流式免疫多重微球芯片技术检测干燥综合征自身抗体的评价及应用

目的建立多重微球芯片流式免疫荧光发光法检测原发性干燥综合征(pSS)自身抗体的评价及应用。方法采用多重微球流式免疫荧光发光法,以聚苯乙烯微球为反应界面,将8种[SSA(60kD)、SSB、α-fodrin、M3、ds-DNA、nRNP/Sm、Sm、M2]抗人IgG单克隆抗体包被微球后,用该方法检测同一血清样本中的多种可溶性蛋白抗体。选取pSS患者206例、非pSS患者110例和健康人69例,用多重微球流式免疫荧光发光法检测8种自身抗体。结果多重微珠流式免疫荧光发光法检测8种抗体的批内差异及批间差异均较小;检测pSS组的8种抗体水平与非pSS组、健康组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);诊断pSS的总敏感度可达97.20%,总特异性可达96.34%。结论多重微球流式免疫荧光发光法检测pSS自身抗体方法可以一次同时进行8种自身抗体的联合检测,为pSS及其他自身免疫病的确诊创造了一种准确、便捷的检测新方法。

凝胶微球芯片实验数据分析方法的设计与应用

在一种使用凝胶微球芯片新技术进行基因突变分析的生物学方法中,芯片上红绿两种颜色微球个数的比例代表了正常基因与突变基因的比例。针对微球芯片扫描的图像,发展一种新的方法对图像进行处理和分析,自动识别不同颜色的微球,得到分别代表野生型和突变型的红色微球和绿色微球的各自个数,并开发了相应软件。取单色通道,然后灰度化,使用迭代法和大津法进行二值化的阈值选取,再用中值滤波算法进行噪声杂点消除,最后进行信号点识别及计数。通过对扫描图像的人工计数和软件计数结果的对比,新的方法相对于人工计数结果的偏差率小于10%。实践表明,新方法在处理和分析微球芯片图像时,目标识别结果达到要求,相应软件已在大肠癌早期诊断的生物学研究中应用,提高了分析效率。

流式免疫微球芯片技术分析特异性血小板自身抗体

目的建立流式免疫微球芯片技术（FCIBA）分析特异性血小板自身抗体的新方法。方法使用不同红色荧光强度的微球，包被不同血小板膜蛋白单克隆抗体（抗GPⅡb／Ⅲa、抗GPⅠa／Ⅱa、抗GPⅣ、抗GPⅠb／Ⅸ和抗HLA-ABC单克隆抗体），制备特异性血小板自身抗体检测微球，用流式细胞仪检测微球捕获的血小板抗原-自身抗体复合物，检测结果与微孔板改进抗原捕获ELISA（MACE）进行比较，并检测了部分免疫性以及非免疫性血小板减少性紫癜患者血清中的5种特异性血小板自身抗体。结果FCIBA分析抗GPⅡb／Ⅲa、抗GPⅠa／Ⅱa、抗GPⅣ、抗GPⅠb／Ⅸ和抗HLA-ABC5种特异性血小板自身抗体，批内重复性变异系数（CV）分别为4．82％、6．09％、5．04％、5．73％、5．30％；稀释试验呈对数线性相关，相关系数（r）分别为0．9972．0．9966．0．9988．0．9965、0．9982；新方法对5种特异性血小板自身抗体的分析结果均与MACE试验结果高度相关，r值分别为0．9289、0．9224、0．8894、0．9100、0．9134（P均〈0．01）。新方法分析98例免疫性血小板减少性紫癜患者的血清样本，血小板特异性自身抗体检出的阳性率为51．69％；其中，抗GPⅡb／Ⅲa为40．82％，抗GPⅠa／，Ⅱa为24．45％，抗GPⅣ为19．39％，抗GPⅠb／Ⅸ为32．65％，抗HLA-ABC为17．35％。新方法分析40例非免疫性血小板减少性紫癜患者的血清样本，阳性率为0。结论本研究建立了FCIBA分析特异性血小板自身抗体的新方法，可同时分析抗血小板GPⅡb／Ⅲa、GPⅠa／，Ⅱa、GPⅣ、GPⅠb／Ⅸ和HLA-ABC5种特异性血小板自身抗体。

超级细菌NDM-1基因高通量微球悬浮芯片检测方法的建立

本研究以建立微球体悬浮芯片检测方法为目的,选择三种超级细菌NDM-1基因(metallo-beta-lactamase 1 gene)为目的基因,设计并合成标记特异性探针,与荧光编码微球偶联后与细菌NDM-1基因的PCR产物杂交反应,用微球悬浮芯片检测仪检测荧光信号,建立可快速检测该种基因的微球体悬浮芯片检测方法。特异性和灵敏度检测结果表明:该方法对NDM-1基因检测具有特异性,最低检测限可达10fg/μL,灵敏度高于普通PCR技术,提示微球体悬浮芯片是一种针对NDM-1的快速、灵敏、便捷的新型核酸检测技术。

流式微珠阵列术在医学中的研究进展

随着高分子微球技术的日益创新,流式细胞术与高分子微球技术相结合的流式细胞微球芯片捕获技术也随之产生,流式细胞微球芯片捕获技术又称为流式微球分析技术、流式微球技术、流式微珠阵列术,具有检测灵敏度高、特异性强、分析速度快等优点,应用前景广阔。我们就流式细胞微球捕获芯片技术在医学中的研究进展做简要综述。

慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者Th1/Th2细胞的细胞因子变化及与肝功能指标的关系

目的利用流式细胞微球芯片捕获技术(CBA)检测慢加急性乙型肝炎肝衰竭(ACHBLF)患者辅助性T细胞1/2(Th1/Th2)分泌的细胞因子水平,探讨其在ACHBLF中变化的意义。方法收集33例ACHBLF、20例慢性乙型肝炎(CHB)患者血清及15名健康志愿者血清,CBA检测血清Th1/Th2细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,分析Th1/Th2细胞因子在ACHBLF患者血清中的变化。结果 ACHBLF患者外周血循环中TNF-α、IFN-γ、IL-4及IL-6的水平较CHB患者及健康对照者显著升高(P<0.05);ACHBLF患者血清中IL-2及IL-10与CHB组和健康对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。ACHBLF患者血清中IL-4、IL-6、TNF-α及IFN-γ水平与总胆红素(TBil)、白蛋白(Alb)和凝血酶原活动度(PTA)间无明显相关性。结论 CBA可同时检测各种细胞因子,适合临床应用;ACHBLF患者TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-6的变化可能参与ACHBLF的发生和发展,未发现上述细胞因子与反映肝功能指标间的相关关系。

流行性感冒发病初期利用流式细胞仪检测相关细胞因子的临床应用价值探讨

目的通过观察流感患者发病初期细胞因子水平变化,初步建立以流式多重微球芯片技术为主要方法的临床细胞因子检验方法,并探讨其临床意义。方法选取54例甲流病毒核酸阳性和20例甲流病毒核酸阴性的流感样患者作为流感发病组,其中甲流病毒核酸阳性患者分为轻症组和重症组,甲流病毒核酸阴性的流感样患者为甲流核酸阴性组;另选取35例健康对照人群作为对照组,对所有全血标本的细胞因子进行检测和统计学分析。结果细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-21(IL-21)、白细胞介素-12p70(IL-12p70)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-10(IL-10)、趋化因子-10(IP-10)、白细胞介素-2(IL-2)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)水平在流感患者发病初期明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);γ-干扰素(IFN-γ)在流感发病组和对照组中比较,差异无统计学意义(P>0.05);重症组IL-6、IP-10水平比轻症组、甲流病毒核酸阴性组高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 IL-6、IL-21、IL-12p70、IL-1β、IL-10、IP-10、IL-2、MCP-1均可作为发热患者的临床生物学评价指标,其中IL-6、IP-10可作为病情进展评估的重要指标。

AA、MDS和AML患者外周血T淋巴细胞相关细胞因子表达水平的对比研究

目的分析再生障碍性贫血(AA)、骨髓增生异常综合征(MDS)和急性髓系白血病(AML)患者外周血T淋巴细胞相关细胞因子表达水平的变化,探讨3种疾病的细胞免疫状态是否存在差异。方法采用流式细胞微球芯片捕获术(CBA)检测20例AA患者(AA组)、20例MDS患者[MDS组,难治性贫血(RA)与难治性贫血伴原始细胞增多(RAEB)各10例]、20例AML患者(AML组)和10名健康体检者(正常对照组)外周血中IL-4、IL-17、IFN-γ,TNF-α的表达水平,间接评价各组T淋巴细胞免疫状态,并作组间比较。结果与正常对照组相比,AA组IFN-γ、TNF-α、IL-17表达水平均较高,MDS-RA组IFN-γ和IL-17表达水平均较高(P均<0.05),MDSRAEB组和AML组IL-4表达水平均较高(P均<0.05)。与AA组比较,MDS组TNF-α表达水平较低(P<0.05)。与AML组比较,MDS组TNF-α、IFN-γ和IL-17表达水平均较高(P均<0.05)。与AA组比较,MDS-RAEB组和AML组IFN-γ、IL-17和TNF-α表达水平均较低(P均<0.05),但IL-4表达水平均较高(P均<0.05);与MDS-RA组比较,MDS-RAEB组和AML组IFN-γ、TNF-α和IL-17表达水平均较低(P均<0.05),而IL-4表达水平均较高(P均<0.05)。结论 AA、不同阶段MDS和AML患者所处的T淋巴细胞免疫状态并不相同。

三种小鼠血清中Th1/Th2类细胞因子正常值比较

目的建立健康正常BALB/c、C3H/HeJ和C3H/SW小鼠Th1/Th2中5种细胞因子正常水平,比较三种小鼠的差异性。方法用流式细胞仪及CBA试剂盒测定BALB/c、C3H/HeJ和C3H/SW小鼠血清中5种细胞因子水平。结果三种小鼠5种Th1/Th2细胞因子呈正态分布,95%可信区间可以被认可;三种小鼠IL-4I、L-5水平差异性不大(P>0.05),INF-γ、TNF-αI、L-2差异性较大,其中BALB/c小鼠Th1细胞因子水平均比两种C3H小鼠高,其中INF-γ和TNF-α具有显著性意义(P<0.05)。结论本实验建立了健康正常BALB/c、C3H/HeJ和C3H/SW小鼠Th1/Th2中5种细胞因子的正常参考值;BALB/c小鼠比C3H/HeJ、C3H/SW小鼠处于高免疫反应状态。

MDS、AML患者T淋巴细胞及相关细胞因子表达水平的研究

目的通过检测骨髓增生异常综合征(MDS)和急性髓系白血病(AML)患者外周血T淋巴细胞及其分泌的相关细胞因子表达水平的变化,研究此两种疾病免疫状态的区别并指导治疗。方法采用流式细胞微球芯片捕获术(CBA)及流式细胞术检测20例MDS患者[MDS组,难治性贫血(RA)与难治性贫血伴原始细胞增多(RAEB)各10例]、15例AML患者(AML组)和10名健康体检者(正常对照组)外周血中调节性T细胞(Treg)、白细胞介素-2(IL-2)、γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-17(IL-17)的表达水平,间接评价各组T淋巴细胞免疫状态,并作比较。结果与正常对照组相比,RA组TNF、IL-17、IL-2、IFN-γ表达水平均较高(P<0.05),RAEB组和AML组Treg、IL-10、IL-6、IL-4表达水平均较高(P<0.05)。与MDS-RA组比较,MDS-RAEB组和AML组TNF、IL-17、IL-2、IFN-γ表达水平均较低(P<0.05),而Treg、IL-10、IL-6、IL-4表达水平均较高(P<0.05)。结论不同时期的MDS和AML患者其免疫状态并不相同。

乙型肝炎肝衰竭患者血清细胞因子与肝功能指标的关系

目的探讨患有慢加急性乙型肝炎肝衰竭(ACHBLF)的患者体内辅助性T细胞1/2(Th1/Th2)所分泌的细胞因子的含量,并探讨其含量变化在ACHBLF中的作用。方法收集17例本院体检中心健康志愿者,35例患有ACHBLF以及18例患有慢性乙型肝炎(CHB)的患者的血清,利用流式细胞微球芯片捕获技术(CBA)检测血清中肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素4(IL4)、γ干扰素(IFNγ)、白细胞介素10(IL10)、白介素2(IL2)以及白介素6(IL6)的含量,并且分析ACHBLF患者血清内Th1/Th2细胞因子的变化情况。结果健康对照组以及CHB组外周血循环中的IFNγ、IL4、TNFα以及IL6较ACHBLF显著降低(P=0.016、0.020、0.017、0.018)。IL2和IL10在健康组和CHB组中的含量与ACHBLF患者中的含量相比,差异没有统计学意义(P>0.05)。ACHBLF患者血清中的凝血酶原活动度(PTA)、总胆红素(TBil)以及白蛋白(Alb)的含量与IFNγ、IL4、IL6以及TNFα的含量之间没有显著的相关性(P>0.05)。结论可能ACHBLF患者病情发展与血清中的细胞因子IL6、IFNγ、IL4以及TNFα有一定的相关性,没有发现肝功能与上述细胞因子之间的相关关系。CBA可以应用于对各种细胞因子的检测。

一例罕见7q11．23重复综合征的产前诊断

目的联合应用多种技术产前检测7q11．23重复综合征1例。方法采集1例孕中期胎儿的羊水及其父母的外周血样本，行染色体G显带分析，提取羊水DNA进行BoBs分析，同时用单核苷酸多态性微阵列芯片（single nucleotide polymorphism array，SNP array）进行全基因组拷贝数变异分析，最后用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）进行确诊。结果胎儿羊水细胞染色体G显带核型及父母染色体核型未见异常；BoBs分析检出胎儿7q11．23区存在重复；SNP—array Affymetrix CytoScan 750 KArray基因芯片分析结果显示胎儿染色体7q11．23区存在1．5Mb片段的重复；FISH检测确认胎儿为nucish7q11.23（ELN×3）。结论通过结合BoBs分析、SNParray以及FISH，产前诊断1例7q11．23重复综合征胎儿。

房水病毒载量和细胞因子检测在急性视网膜坏死诊断与治疗中应用的临床研究

目的探讨房水病毒载量和细胞因子检测在急性视网膜坏死(ARN)诊断治疗中的作用。方法回顾性分析2017年3月至2021年7月于北京地坛医院眼科就诊ARN患者10例(13只眼)的病例资料。其中,男性8例(10只眼),女性2例(3只眼);年龄24~66岁,平均年龄(35.1±10.2)岁。采集所有患者的房水,明确病毒种类。将患者治疗前房水中病毒载量高于10^(5)拷贝/ml定义为高载量组,低于者定义为低载量组。对所有患者均行静脉和玻璃体腔注射更昔洛韦治疗;对视网膜脱离者行玻璃体切除视网膜复位术或视网膜激光光凝术。检查所有患者治疗前后的最佳矫正视力、眼前节及眼底情况。采用聚合酶链式反应检测所有患者治疗前和每次随访时房水的病毒载量;采用流式细胞微球捕获芯片技术检测患者治疗前和随访时房水白细胞介素(IL)-6及IL-8的含量。房水病毒载量的下降速度以log(病毒载量)拷贝/ml表示。最佳矫正视力以例数和百分比表示;注射次数、房水病毒载量、IL-6及IL-8以中位数和四分位数表示。结果ARN患者10例(13只眼)均为感染水痘带状疱疹病毒(VZV)导致,治疗后视网膜病变均得到有效控制,玻璃体腔注射次数为2~9次,平均中位数和四分位数6(5,9)次。继发视网膜脱离者4例(5只眼),占38.46%(5/13)。其中,行玻璃体切除术者3例(3只眼),占60.00%(3/5);行视网膜激光光凝术1例(2只眼),占40.00%(2/5)。患者治疗前房水VZV平均载量的中位数和四分位数为2.69×10^(5)(4.27×10^(4),9.26×10^(7))拷贝/ml;治疗2周后病毒载量开始下降,logVZV平均每周下降(0.67±0.30)拷贝/ml;治疗6周后升高者3例(5只眼),占38.46%(5/13)。患者治疗前房水IL-6和IL-8平均含量的中位数和四分位数分别为2993.3(1655.9,18751.3)pg/ml和253.6(195.8,1682.2)pg/ml;治疗2周后分别为398.1(251.2,2511.8)pg/ml和63.1(15.8,125.9)pg/ml,较治疗前明显下降。高载量组和低载量组患者的病程分别为(14.00±4.47)d和(11.33±8.26)d,前者时间长于后者19.07%。高载量组和低载量组患者平均注射次数的中位数和四分位数分别为7(6,9)和6.5(4,9)。高载量组和低载量组患者终末最佳矫正视力≥0.1者分别为2例(2只眼)和4例(4只眼),分别占15.38%(2/13)和30.77%(4/13);<0.1者分别为4例(5只眼)和2例(2只眼),分别占38.46%(5/13)和15.38%(2/13)。高载量组和低载量组继发视网膜脱离者分别为4例(4只眼)和1例(1只眼),分别占30.77%(4/13)和7.69%(1/13)。结论ARN患眼房水的病毒载量在治疗后,经历平台期和对数下降期,并最终低至可检测阈值以下。房水IL-6和及IL-8含量可以评估眼内炎的严重程度。房水检测可以明确病毒种类,监测炎症反应和治疗效果,对于ARN的诊断与治疗具有重要参考价值。