刚地弓形虫GJS株微线体蛋白3基因真核表达质粒的构建及在BHK-21细胞中的表达

采用PCR技术从刚地弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因,并克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定。将重组质粒转染BHK-21细胞。间接免疫荧光染色证明,质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达。Western-blot分析证实,细胞裂解液及上清样品中有1条约39.2 ku的条带,可被山羊抗刚地弓形虫超免疫血清所识别,大小与预测值相符。表明,真核表达质粒pcDNA3-MIC3中的MIC3基因在BHK-21细胞中获得表达且表达产物具有抗原性。

刚地弓形虫GJS株微线体蛋白基因MIC3的克隆与原核表达

根据Genbank中编码MIC3的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术对刚地弓形虫GJS株微线体蛋白基因MIC3进行克隆、表达及鉴定.结果表明:克隆的MIC3基因的开放阅读框与Genbank收录的MIC3基因在核菌酸和氨基酸水平上高度一致,说明弓形虫MIC3蛋白的高度保守性;构建的原核细胞表达质粒PET-MIC3表达产物分子量为46 ku,且经Western-blot显示可被猪抗弓形虫免疫血清识别.

刚地弓形虫RH株微线体蛋白MIC3成熟肽的克隆与表达

目的 克隆编码刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)RH株微线体蛋白MIC3成熟肽的基因,构建原核表达载体pET MMIC3,并在大肠杆菌BL2 1株中表达。方法 采用PCR技术从刚地弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码微线体蛋白MIC3成熟肽的基因,并克隆到T载体上,经测序鉴定后,将目的基因亚克隆到表达载体pET30a(+)上,构建质粒pET MMIC3。表达产物用Westernblot进行进一步确认。结果 经初步菌液PCR鉴定,提取质粒双酶切鉴定并测序,确认插入T载体的序列为所需的目的序列;亚克隆构建pET -MMIC3,转化到宿主菌大肠杆菌BL2 1,得到分子量为37.2kDa的重组表达蛋白,Westernblot的结果与预测相符。结论 成功的克隆并融合表达了刚地弓形虫RH株微线体蛋白MIC3成熟肽,为进一步研究其在弓形虫粘附和入侵中的作用奠定了基础。

弓形虫微线体蛋白研究新进展

微线体蛋白(microneme protein,MIC)是由位于弓形虫前端的微线体(microneme)分泌产生的,具有识别、黏附与侵染宿主细胞的性质。近年来研究结果证明,弓形虫的多种微线体蛋白在侵染宿主的过程中发挥重要作用,并且可以作为抗弓形虫病的疫苗候选分子。作者对目前研究较多的弓形虫微线体蛋白进行综述,为弓形虫疫苗的研究提供理论依据。

刚地弓形虫微线体蛋白6和醛缩酶在虫体内的定位

目的观察刚地弓形虫微线体蛋白6(MIC6)和醛缩酶在虫体内的定位。方法聚合酶链反应扩增微线体蛋白2羧基端(MIC2C)基因片段,构建MIC2C/pGEX-4T-1/BL21表达系统,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达谷胱苷肽巯基转移酶-MIC2C(GST-MIC2C)蛋白,用该蛋白免疫新西兰兔,制备GST-MIC2C多克隆抗体。刚地弓形虫速殖子涂片,分别用一抗、荧光二抗温育,荧光显微镜下观察。结果成功获得GST-MIC2C多克隆抗体。荧光显微镜下显示MIC6(红色荧光)和醛缩酶(绿色荧光)2种蛋白皆定位于弓形虫的顶端。结论刚地弓形虫MIC6与醛缩酶在虫体内存在共定位关系,为2种蛋白相互作用关系的确立提供了细胞定位学证据。

定点突变技术鉴定弓形虫微线体蛋白6与醛缩酶的作用位点

目的利用定点突变技术鉴定弓形虫微线体蛋白6(MIC6)与醛缩酶的作用位点。方法根据GenBank中的弓形虫RH株MIC6基因序列(登录号为AF110270)及C端序列设计特异性引物,将MIC6蛋白羧基端(MIC6C)348位色氨酸(W348)的密码子碱基突变为缬氨酸(V)的碱基,PCR扩增MIC6C W/V突变体基因片段,克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1,转化至大肠埃希菌BL21(DE3);0.8 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-MIC6C W/V突变体蛋白,亲和层析法纯化表达产物。以GST-MIC6C W/V突变体蛋白为探针蛋白,GST-MIC6C蛋白为对照蛋白,分别与弓形虫速殖子裂解液进行GST沉降实验,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析实验产物。分别以GST-MIC6C W/V突变体蛋白和GST-MIC6C蛋白为探针蛋白和对照蛋白,与弓形虫醛缩酶蛋白液进行GST沉降实验,SDS-PAGE分析实验产物。结果获得了MIC6C W/V突变体基因片段,构建了相应的原核表达载体,表达并纯化了GST-MIC6C W/V突变体蛋白。GST-MIC6C W/V突变体蛋白与弓形虫速殖子裂解液的GST沉降产物中未见蛋白条带,而GST-MIC6C蛋白的沉降产物中可见一蛋白条带,且能被抗醛缩酶抗体特异识别;GST-MIC6C W/V突变体蛋白与弓形虫醛缩酶蛋白液的GST沉降产物中未见蛋白条带,而GST-MIC6C蛋白的沉降产物中可见一蛋白条带。结论色氨酸(W348)为MIC6与醛缩酶的作用位点。

弓形虫微线体蛋白的研究进展

弓形虫入侵宿主细胞是多步骤的过程。首先是虫体识别、黏附宿主细胞,然后虫体穿透入细胞完成入侵过程。当虫体与细胞接触时,微线体蛋白释放到虫体外,一部分微线体蛋白具有与真核细胞黏附分子相似的结构域———黏附区域,通过不同的黏附区域,微线体蛋白发挥其识别、黏附宿主细胞的作用;另一部分微线体蛋白不含黏附区域,但在虫体不同阶段表达量存在差异,可作为诊断抗原来鉴定急性和隐性弓形虫病。该文对已发现的微线体蛋白的基因序列、蛋白结构及特性作一综述。

弓形虫微线体蛋白1部分基因原核表达重组质粒pWR450-1-MIC1的构建、鉴定及测序

目的 构建弓形虫ZS2分离株pWR45 0 - 1 -MIC1原核表达重组质粒 ,为进一步表达及免疫做准备。方法 用PCGENE软件分析MIC1基因可能的TB抗原表位 ,自行设计引物 ,用聚合酶链反应(PCR)技术从弓形虫ZS2分离株的基因组DNA中扩增编码微线体蛋白 1 (MIC1 )的基因片段 ,经酶切、连接、重组入pWR45 0 - 1原核表达载体 ,再经含氨苄培养基筛选、酶切、PCR鉴定和测序。结果 从ZS2分离株基因组DNA中扩增出特异的MIC1基因片段 ,克隆成功pWR45 0 - 1 -MIC1重组质粒。测序表明MIC1这部分基因与RH株相应碱基序列完全一致 ,高度保守。为下一步表达及免疫奠定基础。

不同来源柔嫩艾美耳球虫虫株微线体3基因的克隆和序列分析

以8株不同来源柔嫩艾美耳球虫分离株为研究对象,对其艾美耳球虫微线体3(Eimeria tenella microneme protein,EtMIC3)基因进行了RT-PCR扩增、测序及序列分析,并与GenBank上已发表的柔嫩艾美尔球虫相关序列进行比较,研究Et-MIC3基因遗传变异情况。结果获得2976bp的目的片段,各株与FJ374765.1CDs的序列相似性在99.8%～99.9%之间,各株之间的序列相似性为99.9%～100.0%,各株编码的氨基酸序列与GenBank登记的柔嫩艾美耳球虫EtMIC3蛋白(ACJ11219)相似性在99.6%～99.9%之间,不同地理来源或耐药性虫株之间没有明显差异。本研究首次对中国EtMIC3基因进行了序列分析,结果显示不同来源株EtMIC3基因高度保守,为有效的疫苗候选因子,为进一步进行柔嫩艾美耳球虫基因工程疫苗构建的研究奠定了基础。

弓形虫微线体蛋白MIC3的研究进展

弓形虫（Toxoplasma gondii）的微线体（mi-croneme）散布于虫体前端棒状体周围,是一种具有分泌功能的细胞器,其分泌的微线体蛋白（mi-croneme proteins MICs）与虫体对宿主细胞的识别和结合密切相关,在虫体入侵宿主细胞早期发挥重要作用。

刚地弓形虫微线体蛋白3的研究进展

微线体蛋白3(MIC3)是刚地弓形虫生活史各个时期均能表达的分泌蛋白,具有较强的免疫反应性,在弓形虫对宿主细胞的识别、黏附及入侵过程中发挥重要作用。深入研究弓形虫MIC3有助于研制弓形虫病诊断制剂及疫苗以防制弓形虫病。文章综述了近年来关于MIC3的分子生物学特征、相关疫苗及其用于弓形虫病诊断方面的研究进展。

弓形虫微线体分泌蛋白TgMIC10基因的克隆和序列分析

目的从弓形虫RH株cDNA中扩增出微线体分泌蛋白TgMIC10编码基因并进行克隆,为利用其表达的重组蛋白建立一种灵敏检测弓形虫感染的实验方法作准备。方法提取弓形虫速殖子总RNA,设计并合成引物,RT-PCR扩增TgMIC10编码基因,通过与线性克隆载体pGEM-T连接,经进行酶切和PCR鉴定及DNA测序证实。结果PCR法扩增出了一个大小约597bp左右的DNA片断,将重组质粒pGEM-T-TgMIC10作EcoRI和XbaI双酶切,均能得到一个大小与PCR扩增产物一致的插入片断,对插入片断的测序结果表明,TgMIC10具有一个长度为597bp的完整开放阅读框(ORF),编码198个氨基酸,理论分子量23kDa,与GenBank收录(编号为AF293654)的弓形虫Tg-MIC10基因具有高度的同源性(99.5%)。结论本实验成功地克隆了TgMIC10编码基因,为进一步研究提供了条件。

弓形虫微线体分泌蛋白TgMIC10基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆、表达及鉴定弓形虫(RH株)微线体分泌蛋白TgMIC10编码基因,为建立一种灵敏检测弓形虫感染的实验方法作准备。方法提取弓形虫速殖子总RNA,设计并合成引物,RT-PCR扩增TgMIC10编码基因,与克隆载体pGEM-T连接,经酶切和PCR鉴定及DNA测序证实后,亚克隆入表达载体pBK-CMV,IPTG诱导表达pBK-TgMIC10阳性重组子转化宿主菌E.coliBL21,Western blot鉴定。结果PCR法扩增出了一597bp左右的DNA片断,将重组质粒pGEM-TgMIC10、pBK-TgMIC10分别作EcoRI和XbaI双酶切,均能得到一个大小与PCR扩增产物一致的插入片断,表明Tg-MIC10基因的克隆和亚克隆均获成功,用IPTG诱导带有重组质粒pBK-TgMIC10的大肠杆菌,产物行SDS-PAGE,可得到一约21kDa融合蛋白,Western-blot法鉴定该蛋白能被弓形虫感染的兔血清所识别。

弓形虫微线体蛋白6,7,8与宿主Spata3,Dkk2蛋白相互作用的研究

为了研究弓形虫微线体蛋白6(MIC6)、7(MIC7)及8(MIC8)是否与宿主精子生成相关蛋白3(Spata3)和Dickkopf相关蛋白2(Dkk2)互作,首先从弓形虫RH虫株cDNA中扩增了弓形虫MIC6、MIC7及MIC8基因,并从小鼠cDNA中扩增了Spata3和Dkk2基因。然后分别构建pGADT7-MIC6、pGADT7-MIC7和pGADT7-MIC8捕获载体及pGBKT7-Spata3和pGBKT-Dkk2诱饵载体。利用Clon Tech公司的MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid系统,将诱饵载体分别转化Y2HGold酵母菌,将捕获载体分别转化Y187酵母菌,最后通过酵母点对点验证分析弓形虫MIC6、MIC7和MIC8蛋白是否与宿主Spata3和Dkk2蛋白互作。结果表明:在酵母双杂交系统里MIC7和MIC8蛋白分别能够与宿主Spata3和Dkk2蛋白互作,而MIC6不能够与宿主Spata3和Dkk2蛋白互作。

基于IFA技术检测微线体蛋白2在艾美耳属球虫的空间分布

微线体蛋白2（Microneme protein2，Mic2）是艾美耳球虫入侵宿主细胞时分泌的主要功能蛋白之一。本研究中，以抗柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2（EtMic2）单克隆抗体为检测抗体，利用间接免疫荧光实验（IFA）检测了Mic2在柔嫩艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、斯氏艾美耳球虫和无残艾美耳球虫等不同种艾美耳属球虫的空间分布。结果显示，Mic2在不同种艾美耳属球虫中均定位于子孢子的顶部（微线体部位），但表达强度存在差异。这提示Mic2可作为研究艾美耳属球虫相关蛋白空间分布的“参照物”。

弓形虫微线体分泌的蛋白酶解抗原—TgMIC5的分子鉴定

微线体是弓形虫顶复体(apical complex)的组成部分之一。研究表明,微线体释放的微线体蛋白对虫体运动和入侵宿主细胞起到了必不可少的作用。已鉴定的微线体蛋白共有4种,分别是TgMIC1,2,3,4,而这4种微线体蛋白均具有与粘附功能相一致的结构特点。

弓形虫微线体蛋白1部分基因的克隆、测序及表达

目的 构建弓形虫ZS2株pWR450 1 微线体蛋白 1 (MIC1 )原核表达重组质粒 ,对MIC1基因进行序列测定 ,并在不同大肠杆菌中表达。方法 用PCR技术从弓形虫ZS2株的基因组DNA中扩增编码MIC1的基因片段 ,酶切 ,连接 ,重组入pWR450 1表达载体 ,再经含氨苄培养基筛选、酶切、PCR鉴定 ,进行序列测序后转化大肠杆菌TG 1、JM1 0 9(DE3)和DH5α。在不同菌体浓度及不同剂量异丙基 β D 硫代半乳糖诱导下 ,用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定MIC1融合蛋白的表达。 结果 从ZS2株基因组DNA中扩增出特异的MIC1基因片段 ,克隆后获得pWR450 1 /MIC1重组质粒 ,测序结果表明 ,MIC1这部分基因与弓形虫RH株相应基因序列完全一致 ,高度保守。该基因可在不同大肠杆菌中表达相对分子质量约 70 0 0 0的融合蛋白。结论 构建了弓形虫ZS2株pWR450 1 MIC1重组质粒 。

刚地弓形虫微线体蛋白2在不同原核表达菌中的表达与鉴定

目的利用大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)、Arctic Express(DE3)和Shuffle等3种不同的原核表达菌表达刚地弓形虫微线体蛋白2(Toxoplasma gondii microneme protein 2,TgMIC2),并进行蛋白质印迹(Western blotting)鉴定。方法参照Gen Bank中TgMIC2基因序列设计引物,以刚地弓形虫RH株速殖子RNA为模板,RT-PCR扩增获得DNA片段,PCR产物经NdeⅠ和HindⅢ双酶切后连至原核表达载体pET-30a(+),重组质粒转化入E.coli TOP10,双酶切筛选阳性质粒,将测序正确的阳性质粒pET30a-MIC2分别转化至E.coli BL21(DE3)、Arctic Express(DE3)和Shuffle表达菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达并优化各菌株的表达条件,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表达产物。重组蛋白经镍柱纯化后,以抗组氨酸(His)单抗为一抗,Western blotting分析其免疫反应性。结果 TgMIC2基因的扩增产物长约2 000 bp。SDSPAGE结果显示,TgMIC2的相对分子质量(M_r)为80 000,在不同表达菌中的表达形式及表达量存在差异:TgMIC2在BL21(DE3)和Arctic Express(DE3)中均存在可溶性表达和包涵体表达,且在不同诱导条件下(15℃、16 h和37℃、4 h)可溶性蛋白均约占10%,表达量无明显差异;而TgMIC2在Shuffle中仅以包涵体形式表达。Western blotting分析结果显示,纯化后的可溶性TgMIC2和包涵体表达的TgMIC2重组蛋白都能被抗His的单抗识别。结论构建了pET30a-MIC2重组表达质粒,在3种不同的原核表达菌中成功表达TgMIC2重组蛋白。

载体介导的艾美耳球虫微线体蛋白疫苗的研制现状

艾美耳球虫是鸡球虫病的病原体,疫苗研发是当前的热点领域之一。微线体蛋白免疫原性良好,本研究就卡介苗(rBCG-AMA1/RB)、乳酸乳球菌(rLL-AMA1)、植物乳杆菌(rLp-EtMIC1/EtMIC2/TA4-AMA1)、鼠伤寒沙门氏菌(rSt-5401/EnMIC2/MIC5)、根癌农杆菌(rAt-MIC2)、酵母(rPP-EtMIC2)和鸡痘病毒(rFPV-RB)等载体介导的艾美耳球虫微线体蛋白疫苗的研究进展进行综述。