微管蛋白酪氨酸连接酶样-1在小鼠脊髓中表达差异的研究

目的:探讨微管蛋白酪氨酸连接酶样-1(Ttll1)在脊髓发育中的作用。方法:选用孕18天胎鼠及出生后1天、5天、10天、20天、40天的A/J(A)和C57BL/6J(B6)小鼠,以实时荧光定量PCR方法测定各发育阶段Ttll1在脊髓中的表达。结果:2种品系小鼠不同发育阶段Ttll1的表达有明显差异,A/J小鼠在出生后1天表达最强,C57BL/6J小鼠在胚胎18天表达最强且峰值显著高于A/J的峰值。提示Ttll1的表达与脊髓的发育及与两种小鼠脊髓发育的差异有关。结论:Ttll1基因与脊髓发育相关,其机制可能是通过表达强度调节脊髓的发育。

微管蛋白酪氨酸连接酶类似物12通过干扰微管蛋白酪氨酸硝基化促进Hep-2细胞生长

硝基化酪氨酸与酪氨酸在结构上相似,它在病理情况下会出现,并在细胞内与微管蛋白结合,从而阻碍微管的正常功能.硝基化酪氨酸在肿瘤中的作用,目前研究甚少.本文利用头颈鳞癌Hep-2细胞株,研究微管蛋白酪氨酸连接酶类似物12(tubulin tyrosine ligase like 12,TTLL12)和硝基化酪氨酸对头颈鳞癌Hep-2生长的影响,通过Western印迹试验和MTT试验发现,随着硝基化酪氨酸的浓度升高,细胞内生成的硝基化酪氨酸微管蛋白含量也增高,同时细胞生长受抑制的程度显著增高;对建立的TTLL12高表达细胞株加入硝基化酪氨酸培养,结果显示,TTLL12高表达细胞株内的硝基化酪氨酸微管蛋白含量明显低于对照组细胞;对照组细胞的生长明显受到抑制,而高表达细胞株的生长无明显改变,两者的细胞生长有显著性差异(P<0.05).本研究结果提示,TTLL12可通过阻碍硝基化酪氨酸与微管蛋白的结合,使头颈鳞癌Hep-2细胞逃避硝基化酪氨酸的打击.对这一调控机制的进一步研究,必将有助于控制肿瘤细胞的生长,为治疗肿瘤寻找到新的治疗靶点.

微管蛋白酪氨酸连接酶类似物12和硝基化酪氨酸对前列腺癌细胞生长的影响

目的研究微管蛋白酪氨酸连接酶类似物12(TTLL12)和硝基化酪氨酸对前列腺癌细胞生长的影响。方法利用正常前列腺上皮细胞株PWR1E、RWPE1和前列腺癌细胞株DU145,通过蛋白质印迹分析检测TTLL12和硝基化酪氨酸微管蛋白的表达量,用MTT实验检测细胞的增殖情况。结果在硝基化酪氨酸的作用下,DU145细胞的硝基化酪氨酸微管蛋白表达量低于PWR1E和RWPE1细胞(P<0.05)。和对照组(以含800μmol/L盐酸培养)相比,实验组(以含800μmol/L硝基化酪氨酸的培养液培养)PWR1E和RWPE1细胞增殖受到抑制(P<0.05),而DU145细胞无明显改变(P>0.05)。在有效沉默TTLL12后,实验组(用siTTLL-12转染)的硝基化酪氨酸微管蛋白表达量高于对照组(用siControl转染,P<0.05);实验组内,硝基化酪氨酸使DU145细胞增殖受到抑制(P<0.05),而对照组内,硝基化酪氨酸对细胞增殖改变较小(P>0.05)。结论 TTLL12可使前列腺癌细胞逃避硝基化酪氨酸的打击,从而使前列腺癌细胞逃脱机体监控作用,获得异常增殖机会。

细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂诱导HL-60细胞凋亡及分子机制研究

目的：探讨细胞周期蛋白依赖激酶（ CDK ）抑制剂SNS-032诱导人急性髓系白血病HL-60细胞凋亡的效应及可能的机制。方法：以CDK抑制剂SNS-032作用于HL-60细胞株，实验细胞分为对照组、SNS-032组、白细胞介素（ IL）-6组和SNS-032＋IL-6组。 MTT法检测细胞存活率，流式细胞术检测细胞凋亡， microRNA芯片技术分析细胞microRNA的表达谱差异，蛋白质印迹法检测JAK／STAT3相关信号通路蛋白的表达。结果：SNS-032可降低细胞存活率，诱导HL-60细胞凋亡，对照组、100 nmol／L 和200 nmol／L 的 SNS-032干预组细胞凋亡率分别为（5.9±1.7）％、（12.1±3.1）％和（59.4±3.6）％。 microRNA 芯片分析结果显示， SNS-032显著下调HL-60细胞miR-30a、miR-183、miR-20b、miR-26b、miR-20a、miR-589、miR-107、miR-181 a、miR-106 a、miR-17和miR-378 c的表达水平，显著上调miR-320 a的表达水平。蛋白质印迹法显示 SNS-032可抑制 STAT3的磷酸化和 JAK2、MCL-1、C-MYC蛋白的表达。作为JAK／STAT3通路的激活剂， IL-6联合SNS-032不能逆转后者对HL-60细胞的杀伤作用（ P＞0.05），也不能逆转SNS-032对JAK2蛋白表达和磷酸化STAT3的抑制作用。结论：SNS-032能显著诱导人急性髓系白血病HL-60细胞发生凋亡，其机制可能与抑制JAK2和STAT3磷酸化、抑制MCL-1和C-MYC及与之相关的miR-17-92基因簇表达水平有关。

马氏珠母贝TTLL基因的序列特征、SNP筛选及其与生长性状的关联分析

为了探究微管蛋白酪氨酸连接酶样(tubulin tyrosine ligase-like, TTLL)在马氏珠母贝Pinctada fucata martensii中的作用,对TTLL基因的序列特征、表达模式及其SNP位点进行了相关分析。结果表明:采用RACE技术克隆获得马氏珠母贝TTLL基因cDNA全长为1 962 bp,其中,开放阅读框(ORF)为1 611 bp,编码536个氨基酸,5′UTR长134 bp, 3′UTR长191 bp;TTLL蛋白靠近N端处具有一个TTL结构域;多序列比对及系统进化树分析显示,马氏珠母贝与其他物种的TTLL氨基酸序列具有较高的同源性,并与长牡蛎Crassostrea gigas等双壳贝类聚为一支;qRT-PCR分析显示,TTLL基因在马氏珠母贝外套膜、闭壳肌、性腺、肝胰腺、鳃和足中均有表达,在性腺中表达量最高(P<0.05),在生长性状较好的大规格群体和杂交家系中高表达(P<0.05),在卵和受精卵中的表达量也显著高于其他发育时期(P<0.05);马氏珠母贝TTLL基因共有277个SNP位点,其中,109个SNP位点符合哈迪-温伯格平衡,6个位点为中度多态,103个位点为低度多态;对基因外显子SNPs单倍型分析发现,4个SNP位点形成了2个单倍块、5种单倍型,单倍型GG为优异单倍型,其生长性状显著高于单倍型AA;对基因突变位点分析发现,7个SNP位点发生了突变,包括4个错义突变和3个同义突变,其中,位点g.7572350 T>G和g.7572368 A>G与壳宽显著性关联(P<0.05),位点g.7572405 C>T与壳长、壳高显著性关联(P<0.05),而其他突变位点对生长性状无显著性关联(P>0.05)。研究表明,TTLL基因参与马氏珠母贝的生长发育过程,且其优异单倍型GG及突变位点g.7572350 T>G、g.7572368 A>G和g.7572405 C>T均有利于马氏珠母贝的生长。

TTLL12在鼻咽癌中的表达及临床意义

目的探讨鼻咽癌患者中微管蛋白酪氨酸连接酶类似物12(tubulin tyrosine ligase like 12,TTLL12)的表达及临床意义。方法利用免疫组织化学法研究TTLL12在鼻咽慢性炎症组织和鼻咽癌组织中的表达,分析其在不同鼻咽组织中的表达差异及与鼻咽癌患者临床特征之间的相关性。从GEO数据库中筛选合适的鼻咽癌基因芯片数据集GSE102349,分析不同临床分期中TTLL12基因在转录水平上的表达差异、TTLL12与鼻咽癌患者无进展生存的相关性及可能参与的通路。结果免疫组织化学结果显示,与鼻咽慢性炎症组织相比,TTLL12蛋白在鼻咽癌组织中表达明显上调(P<0.001)。TTLL12高表达鼻咽癌患者的T_(3)-T_(4)、N_(2)-N_(3)、Ⅲ~Ⅳ期的占比显著高于TTLL12低表达患者(P<0.05)。TTLL12高表达患者的总生存显著低于低表达患者(P=0.027)。TTLL12高表达和N分期均是影响鼻咽癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。在基因芯片数据集中,TTLL12 mRNA在鼻咽癌组织中的表达与临床分期呈正相关(P=0.033),TTLL12高表达的鼻咽癌患者无进展生存率显著低于TTLL12低表达患者(P=0.041)。KEGG富集分析显示TTLL12高表达基因样本主要富集在趋化因子信号通路,与人类T细胞白血病病毒1型感染及EB病毒感染密切相关。结论TTLL12表达上调作为不利因素可促进鼻咽癌的发生发展。

七氟醚致幼鼠认知功能障碍与Tau/TTLL6/Spastin信号通路的相关机制

目的探讨多次暴露于吸入性麻醉药七氟醚后, 七氟醚是否通过Tau/类微管蛋白酪氨酸样连接酶6(TTLL6)/微管切割蛋白(Spastin)信号通路引起幼鼠神经元树突棘重塑。方法选取幼年[出生6 d(P6)]及成年[出生60 d(P60)]小鼠44只, 采用随机数字表法将小鼠分为4组(每组11只):幼年对照组(P6con组)、幼年麻醉组(P6sevo组)、成年对照组(P60con组)、成年麻醉组(P60sevo组)。P6sevo组和P60sevo组给予3%七氟醚+60%氧气3 d, 每天2 h;P6con组和P60con组给予60%氧气3 d, 每天2 h。造模结束后当天取小鼠海马组织采用免疫印迹法(Western blot)检测突触后致密蛋白95(PSD95)、Tau、TTLL6、Spastin水平, 免疫荧光检测Tau、TTLL6、Spastin表达及Tau、TTLL6共定位情况。结果与P6con组比较, P6sevo组海马PSD95水平较低(P<0.05), Spastin水平较高(P<0.05), Tau、TTLL6水平差异无统计学意义(均P>0.05);P60con组与P60sevo组海马组织PSD95、Tau、TTLL6、Spastin水平比较, 差异无统计学意义(均P>0.05)。免疫荧光染色结果显示, P6con组和P6sevo组小鼠海马组织Tau和TTLL6存在共定位, P60con组和P60sevo组小鼠海马组织Tau和TTLL6共定位不明显;与P6con组比较, 多次七氟醚处理可使P6sevo组海马中Tau、TTLL6及Spastin阳性细胞明显增加(均P<0.05), 而在成年小鼠中变化不明显(P>0.05)。结论七氟醚通过Tau/TTLL6/Spastin信号通路引起幼鼠神经元树突棘重塑。

TTLL12在肝门部胆管癌中的表达及临床意义

目的分析肝门部胆管癌及癌旁组织中微管蛋白酪氨酸连接酶类似物12(TTLL12)的表达,并探讨其与肝门部胆管癌患者临床病理特征和预后之间的关系。方法收集青岛市市立医院2016年1月至2020年12月45例肝门部胆管癌患者术后癌组织及癌旁组织制备石蜡切片,其中男性27例,女性18例,年龄(58.8±8.5)岁。采用免疫组化染色检测TTLL12和增殖细胞核抗原(Ki-67)的表达,45例患者依据癌组织TTLL12表达情况分为阴性组(n=15)和阳性组(n=30)。分析TTLL12阳性表达与淋巴结转移、肿瘤分化程度等临床病理特征的关系。采用Spearman相关分析癌组织中TTLL12与Ki-67表达的相关性。Kaplan-Meier法进行生存分析,生存率比较采用log-rank检验。结果免疫组化染色显示,45例肝门部胆管癌患者癌组织中,TTLL12与Ki-67表达明显高于癌旁组织。肝门部胆管癌患者癌组织中的TTLL12与Ki-67表达呈正相关(相关系数为0.601,P<0.001)。TTLL12、Ki-67在45例肝门部胆管癌组织中的阳性表达率分别为66.7%(30/45)、77.8%(35/45),高于癌旁组织中阳性率11.1%(5/45)、15.6%(7/45),差异具有统计学意义(χ^(2)=11.25、29.01,均P<0.001)。肝门部胆管癌患者癌组织中TTLL12、Ki-67阳性表达与淋巴结转移、肿瘤分化程度相关(均P<0.05),存在淋巴结转移和分化程度低的患者癌组织阳性表达率高。TTLL12癌组织表达阴性组中位总生存期为44个月,TTLL12阳性组中位总生存期为21个月。TTLL12癌组织表达阴性组术后5年累积生存率为33.1%,优于阳性组的18.3%,差异有统计学意义(χ^(2)=6.12,P=0.013)。结论肝门部胆管癌组织中TTLL12的表达高于癌旁组织,并且癌组织中TTLL12与Ki-67表达呈正相关。TTLL12阳性表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移和患者不良预后密切相关。TTLL12可能成为肝门部胆管癌患者预后预测的标志物。

miR-208a促进非小细胞肺癌A549细胞增殖、侵袭和迁移的功能和机制研究

目的探讨miR-208a对非小细胞肺癌A549细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其机制。方法(1)分别用miR-208a mimic、NC mimic、miR-208a inhibitor和NC inhibitor转染A549细胞。采用荧光定量PCR(qPCR)检测A549细胞中miR-208a过表达和干扰效率;采用CCK-8实验、Transwell实验和划痕实验检测miR-208a对A549细胞增殖、侵袭和迁移的影响。利用生物信息学网站PicTar、miRanda、Targetscan和miRDB预测与miR-208a结合的下游靶基因;构建蛋白酪氨酸磷酸酶受体G(PTPRG)的3′UTR野生型和突变型双荧光素报告酶基因载体,和miR-208a共转染到HEK-293T细胞后观察荧光素酶活性变化。(2)取对数生长期的A549细胞,设置阴性对照组(si-NC组)、PTPRG敲低组(si-PTPRG组)和PTPRG敲低组+miR-208a干扰组(si-PTPRG+miR-208a inhibitor组),采用CCK-8、Transwell实验和划痕实验检测PTPRG对A549增殖、侵袭和迁移的影响,qPCR和Western blot检测3组细胞PTPRG的mRNA和蛋白表达变化。结果(1)miR-208a mimic组miR-208a基因表达水平、细胞增殖、细胞侵袭和细胞迁移率均高于NC mimic组(P<0.05);miR-208a inhibitor组的miR-208a基因表达水平、细胞增殖、细胞侵袭和细胞迁移率均低于NC inhibitor组(P<0.05)。生物信息学分析显示PTPRG是miR-208a的靶基因,双荧光素报告酶实验结果显示miR-208a过表达能够降低PTPRG 3′UTR野生型的荧光素酶活性,而敲低miR-208a能够增加PTPRG 3′UTR野生型的荧光素酶活性,miR-208a能够与PTPRG的3′UTR序列结合。(2)与si-NC组相比,si-PTPRG组细胞增殖、细胞侵袭和细胞迁移能力明显增高,PTPRG基因和蛋白表达水平下降(P<0.05);而与si-PTPRG组相比,si-PTPRG+miR-208a inhibitor组细胞增殖、细胞侵袭和细胞迁移能力下降,PTPRG基因和蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论miR-208a可能通过靶向调控PTPRG来促进A549细胞的增殖、侵袭和迁移。

TTLL12过表达对口腔鳞癌SCC-25细胞株生物学特性的影响

目的检测微管蛋白酪氨酸连接酶类似物12(TTLL12)过表达对人舌磷癌SCC-25细胞株生物学特性的影响。方法建立TTLL12稳定过表达的SCC-25细胞株,采用间接免疫荧光法和Western blot检测TTLL12在SCC-25细胞内的分布,MTT检测沉默TTLL12对SCC-25细胞生长的影响,Boyden小室侵袭试验检测沉默TTLL12对SCC-25细胞侵袭的影响,采用SPSS10.0软件包对数据进行统计学分析。结果间接免疫荧光法和Western blot结果均显示TTLL12在细胞质、细胞核及细胞核膜均有分布。间接免疫荧光法结果显示α微管蛋白(α-tubulin)的分布与TTLL12重合。MTT实验结果显示沉默组(沉默TTLL12基因的SCC-25细胞)的SCC-25细胞生长较对照组(未作任何处理的SCC-25细胞)受到明显抑制(P<0.05)。Boyden小室侵袭实验结果显示沉默组的穿膜细胞百分比明显小于对照组(P<0.05)。结论沉默TTLL12可有效抑制SCC-25细胞的生长和侵袭能力。