微滴PCR技术的研究进展

微滴PCR(microdroplet PCR)技术结合了PCR技术和乳化技术,该技术在乳化剂中进行,是一种新型的核酸扩增技术。它可以高效、高通量地扩增DNA分子,在生命科学研究领域得到了广泛的应用。文章就微滴PCR技术的基本原理、建立与发展及其应用作一综述。

猪圆环病毒2型数字微滴PCR检测技术的建立及应用

为建立猪圆环病毒2型(PCV2)的微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)检测方法,本研究针对PCV2ORF1基因设计引物和探针,经各反应条件的优化,确定反应体系中引物和探针终浓度分别为0.7μmol/L和0.25μmol/L,且退火温度为59℃时,ddPCR方法具有最佳的扩增效率(96%)。特异性试验结果显示,该ddPCR方法除了对PCV2检测结果为阳性外,对PCV1、PCV3和其它常见猪病病原的检测均未见阳性微滴,特异性较强。以10倍倍比稀释的重组质粒标准品pUC57-NA-ORF1为模板,利用建立的PCV2 ddPCR检测技术进行敏感性试验,结果显示,ddPCR的最低检测限达2.93拷贝/μL,比荧光定量PCR(qPCR)高10倍以上,敏感性较高。批内和批间重复性试验结果显示,其变异系数均小于10%,重复性较好。利用建立的PCV2 ddPCR对24份猪组织样品和70份宠物饲料样品进行检测,结果显示,该ddPCR方法对猪淋巴结、脾、肺和肾脏等组织样品的检测结果与qPCR的检测结果一致,均检出10份阳性样品。但ddPCR对饲料样品的检测更为灵敏,共检出PCV2阳性样品14份,其中有5份样品的qPCR检测结果为阴性,表明本研究建立的ddPCR方法敏感性、抗干扰性和可靠性更高。本研究首次建立了PCV2 ddPCR检测方法,为饲料等复杂基质样品中PCV2的检测提供了有力技术手段。

尼罗罗非鱼无乳链球菌微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

通过设计筛选引物和探针、优化反应浓度和退火温度,构建一种尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的微滴式数字PCR(dd PCR)检测方法,分析该方法的敏感性、特异性及重复性,并应用于临床样品检测。结果显示:当引物、探针浓度分别为0.9μmol·L^(-1)、0.3μmol·L^(-1)且退火温度为56.9℃时,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR方法阴、阳性微滴分布界限明显,平均拷贝数高,有较高扩增反应效率;线性关系线良好(R^(2)=0.997 3),最低检测限为2.56 copies·μL^(-1);与猪链球菌2型、鱼类海豚链球菌和其他5种常见的水生动物疫病病原体无交叉反应;重复变异系数为3.15%;临床样品检测结果与实时荧光PCR方法结果的符合率100%,与细菌分离鉴定方法结果符合率为94.12%。结果表明,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可对罗非鱼无乳链球菌感染的临床样品进行定量检测,为尼罗罗非鱼无乳链球菌的研究提供有益参考。

微滴式数字PCR在检测胃腺癌和结直肠腺癌NTRK基因融合中的应用

目的评估微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)应用于NTRK基因融合检测的可行性。方法回顾性分析830例原发性结直肠腺癌和560例胃腺癌样本,分别运用免疫组织化学(IHC)和荧光原位杂交(FISH)技术检测石蜡包埋肿瘤组织中pan-TRK蛋白表达情况以及NTRK1/2/3基因断裂情况。FISH及IHC阳性样本进一步行二代测序(NGS)检测及ddPCR检测。结果所有石蜡包埋肿瘤样本均成功进行IHC和FISH检测。FISH或IHC阳性样本合计26例,其中FISH阳性21例,IHC阳性18例。26例阳性样本进一步行RNA Seq NGS、DNA Seq NGS及ddPCR检测。DNA Seq NGS合计检测到14例NTRK基因融合,2例扩增。RNA Seq NGS合计检测到3例NTRK基因融合,ddPCR检测结果与RNA Seq NGS完全一致。结论ddPCR可有效区分FISH和DNA Seq NGS检测为NTRK非典型融合的结直肠腺癌和胃腺癌病例,可以作为除FISH之外NTRK基因初筛方法的补充。

血小板HPA-3,HPA-15基因分型微滴式数字PCR检测体系的构建

目的建立血小板HPA-3,HPA-15基因分型的微滴式数字PCR(ddPCR)高灵敏检测方法,并初步探索应用于孕妇外周血胎儿游离DNA HPA抗原相容性检测的可行性。方法针对HPA-3,HPA-15的SNP突变位点,设计特异性引物及MGB探针,优化ddPCR退火温度及引物浓度等扩增条件,建立最佳反应体系,明确检验程序。对该检测方法进行方法学性能评估包括特异性、灵敏度、重复性和稳定性。利用ddPCR技术对2022年6月至2023年6月67例临床血液标本进行检测,将等位基因分型结果与基因测序结果比较,并对52例母体外周血胎儿游离DNA HPA抗原进行检测。结果检测血小板HPA-3,HPA-15的ddPCR方法,引物及探针特异性良好,HPA-3,HPA-15的最佳退火温度分别为:61.6℃,60.2℃;体系最佳引物浓度分别为:900 nM,700 nM;探针终浓度均为250 nM。拷贝数定量检测范围为:2~20000 copies,检测下限为0.1 copies/μL且线性良好。在低拷贝数标本中,HPA-3及HPA-15实际检测值的批内及批间变异系数(CV)均<5%。对67份人血液标本DNA的HPA-3,HPA-15基因型检测,结果与基因测序结果完全一致。应用于胎母血小板HPA-3,HPA-15基因型检测结果符合预期。结论本研究构建的HPA-3,HPA-15 ddPCR检测体系准确性高,重复性及稳定性较好,灵敏度高,可应用于临床血小板HPA-3,HPA-15基因型供者库的建立、基因配型及胎母血小板相容性检测等。

水貂阿留申病毒的微滴式数字PCR方法的建立及初步应用

为建立水貂阿留申病毒(AMDV)微滴式数字PCR (ddPCR)检测方法,本研究根据AMDV VP2基因的保守区设计特异性引物和探针,通过PCR扩增AMDV VP2基因并克隆至p MD19-T载体,构建重组质粒p MD19-T-AMDV,并经PCR和测序鉴定后利用该质粒标准品作为模板,通过各反应条件的优化,初步建立了检测AMDV的ddPCR方法。分别以AMDV、水貂肠炎细小病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒、水貂流感病毒基因组为模板,按照本研究建立的ddPCR方法检测,评估其特异性;将1.43×10^(7)拷贝/μL~1.43×10^(0)拷贝/μL的重组质粒标准品作为模板,采用优化后的ddPCR和文献中的荧光定量PCR (qPCR)检测,评估该方法的敏感性;分别以不同浓度的重组质粒标准品作为模板,采用优化后的ddPCR分别进行批内和批间重复性试验,以变异系数(CV)评估该方法的重复性。优化结果显示,该方法的最佳引物终浓度为400 nmol/L (1.2μL)、探针终浓度为200 nmol/L (0.6μL)、退火温度为60℃。特异性试验结果显示,该方法仅可检测到AMDV和质粒标准品,而其他相关病毒均为阴性结果。敏感性试验结果显示,该方法对重组质粒标准品的检测限为1.43拷贝/μL,qPCR对质粒标准品的检测限为1.43×10^(2)拷贝/μL,前者比后者的敏感性高100倍。重复性试验结果,批内和批间重复性试验的变异系数均小于3%。对采集的70份病貂肝脏、脾、肾脏、环境拭子、肛拭子样品进行ddPCR和qPCR检测,结果显示,ddPCR对AMDV的检出率为24.28%(17/70);qPCR的检出率为15.7%(11/70),二者的阳性符合率为64.7%,阴性符合率为89.83%,总符合率为91.42%。上述结果表明,本研究建立的ddPCR方法特异性强、敏感性高和重复性好,可以检测各种临床样品及含量极低样品中的AMDV,为AMDV早期感染的检测、流行病学调查及AMD的防控提供有力技术手段。

SARS-CoV-2 Omicron变异株多重微滴式数字PCR定量方法的建立及应用

【目的】为建立精准、高效的多重微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量分析检测方法,开发可同时鉴别新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)ORF1ab基因、N基因、E基因以及Omicron变异株S基因的检测体系,提高病毒性传染疾病的诊断效率及传播风险监测能力。【方法】通过筛选保守基因序列并设计特异性引物与探针,优化反应体系和扩增程序,对该方法的特异性、灵敏度及稳定性进行评价。以临床样本为实验材料,利用建立的ddPCR方法进行检测和验证,确定阳性检出率。【结果】多重ddPCR反应体系中,各对引物探针对目的片段均能有效扩增,SARS-CoV-2 ORF1ab基因、N基因、E基因以及Omicron变异株S基因灵敏度检测下限分别为0.59、0.68、1.44、1.03 copies/μL。在20份临床样本的核酸检测中,共检出16份阳性样本,阳性率达80%(16/20),经荧光定量PCR方法复测符合率一致。【结论】研究建立的多重ddPCR方法特异性强、灵敏度高,可实现对临床样本中微量新冠病毒的精确定量检测。

水貂阿留申病毒微滴式数字PCR检测方法的建立与应用

为建立一种准确且灵敏的水貂阿留申病毒(AMDV)微滴式数字PCR检测方法(dd PCR),本研究根据AMDV-G基因保守区,设计特异性引物及探针,并对反应条件进行优化,初步建立检测AMDV的dd PCR方法。同时对该方法的特异性、敏感性和重复性进行分析。结果显示,dd PCR的退火温度为55℃,最佳引物和探针终浓度均为10μmol/μL。绘制的标准曲线结果显示,核酸标准物质稀释倍数的对数与对应检出拷贝数的对数之间呈良好的线性关系(R^(2)=0.9945>0.99)。建立的dd PCR方法的特异性强,除能检测到AMDV以外,对相关病原如水貂犬瘟热病毒、犬细小病毒、貂肠炎病毒、犬冠状病毒、犬腺病毒I型、狂犬病毒的检测结果均为阴性。对AMDV核酸标准物质的检测限为6.2拷贝/μL,敏感性高,比荧光定量PCR(q PCR)敏感性高10倍。对不同稀释度AMDV核酸标准物质的批内和批间重复性试验的变异系数均<5%,重复性好。采用建立的dd PCR方法和荧光定量PCR方法对貂场采集的40份水貂脏器组织样品进行检测,两种检测结果基本一致,但dd PCR敏感性更高。上述结果表明,本研究建立了一种特异性强、灵敏度高、重复性好的AMDV定量检测方法,为水貂阿留申病毒的有效防控提供技术支持。

微滴式数字PCR技术快速诊断侵袭性念珠菌病的方法建立

目的建立基于微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术快速检测重症患者侵袭性念珠菌感染的方法。方法基于微滴式数字PCR平台建立检测体系,设计四种念珠菌(白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带滑念珠菌)特异性引物探针;(1)对无模板对照(no tmplate contral,NTC)样品进行检测,确定空白限(limit of blank,LOB)范围和阳性判断值;(2)通过对阳性样本进行稀释,每个浓度梯度各进行10次重复提取检测,确定检测限(limit of detection,LOD)范围;(3)重复检测稀释后的样本,确定定量限(limit of quantitation,LOQ)范围;(4)对阳性样品进行梯度稀释,确定线性范围;(5)通过2个高低浓度的阳性样本提取检测,进行12次重复性测试,计算结果浓度对数值的变异系数(CV);(6)通过具有真菌培养结果的临床样本进行检测,评估方法可靠度。结果ddPCR检测念珠菌LOB在0~81 copies/mL之间,阳性判断值为≥3个阳性微滴;LOD为3×10^(2) copies/mL;LOQ为3×10^(2) copies/mL;不同浓度梯度检测线性范围是3×10^(2)~3×10^(7)copies/mL,相关系数为:白色念珠菌R^(2)=0.9995、光滑念珠菌R^(2)=0.9989、近平滑念珠菌R^(2)=0.9994、热带滑念珠菌R^(2)=0.999;结果浓度对数值的CV<5%,满足精密度要求;通过检测建立方法初步验证临床标本,结果与临床培养结果一致。结论ddPCR对重症患者侵袭性念珠菌感染的检测灵敏度高、重复性好,特异性高。

鸭瘟病毒微滴数字PCR方法的建立与优化

为快速、准确检测鸭瘟病毒(duck enteritis virus,DEV),根据GenBank中DEV UL6基因序列,设计了微滴数字PCR(ddPCR)的引物和探针,通过条件优化,建立了检测DEV的ddPCR方法,并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行了验证。结果显示:在57.1℃退火温度下,当引物浓度为1.50µmol/L,探针浓度为0.45µmol/L时,病毒拷贝数浓度达到最大,为332 copies/µL;该方法的最低检测限为0.7 copies/µL,且对非鸭瘟病原均仅扩增出阴性微滴,无交叉反应;组内和组间重复试验变异系数均小于10%。结果表明,本研究建立的DEV ddPCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好和稳定性高的优点,可用于低DEV含量样品的检测及其感染的早期诊断和流行病学调查。

微滴数字PCR在重症急性胰腺炎疑似血流感染病原学诊断中的应用

目的探讨微滴数字聚合酶链反应(ddPCR)在重症急性胰腺炎(SAP)合并疑似血流感染(BSI)病原学诊断中的价值。方法选取2022年7—9月某院重症医学科收治的SAP患者,在疑似BSI发作时同步采集静脉血进行ddPCR检测和血培养(BC)及药敏试验(AST),记录两种检测方法的耗时,比较ddPCR与BC的检测结果,计算ddPCR的病原学诊断效能,并探讨ddPCR检测病原菌载量值与感染指标水平的相关性。结果共纳入22例患者,采集52份静脉血标本进行检测,BC阳性17份(32.7%),检出病原体29株;ddPCR阳性41份(78.8%),检测出病原体73株。ddPCR耗时低于BC[(0.16±0.03)d VS(5.92±1.20)d,P<0.001]。在ddPCR检测范围内,以BC为金标准,ddPCR检测的灵敏度和特异度分别为80.0%、28.6%;联合检测前1周内非血标本微生物证据综合判定BSI,ddPCR检测的灵敏度和特异度分别提高至91.9%、76.9%。ddPCR耐药基因检测中,19份检出bla KPC,9份检出bla NDM/IMP,6份检出V an A/V an M,5份检出mec A。相关性分析显示病原菌载量值与C反应蛋白、降钙素原水平呈正相关(r分别为0.347、0.414,均P<0.05)。结论ddPCR作为一种辅助BC诊断BSI的检测方法具有灵敏度高、耗时低等优势,值得进一步探讨其在临床中的应用。

微滴式数字PCR定量检测伯氏考克斯氏体方法的建立及应用

为建立伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii,Cb)微滴式数字PCR(Droplet Digital PCR, ddPCR)检测方法,研究以Cb IS1111基因为靶基因,并针对基因保守区域设计了特异性引物和探针,以使反应的条件更加完善,从而构建了ddPCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性及重复性作出了评估。结果显示,所采用的ddPCR方法最低可检测的浓度为0.52 copies/μL,敏感性较高;与动物布鲁氏菌、牛结核分枝杆菌、土拉杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌无交叉反应,特异性强;组内重复和组间重复变异系数均小于10%,重复性好。使用本实验建立的方法检测了42份疑似感染的临床样品,检测结果与荧光PCR鉴定结果一致。表明建立的ddPCR方法的特异性强、敏感性高、重复性和准确性好,可用于Cb的快速检测和精准定量,对Cb感染的防控具有重要意义。

基于微滴数字PCR技术检测致敏原芒果成分

[目的]建立微滴数字PCR技术检测致敏原芒果成分的方法。[方法]选取叶绿体trnH-psbA基因作为致敏原芒果成分检测的靶基因,设计特异性引物探针,对微滴数字PCR方法反应条件进行优化,对方法的灵敏度和稳定性进行验证,并应用于10批次食品样品中致敏原芒果成分检测。[结果]试验建立的微滴PCR方法特异性较好,不与芒果以外10种其他水果交叉反应,在上、下游引物和探针浓度分别为200,200,100 nmol/L,退火温度为52℃的最适微滴PCR反应条件下,方法的核酸水平检测灵敏度为5 pg/μL,芒果质量含量检测灵敏度为5 mg/kg,方法变异系数<25%,重复性好,应用于10批次食品样品检测结果与食品标签一致。[结论]该方法具有快速、特异性、灵敏度高的优点,适用于致敏原芒果成分的检测。

微滴式数字PCR定量检测包装饮用水中铜绿假单胞菌

建立一种微滴式数字聚合酶链式反应(Droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)定量检测包装饮用水中铜绿假单胞菌的技术。根据铜绿假单胞菌外毒素A(ETA)基因序列合成特异性引物和探针,通过多种菌株扩增验证方法特异性,通过人工添加铜绿假单胞菌验证方法检出限。结果表明,建立的包装饮用水中铜绿假单胞菌ddPCR定量检测方法特异性强,检出限为10 CFU/mL,灵敏度高,适用性好。该方法可以满足包装饮用水中铜绿假单胞菌定量检测需求。

基于微滴式数字PCR定量牛肉中的鸭源性成分

采用微滴式数字PCR(ddPCR)技术建立一种牛肉中鸭源性成分的检测方法。以牛和鸭的单拷贝核基因ACTB为靶基因,合成特异性引物和探针。通过引入一个固定的常数K(转换系数),直接将ddPCR测定的DNA拷贝数转换为肉类的质量分数。根据模拟混合样本中已知的肉质量分数和实际测得的DNA拷贝数之间的关系,计算和验证K值,进而建立牛肉中鸭源性成分的计算公式,并用于牛肉/鸭肉人工模拟混合样本和市售牛肉制品中鸭源性成分的定量检测。结果表明,所建立的ddPCR方法能特异性定量检测牛肉中鸭源性成分,K值为0.16,定量检测公式为M_(D)/M_(B)=0.16×Q_(D)/Q_(B),式中M_(D)和M_(B)分别为鸭肉和牛肉的质量;Q_(D)和Q_(B)分别为鸭和牛ACTB的拷贝数。牛肉中掺杂鸭肉的质量分数在1%~90%范围,该函数均具有较好的线性关系,R^(2)>0.99。该定量方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.1%和0.5%。人工模拟混合样本中鸭肉粉质量分数为20%~80%时,检测结果绝对误差均<1.0%。16份市售牛肉制品样本中,2份被检出鸭源性成分,含量分别为44.87%和18.21%,与商品标签不符。本研究建立的ddPCR方法具有良好的特异性、灵敏性、准确性和适用性,可实现牛肉中鸭源性成分的定量检测,为我国牛肉及其制品质量安全监管提供技术支撑。

鸡传染性喉气管炎病毒微滴式数字PCR定量检测方法的建立

旨在建立检测鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus, ILTV)绝对定量方法。根据已发表的鸡ILTV的TK基因序列,针对其保守区域分别设计1对特异引物和1条探针,建立检测鸡ILTV的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,建立方法的最佳引物浓度为20μmol/μL,最佳探针浓度为10μmol/μL,最佳退火温度为56℃。特异性检测结果显示,建立的方法只检出ILTV,没有检出其他病原株。敏感性检测结果显示,采用建立的方法定量检出ILTV重组质粒标准品的最低限为4.6拷贝/μL。对3个连续稀释的pMD18-ILTV重组质粒DNA进行检测,3次重复检测结果的变异系数均小于5%。对83份病鸡喉拭子、肺及脾组织样品进行检测,采用建立的ddPCR检出ILTV阳性样品10份,荧光定量PCR检出ILTV阳性样品9份,ddPCR的阳性检出率(12.05%)高于荧光定量PCR的阳性检出率(10.84%)。结果表明,建立的ddPCR方法定量检测ILTV特异性强、敏感性高、重复性好,为绝对定量检测ILTV提供更好的技术支撑。

微滴式数字PCR技术在动物疫病检测中的应用研究进展

数字PCR(dPCR)技术是最近发展起来的第三代PCR技术,其中微滴式数字PCR(ddPCR)技术具有敏感性高、耐受性强,准确性和重复性好,可实现不依赖标准曲线即可对样本目标核酸进行绝对定量的优点,得到研究者的广泛关注。ddPCR技术凭借诸多优势,近年来在动物疫病病原检测领域得到了飞速发展,已被成功应用于病毒、细菌、寄生虫以及支原体、衣原体等多种病原的检测,尤其为低丰度病原调查、实验室检测和病原分型鉴定提供了强有力的技术支撑。本文综述了ddPCR技术的基本原理及其在动物疫病诊断中的应用和发展前景,以期为ddPCR技术在兽医实验室动物疫病诊断方面的推广提供参考。

微滴式数字PCR技术在菜豆晕疫病菌检测中的应用

为了建立菜豆晕疫病菌(Pseudomonas savastanoi pv.phaseolicola)微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,实现菜豆晕疫病菌的高效率、高精度的检疫鉴定和疫情监控,以菜豆晕疫病菌为研究对象,以位点特异性重组酶作为靶标基因,SSRP_F、SSRP_R、SSRP_P为特异性引物与探针,建立菜豆晕疫病菌ddPCR反应体系,结果表明,菜豆晕疫病菌的ddPCR检测体系的绝对定量检测低限为0.6 copies/μL,ddPCR的检测灵敏度比常规PCR高2个数量级。同时研究了种子携带菜豆晕疫病菌是否具有活性,提高了疫情检出率。

应用微滴数字PCR技术快速检测食用菌中沙门氏菌

定量风险评估是整个风险评估体系的发展趋势和终极体现形式,而快速、准确、简便的定量技术则是保障整个体系顺利、有效完成的核心支撑。作者根据沙门氏菌inv A毒力基因序列,在前人对引物研究结果基础上,合成特异性引物和探针。以沙门氏菌标准菌株为研究对象,建立沙门氏菌微滴数字PCR的快速定量检测方法,并对其特异性、灵敏度、样品实测等关键指标与传统培养法进行对照验证。结果表明,所建立的微滴数字PCR方法具有较好的特异性,检测灵敏度可达到10~2CFU/m L,样品实测与传统国标法对比,二者符合率100%。所建立的沙门氏菌微滴数字PCR定量检测方法,可以快速、准确、直接地分析沙门氏菌的含量,无需构建质粒和标准曲线,避免了因标准曲线量值偏差而影响样品定值的准确性,所建立的方法为食源性沙门氏菌污染的快速定量检测提供了技术支撑,为微生物风险评估体系的完善奠定了基础。

伪狂犬病病毒微滴数字PCR定量检测方法的建立

为了建立伪狂犬病病毒(PRV)微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)的检测方法,以伪狂犬病病毒gB基因为靶基因,建立了可对其准确定量的微滴数字PCR方法。对ddPCR反应中的引物浓度、探针浓度、退火温度进行了优化。对建立的ddPCR方法的特异性和敏感性也进行测定,并且应用于临床样品的检测。结果表明,ddPCR的最佳引物浓度为0.9μmol·L^(-1),探针浓度为0.25μmol·L^(-1),退火温度为60℃。ddPCR方法线性相关系数(R2)为0.998,显示呈良好的线性关系。检测限为6.1copies·μL^(-1),比荧光定量PCR(Real Time PCR,qPCR)的检测限低,变异系数为2.81%,与其他病毒无交叉反应。通过对临床样品的检测,与病毒分离比较,ddPCR方法的敏感性为87.5%,特异性为96.2%,符合率为97%。结果表明新建立的ddPCR方法,敏感性高、特异性强,可用于伪狂犬病病毒的定量检测。