字PCR技术(droplet digital PCR,dd PCR)在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)患者外周血EGFR基因突变检测中的应用价值。方法采用dd PCR法与扩增阻滞突变系统技术(amplification refractory mutation system,ARMS)分别检测58例NSCLC患者及TKI治疗后耐药患者20例外周血EGFR基因突变,Kappa检验验证dd PCR法检测EGFR基因突变结果与ARMS法的一致性,并对检测结果进行分析比较。结果 ARMS法检测EGFR基因突变共检出34例患者,其中双突变患者5例,dd PCR法共检出38例患者,其中双突变患者10例;两者Kappa值=0.72,阳性一致率为97.50%,阴性一致率为72.73%,总一致率为86.30%;dd PCR法检测接受TKI治疗患者的20外显子p.T790M位点突变检出率为50.00%(10/20),而无TKI用药史患者均未检出;dd PCR法检出突变丰度<1%的突变位点占总突变位点的29.17%(14/48),ARMS法仅检出其中的35.71%(5/14)。结论 dd PCR法与ARMS法相比具有更高敏感性,且可绝对定量,EGFR基因突变的检出率更高。

微滴式数字PCR技术用于生物样品种属鉴定和绝对定量

目的运用微滴式数字PCR技术进行生物样品的种属鉴定和绝对定量。方法选择人mtDNA两个编码基因ND4和16S rRNA,设计特异性引物与探针,用人来源及常见动物样本验证种属特异性,再用重组质粒和2组共16份人来源生物检材,倍比稀释。使用微滴式数字PCR技术进行种属检验和绝对定量,验证其灵敏度和稳定性。结果人重组质粒FAM(ND4)可进行人来源样品的检测,其检测结果与各级稀释梯度基本吻合,微滴式数字PCR技术可以检测出反应体系中低至单拷贝的DNA。结论微滴式数字PCR技术可以进行生物样品的种属鉴定和绝对定量,并具有很高的灵敏度和特异性,可应用于日常法医物证检验。

微滴式数字PCR技术定量检测发酵乳中金黄色葡萄球菌

基于微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,dd PCR)技术,建立发酵乳中金黄色葡萄球菌定量检测方法。以金黄色葡萄球菌nuc基因为目的片段设计特异性的引物和探针,优化反应体系,通过活菌提取和ddPCR方法对靶标基因的检测特异性和灵敏度进行实验,并对定量结果进行分析。本研究建立了发酵乳中ddPCR技术定量检测金黄色葡萄球菌的方法,检测特异性良好,检测灵敏度为3.3×10~1 CFU/g,定量的偏差率为+10.18%,证明了ddPCR用于绝对定量检测的可行性,为其他食品污染菌和致病菌标准化控制体系提供有益的示范作用。

微滴式数字PCR技术检测外泌体PML-RARA融合基因的表达

目的:利用微滴式数字PCR技术检测外泌体中PML-RARA融合基因表达水平。方法:使用基于Taqman探针法的ddPCR技术,建立可检测长型和短型PML-RARA融合基因转录本的方法。以PML-RARA阴性细胞株HL-60细胞的RNA逆转录合成的cDNA为阴性对照建立空白检测限(LOB);以表达长型PML-RARA融合基因的NB4细胞RNA逆转录合成的cDNA和含短型PML-RARA cDNA的重组质粒为模板分别确定两者的最低检测限(LOD);并检测NB4细胞培养上清来源的外泌体和急性早幼粒白血病患者血清来源的外泌体中PML-RARA融合基因的表达情况。结果:采用ddPCR技术针对长型和短型PML-RARA转录本测得的LOB分别为每微升PCR反应体系中含0.0725拷贝和0.083拷贝;测得的LOD分别为每微升PCR反应体系中含0.19拷贝和0.21拷贝;使用该检测方法,在NB4细胞培养上清来源的外泌体和急性早幼粒细胞白血病患者血清来源的外泌体中均可检测到PML-RARA融合基因的表达。结论:建立了一种基于ddPCR技术检测融合基因转录本的方法,可对外泌体中的微量PML-RARA转录本进行绝对定量,为无创动态监测急性早幼粒细胞白血病患者血清外泌体中PML-RARA融合基因的表达水平提供了可能。

采用微滴式数字PCR技术检测血浆EGFR基因突变状态在晚期非小细胞肺癌患者EGFR-TKI疗效评估中的价值

目的探讨采用微滴式数字PCR技术检测晚期非小细胞肺癌患者血浆EGFR突变状态的可行性,及检测结果与接受埃克替尼疗效的相关性。方法分别采用AMRS法检测肿瘤组织样本,dPCR检测配对的血浆样本筛查晚期非小细胞肺癌患者(ⅢB/Ⅳ期)258例的EGFR表达状态,以肿瘤组织中的EGFR突变状态检测为对照,计算ddPCR法检测血浆EGFR突变状态的灵敏度、特异度、一致率。对于组织检测阳性和(或)血浆检测阳性的晚期NSCLC患者均给予埃克替尼靶向治疗。结果以配对的肿瘤组织EGFR突变检测结果为对照,ddPCR法检测血浆EGFR突变的灵敏度、特异度及一致率分别为66.7%,98.5%,83.8%。123例患者组织检测阳性和(或)血浆检测阳性,接受埃克替尼治疗,其中组织AMRS法检测阳性且血浆ddPCR检测阳性为A组(80例);组织AMRS检测阳性而血浆ddPCR检测阴性为B组(41例);组织AMRS检测阴性而血浆ddPCR检测阳性为C组(2例)。3组患者的DCR、ORR、PFS比较差异均无统计学意义(P=0.118,0.158,0.076)。结论 ddPCR法检测晚期NSCLC血浆中EGFR基因突变方法灵敏,取材方便;应用检测结果指导临床EGFR-TKIs治疗疗效与组织学检测结果比较差异无统计学意义,提示该方法预测疗效有良好的临床应用前景。

微滴式数字PCR技术进展

1985年,美国科学家Kary Mullis发明了聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）。PCR是现代生命科学研究中最常规的实验方法之一,其发展经历了3个主要阶段：1操作烦琐、只适用于定性研究的琼脂糖电泳PCR;2实时荧光定量PCR,也是目前应用最广泛的PCR技术;3数字PCR（digital PCR,d PCR）,属于第3代PCR,

基于微滴式数字PCR技术的HER2基因扩增用于乳腺癌TNM分期的研究

目的分析微滴式数字PCR(ddPCR)技术用于人类表皮生长因子受体2(HER2)基因扩增的价值及在评估乳腺癌TNM分期中的应用。方法选取临床资料及随访资料完整的100例乳腺癌患者,其组织标本作为观察组,其中TNMⅠ~Ⅱ期71例,Ⅲ~Ⅳ期29例;另选择80例乳腺增生患者的组织标本作为对照组。构建HER2基因扩增ddPCR方法,分析2组HER2基因相对扩增倍数;采用Spearman相关性分析HER2基因相对扩增倍数与TNM分期的相关性;绘制受试者工作特征(ROC)曲线,分析ddPCR技术用于HER2基因扩增在评估乳腺癌TNM分期的价值。结果观察组HER2基因相对扩增倍数显著高于对照组(P<0.05);且观察组TNMⅢ~Ⅳ期乳腺癌患者HER2基因相对扩增倍数高于TNMⅠ~Ⅱ期乳腺癌患者(P<0.05)。Spearman相关性分析结果显示,HER2基因相对扩增倍数与TNM分期呈正相关(r=0.632,P<0.05);使用ddPCR技术检测乳腺癌患者HER2基因分析TNM分期的敏感度和特异度均大于90%,曲线下面积(AUC)>0.95。结论ddPCR技术检测的HER2基因相对扩增倍数与乳腺癌TNM分期呈正相关,该方法敏感度和特异度均较高,可用于预测TNM的分期。

利用微滴式数字PCR技术分析转基因玉米抗除草剂标记基因EPSP拷贝数

基于微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)平台,以转基因玉米为例,建立了转基因作物(Genetically modified crops,GM crops)外源基因拷贝数分析方法,对待测样品进行了快速鉴定,并从T_0转基因玉米株系中鉴定出多个单拷贝单株。对该方法与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法在分析结果的准确性方面进行了比较,从试验数据可以看出,2种检测方法的结果比较一致,单拷贝检测结果高度一致;但是ddPCR试验操作更加简便,试验结果可重复性强,试验数据更加准确可靠。研究表明,ddPCR方法是一种更加便捷、快速和准确的外源基因拷贝数分析新方法,基于其在准确性和灵敏度方面的显著优势,将会在转基因作物的外源基因拷贝数分析中得到广泛的应用。

应用微滴式数字PCR技术快速诊断新生儿侵袭性真菌病

目的探讨微滴式数字PCR(ddPCR)技术在快速、精确诊断新生儿侵袭性真菌感染(IFI)中的临床应用价值。方法选择真菌高度保守序列18S rRNA为目标序列,通过引物设计,建立ddPCR检测真菌体系。在深圳一家医院新生儿重症监护室采集了有IFI高危因素和/或临床症状的83例患者血样(n=83),采用血培养及ddPCR法分别对血样进行真菌检测。结果 ddPCR检测真菌体系的特异性为100%,灵敏度可以达到3.2 copies/μL,重复性良好。临床试验中,22例确诊/临床诊断IFI患儿血样中,ddPCR检测阳性19例。61例拟诊/非IFI患儿血样中,ddPCR法检测结果有2例阳性。结论初步证明ddPCR技术可用于新生儿IFI的检测,该技术是新生儿IFI筛查甚至诊断很有前途的工具。

微滴式数字PCR技术在新型冠状病毒检测中的潜在价值

采用荧光定量PCR(RT-qPCR)检测样本中的新型冠状病毒核酸阳性率低,导致得多次反复检测。假阴性的存在使得部分携带者漏诊,成为传染疾病的巨大隐患,尤其是当样本病毒核酸含量低、PCR抑制剂干扰、病毒发生变异与引物、探针结合能力下降等因素存在时。因此,亟待研究更高效的检测手段,防止超级传播者出现。本研究通过对应用微滴式数字PCR技术检测新型冠状病毒方法的探讨,为临床快速、准确诊断新型冠状病毒提供方案。

微滴式数字PCR技术及其在产前诊断中的应用

微滴式数字PCR(ddPCR)技术是一种新型核酸检测方法,通过将含有靶分子的反应体系均分到大量独立的反应单元进行扩增,并根据阳性比例和泊松分布原理对靶分子进行绝对定量分析。与传统PCR技术相比,ddPCR具有高灵敏度、高精确度及绝对定量等优点,近年来得到迅速发展,广泛应用于肿瘤、微生物等检测等领域。本文主要在介绍ddPCR基本原理的基础上重点概述其在染色体及单基因遗传病等产前诊断领域的应用进展。

基于微滴式数字PCR技术对乙型肝炎低病毒血症患者血浆HBV DNA精准检测

目的建立基于微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术检测HBV DNA的方法,并实现对乙型肝炎低病毒血症患者HBV DNA的精准检测。方法构建pUC57-HBV质粒作为阳性对照质粒,设计合成HBV DNA ddPCR引物及探针,以梯度稀释的阳性对照质粒为模板进行ddPCR检测,完成标准曲线构建和检出限分析,并进行检测的重复性和特异性分析。收集首都医科大学附属北京佑安医院19例乙型肝炎低病毒血症患者的血浆样本(HBV DNA<10 IU/mL),提取HBV DNA后进行ddPCR检测。结果建立的基于ddPCR技术检测HBV DNA的方法检测下限低至1 copy/μL(阳性质粒稀释法);对3种不同拷贝的阳性对照质粒(1×10^(2)、1×10^(1)、1×10^(0) copies/μL)重复检测的变异系数分别为18.8%、9.9%、9.7%,且具有100%特异性;应用该方法在低于临床检测下限的乙型肝炎低病毒血症患者中,以1 copy/μL为临界值,HBV DNA的阳性检出率为68.42%。结论建立的ddPCR检测低病毒载量HBV DNA检测方法能够高灵敏和高特异地对乙型肝炎低病毒血症患者HBV DNA实现绝对定量。

利用微滴式数字PCR技术检测大豆毛油中的转基因成分

我国是转基因大豆的进口大国,由转基因大豆加工而成的大豆油成为进入消费者生活的食用油,判定食用的大豆油是否含有转基因成分,是国家监管部门和公众消费者密切关心、关注的问题。大豆油在制备精炼过程中破坏了大豆的DNA,造成检验时DNA富集难度增加,严重影响了大豆油转基因成分检测的准确度。到目前为止,国家已经颁布的标准中没有涉及转基因大豆油的检测标准。本研究利用高灵敏度、精确度的数字PCR技术,并通过优化大豆毛油DNA提取方法和PCR反应体系,对大豆毛油样品进行外源转基因成分检测。检测结果显示,大豆毛油外源转基因成分被成功检测到。实验结果表明,本研究建立的大豆毛油转基因成分检测方法准确可靠,可进行推广应用。

运用微滴式数字PCR技术检测转基因玉米品系的研究

[目的]运用微滴式数字PCR技术检测转基因玉米品系。[方法]基于微滴式数字PCR平台,建立3种转基因玉米品系TC1507、MIR162、MIR604的二重微滴式数字PCR(dd PCR)检测方法。[结果]特异性试验结果显示,该法只有特定品系的靶序列才有扩增信号。灵敏度试验表明,该方法在10 pg基因组DNA用量时可定量检测到2~16个拷贝。[结论]该研究建立的3种转基因玉米品系定量检测方法特异性强、灵敏度高,可用于进出口农产品中3种转基因玉米品系成分的定量检测。

艾滋病模型中关键指标SIV DNA绝对定量微滴式数字PCR技术的创新应用

目的建立微滴式数字PCR技术(droplet digital PCR,ddPCR)作为关键指标,实现精准检测艾滋病动物模型中细胞及组织中SIV DNA载量,用于储存库隐匿病毒实时动态评估。方法根据成熟的qPCR方法,对微滴式dPCR的反应条件进行了优化,确定最适退火温度;通过对10倍系列稀释pGEM-SIVgag477质粒标准品的检测,确定ddPCR检测范围。并通过对若干DNA样品的多次检测,判断该检测方法的稳定性。结果ddPCR的退火温度为60℃;检测范围是0.3~3.96×104 copies/μL;微滴式dPCR与qPCR有良好的相关性,相关系数r=0.9981。结论本研究建立了基于微滴式dPCR的SIV病毒DNA的绝对定量方法,可有效的对细胞和组织中病毒储存库样本中病毒DNA载量进行动态绝对定量,极大提高了模型应用评价的准确度。

利用微滴式数字PCR技术检测初榨菜籽油中的转基因成分

我国是食用植物油脂、油料进口大国,鉴于全球转基因油菜种植现状,由转基因油菜籽加工而成的菜籽油已经成为了消费者生活中的食用油,判定食用的菜籽油是否含有转基因成分,是国家监管部门和公众消费者密切关注的问题。食用植物油转基因成分检测技术长期以来受限于油脂中的核酸分离纯化,目前为止暂无现行有效的检测标准。本研究同时采用实时荧光PCR技术和微滴式数字PCR (ddPCR)技术检测初榨菜籽油中的外源基因成分,初探ddPCR技术用于检测食用植物油中转基因成分的可行性,结果显示,ddPCR检测结果与实时荧光PCR结果一致,均能检出转基因初榨菜籽油中的转基因成分,为后续开展食用植物油中转基因成分精准定量检测奠定了基础。

基于微滴式数字PCR技术对猪内源逆转录病毒拷贝数的检测方法的建立及应用

目的利用微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)技术,对猪基因组中猪内源逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)拷贝数测定方法进行优化,建立PERV拷贝数的检测方法。方法采用Taq Man探针双重dd PCR方法,分别以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和转铁蛋白受体(transferrin receptor,TFRC)为内参基因,确定对PERV拷贝数检测反应最适合退火温度和反应循环数。另外,通过对浓度梯度稀释的标准品质粒和猪细胞基因组进行检测,以确定最适模板浓度。采用dd PCR和q PCR两种方法测定来自猪源细胞系和巴马小型猪组织中PERV的拷贝数,比较两种检测方法的稳定性。结果基于dd PCR技术检测PERV拷贝数的最适退火温度为59.9℃,最佳反应循环数为50;模板基因组的最适浓度在1.25~7.5 ng;检测同一样品来源基因组中PERV的拷贝数的变异系数在0.44%~8.29%。结论本研究建立了基于dd PCR技术的PERV拷贝数的检测方法并系统的探索了最佳实验条件,与传统的q PCR相比,该方法具有更高的准确性和可重复性,为异种移植研究中供体动物基因组PERV拷贝数的测定提供了灵敏的方法和可靠依据。