循环微生物DNA:一个新的肿瘤早筛生物标志物

目前在全球范围内,肿瘤的发病率和致死率依旧处于较高的水平,严重威胁人类健康。基于液体活检的肿瘤早筛技术能实现肿瘤的早诊断和早治疗,对肿瘤的预防具有重要意义。微生物在肿瘤的发生、发展中扮演着重要的角色,目前已有11种微生物被列为了1类致癌微生物。肿瘤内部存在瘤种特异性的微生物组,主要存在肿瘤细胞和免疫细胞中。肿瘤患者体内的循环微生物DNA(circulating microbial DNA,cmDNA)、主要来源于凋亡与坏死肿瘤组织细胞内微生物的被动释放,肿瘤组织细胞的主动分泌以及肠道菌群的转移等。cmDNA具有特异的生物学特征,具备成为肿瘤生物标志物的潜能。多项研究表明,通过检测cmDNA能进行多种肿瘤,例如乳腺癌、肺癌、结直肠癌、黑色素瘤等的早期筛查。本文简要介绍了人类肿瘤与微生物的关系、cmDNA的来源和生物学特征及cmDNA在肿瘤早筛中应用的研究进展。

一种适用于PCR的土壤微生物DNA的提取方法

[目的]对土壤微生物的DNA进行提取,以建立一种适用于PCR技术分析的土壤微生物DNA的快速提取方法。[方法]采用了2种不同的直接裂解法提取土壤微生物DNA,并用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增16S rDNA片段。[结果]2种方法提取的土壤微生物总DNA电泳结果显示没有差别,但是只有CTAB、溶菌酶、冻融裂解法提取的总DNA不需要纯化,在增加Mg2+用量的条件下,只需用第一轮非特异PCR产物作为模板即可扩增出16S rDNA片段。[结论]CTAB、溶菌酶、冻融裂解法提取土壤DNA,方法操作简单、快捷,同时适用于PCR分析,为土壤微生物群落结构的多样性分析奠定了基础。

土壤微生物DNA木聚糖酶基因多样性的研究

采用国产硅胶GF254(60型)代替进口Glass bead的改良方法抽提土壤微生物DNA,然后设计了一对扩增木聚糖酶基因片段的新简并引物,对抽提的土壤微生物DNA进行PCR扩增。扩增片段连接pMD18T载体,转化大肠杆菌,重组片段通过酶切进行RFLP分析后,测序分析得到10个木聚糖酶基因片段。对所得片段翻译的氨基酸序列进行BLAST分析表明有8个片段与来自放线菌的木聚糖酶具有较高的同源性,2个与假单胞菌的木聚糖酶具有较高的同源性。所得10个木聚糖酶片段的氨基酸序列同源性比较显示,第27个氨基酸均为天冬酰胺(N),暗示这些来自土壤微生物DNA的基因片段编码耐碱的木聚糖酶。通过构建系统进化树,发现扩增的木聚糖酶片段之间的相似性均在70%以上。

不同无土栽培基质微生物DNA提取方法研究

用4种DNA提取方法对3种栽培基质中微生物的DNA浓度、腐殖酸去除率、16S rDNA的PCR扩增、扩增片段限制性内切酶和变性梯度凝胶电泳结果进行比较。结果表明:采用含CaCO3的缓冲液预洗,用CTAB缓冲液和蛋白质酶K共同作用以裂解细胞,同时添加2%CaCl2可有效去除腐殖酸;用PEG 8000沉淀DNA和Sephadex G-200纯化,可提高DNA质量;所得DNA适用于PCR扩增及ARDRA技术的限制酶切分析;在DGGE分析中此方法更能显示微生物种群的多样性。

土壤微生物DNA提取方法研究进展

从土壤中提取微生物DNA的方法分两类——直接提取法和间接提取法,两类方法各有优势和缺陷,因而各有一定的适用范围。

人体内微生物游离DNA在病原微生物检测中的应用

病原体快速识别是感染性疾病临床诊断的关键环节。基于微生物游离DNA宏基因组测序是目前一种新兴的感染性疾病病原体检测技术,该技术相对无创、快速且可以同时识别多种病原体。本文对微生物游离DNA的特性及其在感染性疾病病原体识别中的应用进展进行了综述,以期为了解微生物游离DNA在临床诊断中的应用提供一些思路。

土壤微生物总DNA的V_3可变区PCR反应体系优化

为了优化以土壤微生物DNA为模板的PCR反应条件,采用E.Z.N.A.soil DNA kit试剂盒提取土壤微生物总DNA,对16SrDNA V3可变区的PCR反应体系和反应条件进行优化。主要从DNA模板用量、引物浓度、退火温度、热启动方式4个方面进行筛选试验,最后得出最适宜的土壤DNA扩增体系为:10.5ng模板DNA、5μL 10×buffer、4μL 2.5mmol/L dNTP、10μmol/L引物各1.5μL,2.5UTaq酶,加无菌ddH2O补足至50μL;PCR循环程序为:94℃预变性5min;94℃变性1min,52℃退火1min,72℃延伸70s,29个循环;72℃延伸5min。试验结果表明:选择热启动方式和合适的退火温度是获得高质量PCR产物的关键。

不同破壁方法提取绍兴黄酒麦曲中的微生物总DNA

分别采用超声波、Yatalase酶法、氯化苄法对黄酒麦曲样品进行破壁,提取微生物总DNA,并通过细胞裂解率、DNA的纯度、片段的分布情况、ITS(内转录间隔区)序列扩增产物的多态性来评估不同的破壁方法对麦曲样品总DNA提取效果的影响。实验结果表明,采用氯化苄法能裂解86%的孢子,OD260/OD280在1.5左右,所得DNA片段分布在100bp～20kbI,TS-PCR扩增出的条带最多,而且简单、经济、提取效果好,可以作为麦曲中微生物总DNA的提取方法。

天台山不同林型土壤微生物DNA总量的分布特性

研究了天台山8种植被类型土壤微生物DNA总量分布的特性及其与土壤微生物数量、土壤生化活性和土壤其它环境因素之间的关系。土壤的发育程度等对土壤微生物DNA总量分布影响较大。此外,土壤微生物数量、微生物生物量C和土壤呼吸速率对土壤微生物DNA总量分布的直接作用和它门之间的相互作用产生的间接影响较显著。在所测的8种土壤理化因素中,土壤微生物DNA总量分布对土壤pH、有机质、全氮、全磷、全钾影响较大。

紫色水稻土水稳性团聚体土壤微生物基因组DNA提取方法探讨

为了找到提取土壤微生物总DNA的最佳方法,通过OD值检验、凝胶电泳、PCR和DGGE分析,比较了Reddy法、基于DNAout kit试剂盒改进的实验方法、以及Kuske修订法、Edgcomb改进法、SDS高盐提取法、Eichner调整法等常用的不同土壤微生物基因组的DNA提取方法在亚热带地区长期免耕紫色水稻土水稳性团聚体0.25-2.0 mm粒径上的提取效果。结果表明,6种方法都可以从团聚体中提取到长度大于23.1 kb的DNA片段,但不同方法提取的DNA的产量存在明显差异,土壤总DNA均不需纯化就可以用于PCR扩增,使用细菌16S rDNA基因V3区的通用引物可扩增得到相应的片段。研究表明,改进的DNAout kit试剂盒法是长期免耕紫色水稻土水稳性团聚体中微生物基因组DNA的最佳提取方法。

微波场对微生物DNA的作用研究

目的研究微波场对微生物DNA的作用,了解微波杀菌机理。方法用免疫电泳法和基因扩增法对经微波照射处理悬液内指标菌DNA进行检测,观察其损伤情况,并与普通煮沸加热法作平行比较。结果经微波加热沸腾和非沸腾状态处理的微生物,总DNA条带出现弥散或缺失。微波场铜网屏蔽和煮沸加热处理的微生物,总DNA条带无缺失现象。微波场照射处理枯草芽孢杆菌黑色变种和大肠杆菌,在温度升至72℃时,非连续处理后DNA条带无损伤现象;在温度上升到85℃时,非连续处理后DNA条带明显减弱。结论微波场对微生物DNA有损伤作用,温度升高或作用时间延长微波对微生物DNA的破坏作用增加,提示微波场对微生物的作用存在非热效应,也存在热效应。

冰川表层雪样中微生物总DNA几种提取方法的比较研究

通过对4种具有不同裂解方式的微生物总DNA提取方法的比较,筛选出较佳的方法进行滤膜处理、DNA抽提及沉淀的优化,再将优化出的传统DNA提取方法与商业化试剂盒提取方法比较.结果表明:商业化试剂盒提取总DNA的方法适用于冰川表层雪微生物总DNA的提取;其次,将滤膜剪碎,用溶菌酶(5mg.mL-1)+蛋白酶K(1mg.mL-1)+CTAB(1%)+SDS(1%)的裂解方式,氯仿:异戊醇(24∶1)抽提一次,乙醇沉淀DNA的提取方法是一种效果较佳且廉价的冰川表层雪微生物总DNA提取方法.

晋西北酸粥发酵过程中微生物基因组DNA提取方法的比较

为了找到一种简单高效的晋西北酸粥发酵过程中微生物基因组DNA提取方法,本文采取对提取的微生物基因组DNA进行浓度测定的方法,比较了溶菌酶-SDS-蛋白酶K法、改良CTAB法和改良CTAB-溶菌酶法三种方法的提取效果。结果表明:溶菌酶-SDS-蛋白酶K法效果最好,可以获得质量较高的微生物基因组DNA,DNA浓度为1657.53 ng/μL;改良CTAB-溶菌酶法比溶菌酶-SDS-蛋白酶K法效果差,DNA浓度为1308.08 ng/μL;改良CTAB法对微生物基因组DNA的提取效果比溶菌酶-SDS-蛋白酶K法更差,DNA浓度为1098.36 ng/μL。以提取到的微生物基因组总DNA为模板,进行16S r DNA基因的PCR扩增,在回收产物中目的条带清晰,表明提取到的微生物基因组DNA含量高、结构完整。整体实验结果表明,溶菌酶-SDS-蛋白酶K法对于提取晋西北酸粥发酵过程中微生物基因组DNA效果最好。

玻璃珠法提取堆肥微生物总DNA及其DGGE分析

采用玻璃珠法从高温堆肥样品中进行了微生物总DNA的提取,以细菌16S rRNA基因V3区通用引物进行了PCR扩增,随后用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对其微生物多样性进行评估.结果表明,玻璃珠法能够快速、有效地获得高质量的堆肥微生物总DNA,所得的DNA分子片段在15kb以上,使用细菌16S rRNA基因通用引物(27F和1492R)对总DNA进行PCR扩增,获得了近全长的16S rDNA序列(约1.5kb);DGGE分析结果表明,用该方法提取到的DNA种类较为丰富,多样性较好,能够进一步应用于群落结构分析.因此,玻璃珠法提取的DNA可以用于堆肥微生物的分子生态学研究及微生物群落结构分析.

盐土中微生物总DNA的提取方法的探究

文章初步探讨了用不同DNA提取方法,对盐土中微生物总DNA的提取效果.实验结果表明,由于盐土中微生物数量较少,溶菌酶-SDS-冻融裂解法、溶菌酶-SDS-蛋白酶K-冻融裂解法均无法提取到盐土中微生物的总DNA;变性剂-SDS-高盐法和试剂盒提取法能获得DNA,但效果不佳;只有用变性剂-SDS-高盐修改法能快速、有效地提取盐土中微生物的基因组DNA.

油页岩微生物总DNA的提取方法

为建立油页岩微生物总DNA提取方法，以两矿区的6个样品为材料，采用SDS高盐、SDS液氮研磨、SDS反复冻融、SDS异硫氰酸胍和试剂盒提取法分别对总DNA进行提取．结果表明，各方法提取效果差异很大，改进的SDS高盐提取法效果最好，各样品均得到约23kb较完整片段，且产率显著高于其他方法，达91．44～386．85ng·g^-1干样；以未纯化的DNA为模板，对16SrDNA进行PCR—DGGE，得到了相应的扩增产物及DGGE指纹图谱，说明该法适合油页岩样品．SDS液氮研磨和SDS反复冻融提取法仅能得到部分样品总DNA，且产率和纯度较低，而SDS异硫氰酸胍和试剂盒提取法无DNA提出，不适合此类样品．

核酸杂交技术在微生物生态学上的应用

由于自然界中大部分的微生物种类到目前为止仍不可培养 ,传统基于培养和纯种分离的技术在研究微生物生态时面临很大障碍。分子生物学的进展为诸多长期困扰微生物学研究的问题提供了解决办法。核酸杂交技术已被证实在微生物系统分类和微生物生态等领域的研究具有巨大潜力并已被广泛应用。综述核酸杂交技术的基本原理、实际应用及其主要优点和局限性 ,以及提高其检测灵敏度和特异性的方法 ,并对该技术的应用前景作了探讨。

酸面团中微生物基因组DNA提取方法的优化

为有效提高酸面团中微生物基因组DNA的提取纯度与浓度,采用改良的CTAB法、STES法以及两种不同的基因组DNA提取试剂盒对酸面团中微生物基因组DNA进行了提取,并且重点优化了酸面团样品的前处理方法,经分光光度法和电泳法检测,确定了采用不同方法所获得DNA产物的浓度与纯度。结果表明:离心沉淀法、洗去面筋法和烘干法3种前处理方法中,离心沉淀法更有利于酸面团中微生物基因组DNA的提取;CTAB法和STES法所提取的基因组DNA纯度较低(D(260)/D(280)>1.9),片段略小,存在RNA污染情况,作为模板扩增基因组中的16S rRNA基因时产物中的杂带较多;快速DNA提取检测试剂盒法所提取的DNA纯度低(D(260)/D(280)<1.7),蛋白质及酚类物质含量较高,作为模板进行16S rRNA基因的PCR扩增时并未获得目的条带,故不适合酸面团中微生物基因组DNA的提取;通用基因组DNA提取试剂盒法所提取的基因组DNA完整性较好,纯度较高,5 g酸面团样品中所提取的基因组DNA浓度达到80.10 ng/μg,D(260)/D(280)为1.80,且进行PCR扩增时产物的杂带较少、亮度较高,是较为适合酸面团中微生物基因组DNA的提取方法。

血浆微生物游离DNA宏基因组下一代测序在感染性疾病中的研究进展

宏基因组下一代测序(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)技术被广泛地应用于各种感染性疾病。血浆微生物游离DNA(microbial cell-free DNA,mcfDNA)近年来备受关注,其无创性和易获得性有助于识别人体内大部分来源的感染。了解血浆mcfDNA mNGS在感染性疾病诊断中的临床性能,不仅可加深对高通量测序的理解,还可为预防和治疗常见及罕见感染提供新的诊断途径。该文介绍了感染性疾病中血浆mcfDNA的生物学特点,血浆mcfDNA mNGS在感染性疾病诊治中的实践应用以及面临的挑战。血浆mcfDNA mNGS作为一项新兴技术,有望提升感染性疾病预测、临床诊断和预后判断能力,特别是在传统诊断方法有局限性的领域。

一种高纯度提取草地土壤微生物DNA方法的建立

本文研究建立一套高效、简便的草地土壤微生物DNA的提取和纯化方法。提取的微生物总DNA片段大小在23 kb左右,纯化后的DNA产量为(7.76±1.53)μg·g-1,OD260/OD280为1.78±0.04,OD260/OD230为1.76±0.02。