杆状病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及验证

目的建立杆状病毒(baculovirus,BV)微滴式数字PCR检测方法,并对其退火温度、引物及探针浓度优化后,进行方法验证。方法根据GP64基因保守序列特征,设计特异性引物及TaqMan探针,建立靶向BV的微滴式数字PCR检测方法,优化体系的退火温度、引物及探针浓度,并进行方法的特异性、重复性、灵敏度、线性验证;采用建立的微滴数字式PCR法检测GMP中试生产车间24份样本,并与蚀斑法检测结果继续比较。结果建立了靶向BV的微滴式数字PCR检测方法,优化后的退火温度、引物及探针浓度分别为58.0℃、400 nmol/L、200 nmol/L。仅以BV核酸为模板的反应中检测到阳性液滴,方法特异性良好;批内重复性CV在2.78%~7.45%之间,批间重复性CV在2.28%~7.05%之间,均<10%,方法重复性良好;最低检测限为3.06 copies/μL,约为常规PCR的100倍,方法灵敏度高;24份样本检测结果与蚀斑法接近,相关系数(r)为0.913。结论成功建立了针对BV的优化后的微滴式数字PCR检测方法,该方法具有良好的特异性、重复性、灵敏度、快捷性,可用于生产中BV的快速检测。