弓形虫微线体蛋白1部分基因原核表达重组质粒pWR450-1-MIC1的构建、鉴定及测序

目的 构建弓形虫ZS2分离株pWR45 0 - 1 -MIC1原核表达重组质粒 ,为进一步表达及免疫做准备。方法 用PCGENE软件分析MIC1基因可能的TB抗原表位 ,自行设计引物 ,用聚合酶链反应(PCR)技术从弓形虫ZS2分离株的基因组DNA中扩增编码微线体蛋白 1 (MIC1 )的基因片段 ,经酶切、连接、重组入pWR45 0 - 1原核表达载体 ,再经含氨苄培养基筛选、酶切、PCR鉴定和测序。结果 从ZS2分离株基因组DNA中扩增出特异的MIC1基因片段 ,克隆成功pWR45 0 - 1 -MIC1重组质粒。测序表明MIC1这部分基因与RH株相应碱基序列完全一致 ,高度保守。为下一步表达及免疫奠定基础。

弓形虫微线体蛋白1部分基因的克隆、测序及表达

目的 构建弓形虫ZS2株pWR450 1 微线体蛋白 1 (MIC1 )原核表达重组质粒 ,对MIC1基因进行序列测定 ,并在不同大肠杆菌中表达。方法 用PCR技术从弓形虫ZS2株的基因组DNA中扩增编码MIC1的基因片段 ,酶切 ,连接 ,重组入pWR450 1表达载体 ,再经含氨苄培养基筛选、酶切、PCR鉴定 ,进行序列测序后转化大肠杆菌TG 1、JM1 0 9(DE3)和DH5α。在不同菌体浓度及不同剂量异丙基 β D 硫代半乳糖诱导下 ,用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定MIC1融合蛋白的表达。 结果 从ZS2株基因组DNA中扩增出特异的MIC1基因片段 ,克隆后获得pWR450 1 /MIC1重组质粒 ,测序结果表明 ,MIC1这部分基因与弓形虫RH株相应基因序列完全一致 ,高度保守。该基因可在不同大肠杆菌中表达相对分子质量约 70 0 0 0的融合蛋白。结论 构建了弓形虫ZS2株pWR450 1 MIC1重组质粒 。

柔嫩艾美耳球虫MIC1与MIC2相互作用的鉴定

目的观察柔嫩艾美耳球虫基因微线蛋白1(EtMIC1)和微线蛋白2(EtMIC2)之间的相互作用,为研究微线蛋白之间相互影响的分子机制以及该互作在鸡球虫入侵宿主细胞过程中的作用提供参考依据。方法采用PCR方法克隆柔嫩艾美耳球虫EtMIC1和EtMIC2基因,构建不同的重组表达载体。将构建的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-EtMIC1及捕获质粒pGADT7-EtMIC2转化至Y2HGold酵母感受态,涂布于对应的营养缺陷培养基进行毒性和自激活活性检测。表达GST-EtMIC1和His-EtMIC2两种融合蛋白,纯化后通过GST-Pull down验证二者在体外的相互作用。将构建的pcDNA3.1-His-EtMIC1和pcDNA3.1-HA-EtMIC2重组质粒转染HEK-293T细胞,RIPA裂解后取上清进行免疫共沉淀试验,鉴定二者在体内的相互作用。将真核表达载体pEtMIC1-Myc-LC151和pEtMIC2-HA-KN151共转染HEK-293T细胞,激光共聚焦显微镜观察转染后的细胞内发出的红色荧光。结果pGBKT7-EtMIC1和pGADT7-EtMIC2单转化对酵母细胞无明显毒性作用,且自身无自激活活性,而pGBKT7-EtMIC1/pGADT7-EtMIC2共转化后能够在显色板上长出蓝色菌落,说明二者在细胞内可相互作用;GST-Pull down试验表明二者可在体外发生相互作用;免疫共沉淀和双分子荧光互补试验证实EtMIC1和EtMIC2在细胞内相互作用。结论EtMIC1和EtMIC2在体内、外均能够产生相互作用,为进一步探索微线蛋白之间相互影响的分子机制以及该互作在鸡球虫入侵宿主细胞过程中的作用提供参考依据。