结核分枝杆菌微滴数字PCR检测试剂盒企业参考品的研制

为实现结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒的质量检验,研制了结核分枝杆菌微滴数字PCR检测试剂的企业参考品。将结核分枝杆菌减毒株H 37 Ra、BCG、耻垢分枝杆菌与海分枝杆菌分别在适宜的培养条件下培养,收集新鲜且充分混匀的培养物,计数后灭活、稀释和分装,对参考品进行稳定性评估。使用结核分枝杆菌PCR检测试剂盒进行验证,研制出了一套专用于微滴数字PCR检测试剂的企业参考品,其由2份结核分枝杆菌灭活菌液组成阳性参考品、2份非结核分枝杆菌灭活菌液组成阴性参考品,最低检出量参考品由10^(3)、10^(2)、10^(1)、10^(0)CFU/mL的结核分枝杆菌(灭活H 37 Ra)菌液组成,精密性参考品由10份10^(2)CFU/mL的结核分枝杆菌(灭活H 37 Ra)菌液组成,可稳定保存,用于结核分枝杆菌PCR检测试剂盒(微滴数字PCR法)的质量评价。本参考品具有较好的准确性、特异性及重复性。

杆状病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及验证

目的建立杆状病毒(baculovirus,BV)微滴式数字PCR检测方法,并对其退火温度、引物及探针浓度优化后,进行方法验证。方法根据GP64基因保守序列特征,设计特异性引物及TaqMan探针,建立靶向BV的微滴式数字PCR检测方法,优化体系的退火温度、引物及探针浓度,并进行方法的特异性、重复性、灵敏度、线性验证;采用建立的微滴数字式PCR法检测GMP中试生产车间24份样本,并与蚀斑法检测结果继续比较。结果建立了靶向BV的微滴式数字PCR检测方法,优化后的退火温度、引物及探针浓度分别为58.0℃、400 nmol/L、200 nmol/L。仅以BV核酸为模板的反应中检测到阳性液滴,方法特异性良好;批内重复性CV在2.78%~7.45%之间,批间重复性CV在2.28%~7.05%之间,均<10%,方法重复性良好;最低检测限为3.06 copies/μL,约为常规PCR的100倍,方法灵敏度高;24份样本检测结果与蚀斑法接近,相关系数(r)为0.913。结论成功建立了针对BV的优化后的微滴式数字PCR检测方法,该方法具有良好的特异性、重复性、灵敏度、快捷性,可用于生产中BV的快速检测。

前列腺癌组织中胶原三股螺旋重复蛋白1基因转录水平微滴数字PCR检测方法的建立及验证

目的建立前列腺癌组织中胶原三股螺旋重复蛋白1(collagen triple helix repeat containing 1,CTHRC1)基因转录水平的微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,并进行验证。方法根据GenBank中登录的CTHRC1基因序列设计引物,扩增CTHRC1保守区基因片段,并合成含有该基因片段的PUC57质粒。经2%琼脂糖凝胶电泳验证引物的特异性后,采用PUC57质粒验证ddPCR法的正确度、精密性,并确定检测限及线性范围。采用建立的ddPCR法检测复旦大学附属中山医院泌尿外科住院患者73份前列腺穿刺组织样本(前列腺癌组织40份,非前列腺癌组织33份)中的CTHRC1基因转录水平,同时采用试剂盒检测患者血清中的总前列腺特异抗原(total prostate specific antigen,TPSA)水平,将相应结果进行ROC曲线分析,以获得CTHRC1-TPSA联合检测对诊断前列腺癌的预测概率。结果经2%琼脂糖凝胶电泳验证设计的引物具有良好的特异性。检测值和理论值之间的Log值差异均<1,且拟合度高,R2=0.9959,表明该方法具有良好的正确度;重复性验证CV均<10%,中间精密性验证CV均<15%;该方法的检测限为100copies/μL;检测值在100~104copies/μL范围内,与理论值呈良好的线性相关性,R2=0.9972。ddPCR法检测前列腺癌组织中CTHRC1基因转录水平显著高于非前列腺癌组织(Z=-4.339,P<0.001)。CTHRC1与TPSA联合诊断前列腺癌的ROC曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.847,灵敏度为83.3%,特异性为67.7%。结论ddPCR法可用于前列腺癌组织中CTHRC1基因转录水平的检测,与TPSA指标联合可提高临床诊断前列腺癌的准确性。