微生物蛋白质谷氨酰胺酶的初步分离纯化

蛋白质谷氨酰胺酶可以特异性地水解蛋白质和多肽的谷氨酰胺残基,研究了产吲哚金黄杆菌产生的微生物蛋白质谷氨酰胺酶的代谢曲线和初步的分离纯化。发酵过程中pH升高,氨浓度增加,到14 h时酶活达到最高为0.359 U/mL。发酵液离心去上清液经3 kD滤膜超滤4倍时,纯化倍数和得率都最高。超滤液加入4倍体积无水乙醇沉淀蛋白质,酶的得率最高为72.7%。沉淀用缓冲液复溶后,经过SP-Sepharose Fast Flow离子交换层析分离,得到单一峰。经过多步纯化后酶得率为31.72%,纯化倍数为124倍,经SDS-PAGE电泳鉴定为单一条带,分子量约为20 kD。

枯草芽孢杆菌优化表达蛋白质谷氨酰胺酶的研究

蛋白质谷氨酰胺酶(Protein-glutaminase,PG)作用于大分子蛋白质或其小侧链的谷氨酰胺,使其脱酰胺变成谷氨酸可提高蛋白质溶解性和乳化性,在食品行业应用广泛。PG来源于解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum),但原始解脘金黄杆菌菌株表达PG产量较低。为提高蛋白质谷氨酰胺酶表达水平,将来源于解朊金黄杆菌的蛋白质谷氨酰胺酶基因优化密码子,将密码子换成枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)偏爱密码子,再将密码子优化前后的PG基因分别连接至表达载体pBSA43,最后转化到枯草芽孢杆菌WB600中进行高效表达。结果显示,密码子优化前重组菌株的PG酶活力为1.83 U·mL^(-1),优化后重组菌株的PG酶活力为2.91 U·mL^(-1)。为进一步提高PG表达水平,经响应面分析优化后,确定最佳发酵条件:发酵时间为62.3 h,发酵温度为32.5℃,培养基初始pH为7.24。在该条件下,密码子优化后重组菌株PG酶活力为5.76 U·mL^(-1)。来源于解朊金黄杆菌的蛋白质谷氨酰胺酶基因经密码子优化后,表达水平明显提高,为蛋白质谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达提供参考。

蛋白质谷氨酰胺酶在乳清蛋白肽酶法制备中的应用

乳清蛋白是公认的人体优质蛋白质补充剂,却存在着一些过敏蛋白,为了降低乳清浓缩蛋白中的过敏原含量,开发β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)抗原性较低的乳清蛋白肽,该研究建立基于蛋白酶与蛋白质谷氨酰胺酶(protein glutaminase,PG)的乳清蛋白肽酶解工艺。通过蛋白酶筛选与复配确定最佳酶解组合——碱性蛋白酶+Prote AXH,建立PG辅助蛋白酶酶解工艺:5%乳清蛋白溶液在50℃下,加入1%PG充分孵育0.5 h后调整pH值为7.5,分步加入1%碱性蛋白酶和1%Prote AXH共反应2 h,最终得到的深度水解乳清蛋白粉水解度可达29.82%,分子质量<3000 Da的占比为88.48%,得率在93.5%,β-LG的降解率可达97.5%,必需氨基酸比例在46.16%。综上所述,PG的添加对提高乳清蛋白肽得率和过敏原降解率均有明显的效果,该研究可为低致敏乳清蛋白肽酶法制备提供一定的技术参考。

微生物转谷氨酰胺酶的蛋白质底物催化特性及其催化机理研究——(Ⅲ)MTGase催化多底物蛋白的聚合特性

采用SDS-PAGE研究并探讨了微生物转谷氨酰胺酶(Microbial Transglutaminase,MTGase)催化二种异源蛋白质的聚合情形,包括β-乳球蛋白(β-LG)/酪蛋白酸钠(SC)、牛血清白蛋白(BSA)/β-LG、BSA/SC、大豆球蛋白(glycinin)/β-LG、glycinin/SC以及glycinin/BSA。指出:①只有那些表面疏水性相仿的蛋白质才有可能聚合交联;②蛋白空间结构位阻也是不同蛋白交联的限制因素之一;③蛋白质的表面疏水性质或空间结构的改变,会影响MTGase的催化异源蛋白质交联的可能性。

微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)的蛋白质底物催化特性及其催化机理研究 (I)MTGase催化单底物蛋白质的聚合特性

采用SDS-PAGE结合凝胶成像技术比较了MTGase在还原状态下对酪蛋白酸钠(SC)、牛血清蛋白(BSA)、大豆球蛋白(glycinin)和β-伴豆球蛋白(β-conglycinin)、β-乳球蛋白(β-LG)和α-乳白蛋白(α-LA)等单底物蛋白的聚合效率。结果表明MTGase较易催化SC和BSA聚合,其次为大豆球蛋白,而β-伴豆球蛋白、β-LG和α-LA最不易。根据MTGase催化不同单底物蛋白质的聚合速率的差异,对MTGase催化单底物蛋白质的聚合特性进行了探讨,指出:①底物蛋白的分子结构对MTGase催化活性的重要性;②蛋白质表面疏水度对MTGase催化活性的重要性;③对蛋白质进行一定的预处理可增强MTGase对蛋白质(特别是球蛋白)的催化活性。

微生物源谷氨酰胺转胺酶修饰蛋白质机理及其在食品方面的应用进展

谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,EC2. 3. 2. 13,TGase)是一种能够催化蛋白质发生聚合反应的酶类,来源于动物、植物和微生物,该酶可以催化蛋白质发生交联、脱酰胺和糖基化反应,从而改变蛋白质的功能性质,提高食品的营养、风味和口感。其中微生物源谷氨酰胺转氨酶(microbial transglutaminase,MTGase)在食品中应用最广泛。该文主要介绍MTGase的酶学性质、活性结构以及上述3种反应的催化机理,并根据机理分类阐述了MTGase在食品工业近年的应用,以期对MTGase的深入研究和在食品工业化应用等方面提供理论依据。

微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)的蛋白质底物催化特性及其催化机理研究——(Ⅱ)MTGase催化球状蛋白质的聚合机理

首次提出微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)催化球状蛋白质的催化机理,同时显示MTGase聚合球蛋白存在一个“诱导期”,在该阶段底物蛋白的构象发生一定的变化,后者提高了MTGase对它们的催化活性。以β-乳球蛋白为例,采用紫外光谱(UVspectrum)和红外光谱(FT-IRspectrum)证实了MTGase催化球状蛋白,确实致使后者的空间结构发生了明显的变化。该论文所提出的MTGase催化球蛋白的聚合机理在一定程度上解释了MTGase改性蛋白质的机制,也为MTGase的进一步应用研究提供了理论指导。

酪氨酸酶、漆酶和谷氨酰胺转氨酶催化交联蛋白质的比较分析

蛋白质交联在食品加工、组织工程、酶工程和药物传递等领域具有广泛用途。以酪蛋白和牛血清白蛋白(BSA)为模式蛋白,考察酪氨酸酶、漆酶和谷氨酰胺转氨酶催化蛋白质交联的底物特异性及交联规律,揭示酶对底物蛋白质结构及反应条件的要求。采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析酶催化蛋白质交联规律,激光粒度分布仪测量交联产物粒径。结果表明:酪氨酸酶、漆酶和谷氨酰胺转氨酶对底物的特异性有共同特征,即均可以催化结构松散的蛋白质分子(酪蛋白)交联,但不能催化结构紧密的蛋白质分子(BSA)交联;还原剂二硫苏糖醇(DTT)的加入能促进酶催化BSA交联反应;DTT对酪氨酸酶和谷氨酰胺转氨酶催化酪蛋白交联无影响,但抑制漆酶对酪蛋白的交联。

蛋白质谷氨酰胺酶在毕赤酵母中的异源表达

蛋白质谷氨酰胺酶(protein glutaminase,PG)可水解蛋白质侧链的谷氨酰胺残基,生成氨和蛋白质-L-谷氨酸,从而增加负电荷、降低蛋白等电点,进而改善蛋白质的功能特性。但其生产菌株解朊金黄杆菌的产酶量较低,仅有0.258 U/mL,且基因操作效率低,故近年来多采用异源表达的方法,以提高其产量。该实验成功实现蛋白质谷氨酰胺酶酶原(Pro-PG)在毕赤酵母GS115中异源表达,还进行了培养基优化及重组酶学性质的研究。结果表明:重组毕赤酵母pPIC9K-Pro-PG/GS115在摇瓶水平经1%(体积分数)甲醇诱导120 h,表达出的Pro-PG经胰蛋白酶加工后,PG酶活力达到0.878 U/mL。酶学性质研究发现,重组的PG最适作用温度为60℃,在不超过60℃时孵育1 h其相对酶活力可保持在80%以上;该酶作用的最适pH为6.0,在pH 3.0~8.0条件下孵育1 h其相对酶活力可保持在70%以上。

微生物转谷氨酰胺酶催化聚合酪蛋白酸钠研究

研究了不同条件下微生物转谷氨酰胺酶 (MTGase)催化酪蛋白酸钠聚合。结果显示 ,MTGase较易催化α 以及β 酪蛋白 ,而不易催化κ 酪蛋白 ,随着酪蛋白量的不断下降 ,而形成的生物聚合物量不断增多。MTGase催化酪蛋白酸钠聚合的较佳条件如下 :酶量 /酪蛋白酸钠比例为 10～ 2 0U/g ,pH 6 0～ 8 0 ,最适催化温度为 37～ 5 0℃。

微生物转谷氨酰胺酶催化大豆11S球蛋白聚合研究

研究了微生物转谷氨酰胺酶(MtGase)催化大豆11S球蛋白的聚合反应条件。研究显示,TGase对11S的不同亚基反应不一样,它只能催化11S酸性亚基聚合,而碱性亚基几乎不受影响。离子强度Ⅰ=0.1时TGase催化活性要高于Ⅰ=0.5,这可能是酶活性受离子强度的影响。酶浓度范围为10～40U/g对TGase催化11S酸性亚基影响不大。TGase催化11S聚合的最适pH为7.0～8.0,pH过高或过低都不利于该酶反应。而在低于50℃范围内,温度越高TGase催化11S聚合越快达到平衡,37℃反应4h与50℃反应2h聚合效果差不多,而60℃已使TGase几乎完全失活。

微生物转谷氨酰胺酶催化乳清蛋白聚合研究

采用SDS-PAGE分析,研究了不同条件下微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)催化乳清蛋白(WPI)聚合。结果显示,MTGase可催化乳清蛋白的β-乳球蛋白(β-LG)和α-乳清蛋白(α-LA)聚合,形成低聚物或生物聚合物,其中β-LG更易受MTGase的催化。当TGase酶浓度一定时(0.5U/mL),TGase催化WPI聚合的最佳底物质量分数范围为2%～4%。对WPI进行加热预处理,同时添加还原剂,可明显提高MTGase对WPI的催化活性。MTGase催化WIP的最适pH值范围约为6.5～7.5。当WPI经预热处理(85℃,15min),同时添加20mmol/L的DTT,TGase催化WPI聚合12h,可使质量分数为92%的β-LG和质量分数为75%的α-LA聚合。

微生物谷氨酰胺转移酶对大豆分离蛋白凝胶性能的影响

研究了底物浓度、pH、酶浓度、温度、时间、离子浓度和二巯基苏糖醇(DTT)的添加对微生物谷氨酰胺转移酶(MTGase)诱导的大豆分离蛋白(SPI)凝胶强度的影响。结果表明,在SPI溶液中加入MTGase,可以使体系在低温下形成凝胶;SPI低于8%不能形成凝胶;pH7.0,酶量为30U/g蛋白,50℃水浴加热1h,NaCl为0.6N时,均可获得最高的凝胶强度;添加DTT,对体系无影响。

微生物谷氨酰胺转移酶对大豆分离蛋白凝胶性能的影响

研究了底物浓度pH、酶浓度、温度、时间、离子浓度和二巯基苏糖醇(DTT)的添加对微生物谷氨酰胺转移酶(MTGase)诱导的大豆分离蛋白(SPI)凝胶强度的影响。结果表明,在SPI溶液中加入MTGase,可以使体系在低温下形成凝胶;SPI低于8%不能形成凝胶;pH7.0,酶量为30U/g.pro,50℃水浴加热1h,NaCl为0.6N时,均可获得最高的凝胶强度;添加DTT,对体系无影响。

微生物转谷氨酰胺酶和大豆分离蛋白对罗非鱼鱼糜凝胶性能的影响(英文)

分析了添加微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)和大豆分离蛋白(SPI)对罗非鱼鱼糜凝胶性能的影响,通过测定鱼糜凝胶的强度、保水性及白度,发现随着SPI添加量的增加鱼糜凝胶的强度显著降低(p<0.05),但是当SPI和MTGase混合添加时显著提高了鱼糜糜凝胶的强度(p<0.05).单独添加MTGase也提高了鱼糜凝胶的强度.单独添加MTGase或MTGase和SPI混合添加都显著降低了鱼糜凝胶的保水性(p<0.05),而添加SPI显著降低了鱼糜凝胶的白度(p<0.05).电泳图显示MTGase引起的肌纤维蛋白与肌纤维蛋白、肌纤维蛋白与SPI之间的交联是导致鱼糜凝胶的强度提高的主要原因.

转谷氨酰胺酶对蛋白质凝胶性能的影响

本文研究了转谷氨酰胺酶浓度、反应温度、pH、时间对非肉蛋白质凝胶硬度的影响。结果表明转谷氨酰胺酶添加浓度在10～40U/g蛋白质,反应温度4～60℃,pH6～7,反应时间50～300min范围内,对于大豆分离蛋白、酪蛋白、乳清浓缩蛋白、卵清蛋白、明胶蛋白5种非肉蛋白质作用,均可以获得蛋白质凝胶能力以及凝胶性能的提高,表现在形成凝胶蛋白质极限浓度的降低以及凝胶硬度的提高。

谷氨酰胺转移酶对食物蛋白质成膜性能的影响

研究了添加谷氨酰胺转移酶(TGase)对大豆分离蛋白(SPI)、酪蛋白酸(NaCN)、明胶、乳清蛋白浓缩物(WPC)、小麦面筋蛋白(WG)及花生分离蛋白(PPI)6种蛋白质成膜特性的影响.研究结果表明:在成膜溶液中加入TGase,蛋白质膜的抗拉强度和表面疏水性有不同程度的改善,其中WG,SPI,NaCN和明胶这4种蛋白质膜的抗拉强度分别增加36.2%,17.7%,13.1%和25.6%(P≤0.05);NaCN,SPI,WPC,WG和明胶这5种蛋白质膜的表面疏水性分别增加216.1%,116.9%,30.5%,26.4%和2.4%(P≤0.05);同时膜的水分含量、总可溶性物质量及透光率也明显降低;明胶膜、NaCN膜和WPC膜的断裂伸长率分别增加16.3%,72.6%和172.3%,SPI膜和WG膜的断裂伸长率则分别降低7.5%和36.2%.电泳分析表明TGase使6种蛋白质均产生了共价交联.

蛋白质谷氨酰胺酶对米谷蛋白功能性质的影响

研究蛋白质谷氨酰胺酶对米谷蛋白功能性质的影响,测定米谷蛋白及其脱酰胺样品的溶解度、乳化、起泡、黏度、持水持油力等功能性质。结果表明,谷氨酰胺酶法脱酰胺的米谷蛋白其功能性质均有提高,在中性溶液中溶解度显著增加(达到96.99%);酶解时间1～12h的范围内,改性蛋白在中性条件下的乳化性能最好,酶解时间1～5h的范围内,强酸性条件下的乳化稳定性得到显著改善,并呈现出最佳的起泡性能,而起泡稳定性和黏度则随着反应时间的增加均逐渐降低;此外,改性蛋白与未改性蛋白比较,持水性提高1.75～2.03倍,持油性提高1.58～1.94倍。

微生物转谷氨酰胺酶的纯化方法和酶学性质研究

由Streptoverticilliummobaraense发酵生产的转谷氨酰胺酶经过除菌体、超滤浓缩、乙醇沉淀、干燥后得到粗酶产品 ,其活力回收率约 70 %。又经Superdex 75凝胶过滤和Source 30S阳离子交换两步纯化后得到纯酶 ,最终酶活力收率约 37%。酶最适温度为 5 0℃ ,在 4 0℃以下稳定性良好 ;最适 pH为 6 .0 ,pH4 .0～ 8.0时比较稳定。离子强度对酶影响很小。

谷氨酰胺转移酶对食品中蛋白质改性研究进展

谷氨酰胺转移酶是一类可以催化酰基转移反应的酶,能够促进蛋白质分子间发生交联反应,催化蛋白质之间异肽键的形成,并广泛应用于食品加工过程中蛋白质的改性。本文通过查阅近年来国内外研究进展,对谷氨酰胺转移酶的酶来源、酶学性质、酶的催化机理及其对食品蛋白质的改性、在食品中的应用进行了综述。