微生物污染源解析技术研究进展

针对目前新兴的微生物污染源解析技术(MST)研究进展进行了归纳总结.结果表明,标记物的源强特征显著影响水体微生物污染水平的评估,选用标记物时应同时考虑灵敏度和源强特征;与非目标物种样品产生交叉反应导致标记物特异性降低,可通过稀释样品或DNA纯化等手段降低假阳性信号强度;粪便源解析文库(FTL)中应涵盖的宿主种类,以及每类宿主应纳入的个体数量均会影响建库源解析结果的准确性,可通过权重分析来确定源文库中各宿主应囊括的样本量,提高识别污染源的准确性;FTL中的物种与土著微生物分类较为接近时,SourceTracker难以准确区分微生物污染来源,将土著微生物信息纳入FTL并多次运行程序可提高SourceTracker识别污染源的能力.未来应加强对标记物灵敏度和源强特征之间相关关系的研究,同时探讨标记物源强特征产生差异的成因以及交叉反应产生的机理;另一方面,应深入探究粪源微生物种内变异程度和土著微生物的种类对建库源解析法的影响机制,以期建立准确、完善的微生物污染源解析技术.

水体微生物污染指示菌在不同营养水平下的稳定性

微生物污染指示菌在水体中的稳定性直接影响到定量的准确性及应用的适应性.通过建立水环境模拟反应器,以实时荧光定量PCR方法探究鸡粪中大肠埃希氏菌(EC)、拟杆菌(GB)及鸡源特异性基因(CB)等指示微生物在不同营养水平的水环境的稳定性及衰减特征.结果表明:所选微生物衰减较好的符合一级动力学模型.对照组和含有营养物质实验体系中指示微生物的衰减系数k分别为EC(0.135,0.134;前者为对照组,下同),GB(0.415,0.457),CB(0.425,0.437),说明营养物质对EC、GB、CB的衰减未有显著影响.有氧水环境中,GB、CB呈现快速衰减趋势,EC则变化相对缓慢.不同营养水平下3种微生物的衰减具有显著正相关性(P<0.05),均可作为良好指示菌以评价水体的微生物污染程度,但特征各异.

有氧和厌氧环境下指示微生物的稳定性特征

建立有氧和厌氧水环境模拟反应器,利用荧光定量PCR和高通量测序技术探究了猪源拟杆菌标记物、部分指示微生物和潜在致病菌在有氧及厌氧水环境中的变化特征.结果表明,指示微生物Streptococcaceae、Lactobacillaceae、Carnobacteriaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae和Prevotellaceae在不同反应器中均呈现出衰减趋势,但在有氧环境中的衰减幅度显著大于厌氧环境.因此,这几类指示微生物在有氧条件下适用于解析近期发生的污染事件.拟杆菌标记物GenBac和Pig-2-Bac在有氧环境和厌氧环境中均表现出二阶段衰减模式,且第一阶段为主要衰减阶段.但拟杆菌标记物在有氧环境中的衰减速率显著大于厌氧环境,表明有氧环境中拟杆菌标记物的稳定性较差.相关性分析显示潜在致病菌Prevotella、Pseudomonas和Erysipelothrix与拟杆菌标记物表现出较好的相关性(P<0.05),但仅Prevotella与标记物在有氧和厌氧环境中的相关性系数较为接近(0.913~0.953),表明拟杆菌标记物可作为Prevotella的指示标记物.

禽类特异性引物在珠江三角洲地区的适用性研究

以珠江三角洲地区为目标研究区域,采集不同地区猪、牛、人、狗、鸽、羊及家禽等72份粪便样品,进行DNA提取,并选取8种针对鸡肠道内优势菌群而开发出的特异性引物进行地区适用性验证。结果表明:粪便DNA提取试剂盒提取的DNA纯度符合后续PCR扩增实验要求。Faecalibaterium通用引物FAU-F/FAU-R(1~#)检出率为87%(63/72),对禽类、反刍动物及哺乳动物等都具有较好地检出效果。鸡的特异性Faecalibaterium引物Fach-F1/Fach-R1、Fach-F2/Fach-R2(2~#、3~#)、特异性短杆菌引物LA35F/LA35R(4~#)、特异性拟杆菌引物ch Bact-F1/ch Bact-R16、CP2-9F/CP2-9R(5~#、7~#)灵敏度较差;鸡的拟杆菌特异性引物q C160F-HU/q Bac265R-H(6~#)、鸡的梭状芽胞杆菌特异性引物CP3-49F/CP3-49R(8~#)特异性较差,在珠江三角洲地区都不具备较好的适用性。然而,当源解析的目标由鸡扩大至禽类,6~#及8~#引物的特异性分别提高至81%和72%,满足珠三角地区禽类粪便污染源解析的适用条件。