微生物转谷氨酰胺酶的蛋白质底物催化特性及其催化机理研究——(Ⅲ)MTGase催化多底物蛋白的聚合特性

采用SDS-PAGE研究并探讨了微生物转谷氨酰胺酶(Microbial Transglutaminase,MTGase)催化二种异源蛋白质的聚合情形,包括β-乳球蛋白(β-LG)/酪蛋白酸钠(SC)、牛血清白蛋白(BSA)/β-LG、BSA/SC、大豆球蛋白(glycinin)/β-LG、glycinin/SC以及glycinin/BSA。指出:①只有那些表面疏水性相仿的蛋白质才有可能聚合交联;②蛋白空间结构位阻也是不同蛋白交联的限制因素之一;③蛋白质的表面疏水性质或空间结构的改变,会影响MTGase的催化异源蛋白质交联的可能性。

微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)的蛋白质底物催化特性及其催化机理研究 (I)MTGase催化单底物蛋白质的聚合特性

采用SDS-PAGE结合凝胶成像技术比较了MTGase在还原状态下对酪蛋白酸钠(SC)、牛血清蛋白(BSA)、大豆球蛋白(glycinin)和β-伴豆球蛋白(β-conglycinin)、β-乳球蛋白(β-LG)和α-乳白蛋白(α-LA)等单底物蛋白的聚合效率。结果表明MTGase较易催化SC和BSA聚合,其次为大豆球蛋白,而β-伴豆球蛋白、β-LG和α-LA最不易。根据MTGase催化不同单底物蛋白质的聚合速率的差异,对MTGase催化单底物蛋白质的聚合特性进行了探讨,指出:①底物蛋白的分子结构对MTGase催化活性的重要性;②蛋白质表面疏水度对MTGase催化活性的重要性;③对蛋白质进行一定的预处理可增强MTGase对蛋白质(特别是球蛋白)的催化活性。

微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)的蛋白质底物催化特性及其催化机理研究——(Ⅱ)MTGase催化球状蛋白质的聚合机理

首次提出微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)催化球状蛋白质的催化机理,同时显示MTGase聚合球蛋白存在一个“诱导期”,在该阶段底物蛋白的构象发生一定的变化,后者提高了MTGase对它们的催化活性。以β-乳球蛋白为例,采用紫外光谱(UVspectrum)和红外光谱(FT-IRspectrum)证实了MTGase催化球状蛋白,确实致使后者的空间结构发生了明显的变化。该论文所提出的MTGase催化球蛋白的聚合机理在一定程度上解释了MTGase改性蛋白质的机制,也为MTGase的进一步应用研究提供了理论指导。

微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)的AOT反胶束纯化研究

研究微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)反胶束纯化的工艺和条件,调节MTGase离心上清液等电点,除去部分杂蛋白,MTGase活力升高7.5倍;用截留分子量为10000的超滤膜除去小分子杂蛋白,MTGase活力升高1.33倍;用0.05mol/L的AOT/异辛烷反胶束进一步纯化MTGase,其最适萃取条件是粗MTGase蛋白质浓度20mg/mL,[Na+]0.12mol/L,水相pH4.80～5.20,相比1:1(v/v);荷载MTGase的AOT反胶束用2.0mol/LKCl进行反萃取,MTGase活力为14.2U/g,纯化8.875倍;冷冻干燥脱盐反萃取液,获得MTGase冻干粉,其活力为110.3U/g,与粗酶液相比较,纯化689.4倍。经过AOT/异辛烷反胶束萃取纯化的MTGase,其SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳为一条带。Ca2+与表面活性剂非极性尾上丁二酰羰基氧、极性头磺酸基硫氧基氧及MTGase分子表面具有孤电子对的基团的配位结合放大了AOT反胶束的另一种萃取作用——配位萃取,致使其对MTGase的萃取率高于K+而接近Na+。

微生物源谷氨酰胺转胺酶修饰蛋白质机理及其在食品方面的应用进展

谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,EC2. 3. 2. 13,TGase)是一种能够催化蛋白质发生聚合反应的酶类,来源于动物、植物和微生物,该酶可以催化蛋白质发生交联、脱酰胺和糖基化反应,从而改变蛋白质的功能性质,提高食品的营养、风味和口感。其中微生物源谷氨酰胺转氨酶(microbial transglutaminase,MTGase)在食品中应用最广泛。该文主要介绍MTGase的酶学性质、活性结构以及上述3种反应的催化机理,并根据机理分类阐述了MTGase在食品工业近年的应用,以期对MTGase的深入研究和在食品工业化应用等方面提供理论依据。

微生物转谷氨酰胺酶催化大豆11S球蛋白聚合研究

研究了微生物转谷氨酰胺酶(MtGase)催化大豆11S球蛋白的聚合反应条件。研究显示,TGase对11S的不同亚基反应不一样,它只能催化11S酸性亚基聚合,而碱性亚基几乎不受影响。离子强度Ⅰ=0.1时TGase催化活性要高于Ⅰ=0.5,这可能是酶活性受离子强度的影响。酶浓度范围为10～40U/g对TGase催化11S酸性亚基影响不大。TGase催化11S聚合的最适pH为7.0～8.0,pH过高或过低都不利于该酶反应。而在低于50℃范围内,温度越高TGase催化11S聚合越快达到平衡,37℃反应4h与50℃反应2h聚合效果差不多,而60℃已使TGase几乎完全失活。

微生物转谷氨酰胺酶的纯化方法和酶学性质研究

由Streptoverticilliummobaraense发酵生产的转谷氨酰胺酶经过除菌体、超滤浓缩、乙醇沉淀、干燥后得到粗酶产品 ,其活力回收率约 70 %。又经Superdex 75凝胶过滤和Source 30S阳离子交换两步纯化后得到纯酶 ,最终酶活力收率约 37%。酶最适温度为 5 0℃ ,在 4 0℃以下稳定性良好 ;最适 pH为 6 .0 ,pH4 .0～ 8.0时比较稳定。离子强度对酶影响很小。

微生物转谷氨酰胺酶催化乳清蛋白聚合研究

采用SDS-PAGE分析,研究了不同条件下微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)催化乳清蛋白(WPI)聚合。结果显示,MTGase可催化乳清蛋白的β-乳球蛋白(β-LG)和α-乳清蛋白(α-LA)聚合,形成低聚物或生物聚合物,其中β-LG更易受MTGase的催化。当TGase酶浓度一定时(0.5U/mL),TGase催化WPI聚合的最佳底物质量分数范围为2%～4%。对WPI进行加热预处理,同时添加还原剂,可明显提高MTGase对WPI的催化活性。MTGase催化WIP的最适pH值范围约为6.5～7.5。当WPI经预热处理(85℃,15min),同时添加20mmol/L的DTT,TGase催化WPI聚合12h,可使质量分数为92%的β-LG和质量分数为75%的α-LA聚合。

微生物转谷氨酰胺酶诱导下鲢鱼糜凝胶的结构演化规律

以鲢鱼糜为对象,通过检测微生物转谷氨酰胺酶（microbial transglutaminase,MTGase）诱导下不同凝胶化时间形成的鱼糜凝胶的质地特性、交联程度及网络微观结构,探讨鲢鱼糜凝胶的结构演化规律。力学特性结果表明,未添加MTGase（对照组）的鱼糜凝胶的破断力、凹陷深度、硬度、咀嚼性等随凝胶化时间延长显著增大（P〈0.05）,破断力在3~6 h达到平衡（约1 100 g）,凹陷深度在1~2 h达到最大值（约17 mm）,随着凝胶时间延长呈下降趋势;添加MTGase的鱼糜凝胶破断力在3 h时就达到最大值（P〈0.05）,硬度和咀嚼性随时间增加到3 h后趋于平衡,凹陷深度随时间延长逐渐降低（P〈0.05）。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）结果显示,鲢鱼糜凝胶中肌球蛋白重链含量随凝胶化时间延长显著下降,添加MTGase组肌球蛋白重链含量明显低于对照组。两组鱼糜凝胶的网络孔隙当量直径均随凝胶化时间延长先减小后增大,在3 h时分别达到最致密的网络结构（P〈0.05）。对照组和添加MTGase的鲢鱼糜凝胶分别在40℃凝胶化3~6 h或2~4 h时凝胶特性较好,通过凝胶化时间的调节可控制鱼糜凝胶的结构演化方向,获得高品质鱼糜制品。

微生物转谷氨酰胺酶催化聚合酪蛋白酸钠研究

研究了不同条件下微生物转谷氨酰胺酶 (MTGase)催化酪蛋白酸钠聚合。结果显示 ,MTGase较易催化α 以及β 酪蛋白 ,而不易催化κ 酪蛋白 ,随着酪蛋白量的不断下降 ,而形成的生物聚合物量不断增多。MTGase催化酪蛋白酸钠聚合的较佳条件如下 :酶量 /酪蛋白酸钠比例为 10～ 2 0U/g ,pH 6 0～ 8 0 ,最适催化温度为 37～ 5 0℃。

微生物转谷氨酰胺酶的生产菌种诱变和发酵生产分析

对本研究室从土壤分离得到的链霉菌(Streptomyces sp.)WZFF.W-12菌株的斜面孢子预培养处于初萌发状态后,以亚硝基胍(NTG)进行诱变育种试验,并根据诱变处理后菌落的某些形态变化状况与产酶能力相结合的特征。初步判断产酶性能,挑选高酶活菌株,再经过初筛和复筛,获得一性能良好的产酶突变菌株WZFF.W-12.varMN-35,转谷氨酰酶活达0.53 U/mL,比原始菌株提高了1.2倍。然后在摇瓶条件下,对其发酵过程中的主要培养基组成及各种培养条件对菌体生长和产酶的影响作用进行了研究,结果表明该菌株发酵生产转谷氨酰酶的适宜碳源为可溶性淀粉+葡萄糖,氮源是多价胨外加少量的酵母膏,优化工艺条件为种龄时间24 h、接种量10％、初始pH值6.5、温度30℃和搅拌速度200 r/min,产酶能力显著提高,用小型生化反应器可以稳定生产2.0U/mL以上的酶产品。

微生物谷氨酰胺转胺酶高产菌株的诱变选育

以本实验室筛选的Streptomyces sp.WZFF.W-12(谷氨酰胺转胺酶活0.24U/ml)为出发菌株,孢子经预培养处理处于萌发状态后制备成单孢子悬浮液,用1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)单独和结合羟胺进行多次复合诱变处理。实验发现,诱变处理后菌落的形态变异等特征与产酶能力呈相关关系,并被用于最初的突变菌落挑选。接着先后采用蛋白质交联凝絮-沉淀性能分析的初筛试验和摇瓶测定酶活的复筛试验分离选育高产酶突变菌株,最后获得一产酶活力达2.18U/ml的高产菌株W-12var HZ3,酶活相对提高了8倍。对该菌株进行分类鉴定方面的理化性能测试和传代实验结果表明,该菌遗传性较为稳定,而且其理化性能与已报道的产酶菌种明显不同。

利用微生物转谷氨酰胺酶回收大豆乳清废水

以大豆乳清废水为研究对象,以蛋白质含量为指标,通过单因素试验和正交实验研究了以微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)对大豆乳清蛋白的聚合作用的条件,并对处理前后的大豆乳清废水中的蛋白质进行了分析。结果表明,微生物转谷氨酰胺酶对大豆乳清废水作用的最佳条件为:添加酶活为1 U/mL的酶6 mL、反应时间1 h、反应温度35℃、pH 7。MTGase对大分子组分的聚合作用表现的较为明显,而对小分子部分的作用极微弱。

微生物转谷氨酰胺酶在食品工业中的研究进展

介绍微生物转谷氨酰胺酶的特性、作用机理、在食品工业中的应用。并结合国内外的发展现状。

微生物谷氨酰胺转胺酶的研究进展

谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸-γ-谷氨酰胺转胺酶EC2.3.2.13,TG)能催化蛋白质分子内或分子间的酰基转移反应,通过形成交联键改善蛋白质的功能性质。其酶活测定方法采用比色法,荧光法、偶联法、放射标记法目前只用于动物TG酶的活性测定;MTG(微生物谷氨酰胺转胺酶)作为胞外酶,从其发酵液中分离纯化MTG主要是用离子交换、凝胶层析、高效液相色谱、超滤等方法;MTG可用于肉食品、大豆蛋白和小麦制品等的加工。

微生物转谷氨酰胺酶和大豆分离蛋白对罗非鱼鱼糜凝胶性能的影响(英文)

分析了添加微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)和大豆分离蛋白(SPI)对罗非鱼鱼糜凝胶性能的影响,通过测定鱼糜凝胶的强度、保水性及白度,发现随着SPI添加量的增加鱼糜凝胶的强度显著降低(p<0.05),但是当SPI和MTGase混合添加时显著提高了鱼糜糜凝胶的强度(p<0.05).单独添加MTGase也提高了鱼糜凝胶的强度.单独添加MTGase或MTGase和SPI混合添加都显著降低了鱼糜凝胶的保水性(p<0.05),而添加SPI显著降低了鱼糜凝胶的白度(p<0.05).电泳图显示MTGase引起的肌纤维蛋白与肌纤维蛋白、肌纤维蛋白与SPI之间的交联是导致鱼糜凝胶的强度提高的主要原因.

转谷氨酰胺酶的分子生物学与基因工程

来源于微生物特别是轮枝链霉菌的转谷氨酰胺酶是一种重要的酶制剂,在食品工业中有着广泛的应用前景。本文综述了近年来对转谷氨酰胺酶的分子生物学研究成果,以及对其进行基因工程改造的最新进展,讨论了其进一步的研究发展方向。笔者认为采用基因工程生产重组转谷氨酰胺酶是解决目前酶价高昂和来源困难问题的一个大有希望的办法。

茂原链轮丝菌转谷氨酰胺酶基因在大肠杆菌中高效表达

利用PCR方法从茂原链轮丝菌(Streptoverticilliummobaraense)基因组DNA扩增出微生物转谷氨酰胺酶(MicrobialTransglutaminase,MTG)的基因片段,并构建表达质粒pET_MTG。后者在大肠杆菌(RosettaDE3)中得到高效表达,但表达的MTG存在于包涵体中。经洗涤、变性和复性,并以强阳离子交换层析纯化,获得了SDS_PAGE纯的MTG,并具有与天然酶几乎相同的比活性。此项工作为工业化生产MTG打下了基础。

转谷氨酰胺酶对荞麦蛋白功能特性的影响

微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)能够使荞麦蛋白(BWP)的大部分球蛋白亚基被聚合,而几乎不能使分子量低于36kDa的碱性亚基聚合。BWP聚合物(催化时间<60min)的溶解度(PS)较BWP显著增加,聚合物的PS随反应时间的延长而降低;MTGase催化BWP反应120min可明显降低其PS(P<0.05)。聚合反应能提高BWP的持水能力(WH)和持油能力(FA),且BWP聚合物的FA随反应时间的增加而增强。适当的交联会使BWP的起泡性能增加,但继续提高交联度(延长酶反应时间),BWP的起泡性能反而降低。BWP聚合物的乳化活性指数(EAI)降低,乳化液稳定性(ES)却增强。