微绿球藻(Nannochloropsis oculata)培养基的优化

【目的】微绿球藻(Nannochloropsis oculata)是一种优良的单细胞饵料微藻,广泛应用于水产养殖。优化微绿球藻培养基,以期提高其生长速率,降低生产成本。【方法】以宁波大学3#配方为基础微藻培养液,以乙酸钠为碳源,硝酸钾、尿素和氯化铵为氮源,磷酸二氢钾和磷酸二氢钠为磷源,硫酸亚铁和柠檬酸铁为铁源,通过单因子和正交试验,研究了碳、氮、磷、铁、维生素B_1(VB_1)和B_(12)(VB_(12))等主要营养元素对微绿球藻生长、繁殖的影响。【结果】获得了以天然海水为基础的微绿球藻优化培养基:3 g/L CHCOONa、20 mg/L NH_4CL-N、2 mg/L KH_2PO_4-P、3 mg/L FeSO_4-Fe、0.05 mg/L VB_1和 0.005mg/L VB_(12);采用优化培养基与宁波大学3#培养基对比培养微绿球藻,结果表明,培养 2～6 d,优化培养基收获微绿球藻的生物量( 细胞密度)比宁波大学 3#培养基的分别提高了2.21、2.55、2.30、1.97、1.7倍;培养6 d,优化培养基中微绿球藻收获的生物量(细胞密度)达到1.74×10~7个/mL,是宁波大学3#培养基的1.7倍。【结论】优化培养基极显著地提高了微绿球藻的生物量,是微绿球藻的良好培养基。

光周期对微绿球藻生长和物质生产的影响

为研究光周期对微绿球藻(Nannochloris oculata)生长及物质生产的影响,该文设置了4种长时光周期(光∶暗(h∶h)=24∶0、16∶8、12∶12或8∶16),5种频率光周期(按照光∶暗=16∶8,24 h内分别设置1、4、9、16或25次光暗交替)。结果发现,长时光周期对微绿球藻的生物量干重无显著性影响,而频率光周期对生物量干重影响显著。2种光周期对于微绿球藻的叶绿素a含量有极显著影响,生长速度最快的处理组叶绿素a含量最低。2类光周期对微绿球藻脂质生产均有显著影响,24∶0及16∶8处理组获得较高的脂肪产量,24 h内光暗交替9次处理比交替1次的脂肪产量提高了55.65%。微绿球藻的蛋白质生产受光周期影响不大,但多糖生产受光周期影响显著。微绿球藻的脂肪酸中含量最丰富的是C18∶3(n-3)、C16∶0和C18∶2(n-9),频率光周期对其脂肪酸组成和生物柴油性能影响不显著。

CO_2对微拟球藻(Nannochloropsis sp.)利用有机碳和光合作用的影响

CO2浓度提高时,微拟球藻吸收醋酸钠的速率增加2倍。混养生长的藻细胞最大光合作用速率、光合作用效率、无机碳半饱和常数和无机碳饱和的光合作用速率均显著低于光自养条件下生长的。

海洋富油微拟球藻Nannochloropsis gaditana CCAP849/5的转化及外源基因整合方式

微拟球藻Nannochloropsis被认为是具有作为生物柴油原料开发潜力的微藻。为了能够实现工业化生产,有效地利用基因工程或遗传操作手段改造微藻,提高产量,建立稳定有效的遗传转移方法十分必要。本研究以微拟球藻本源β-tublin基因启动子和三角褐指藻Phaeodactylum tricornutm fcpA终止子驱动和终止来源于细菌的sh ble抗性选择基因,构建了一个转化载体pHB4857。将pHB4857以电转移的方法转化海洋富油微拟球藻Nannochloropsis gaditana CCAP849/5。结果显示,转化子可以在3μg·mL-1 zeocin的抗性培养基中生长,PCR检测sh ble基因为100%插入率,转化效率为1.25×10-6。DNA印迹杂交结果表明,外源基因是以随机整合的方式一个或多个拷贝插入到宿主核基因组中的,大多数转化子中的外源基因的整合是完整的。转化子在抗性培养基中每10天传一代,连续传代7个月以上,未检测到抗性基因丢失现象,外源抗性基因可以在宿主细胞中稳定存在。

温度和光径对微绿球藻生长及营养成分含量的影响

研究了温度和光生物反应器的光径对微绿球藻(Nannochloropsis oculata Hibberd)生长及细胞内几种营养成分含量的影响。结果表明,温度对微绿球藻的生长有显著影响(P<0.05),对几种营养成分的含量有极显著影响(P<0.01),在28℃的培养条件下,细胞生长速度最快,此时蛋白质含量最高,为5.66%,多糖含量最低,仅为1.47%,但最大生物产量却是在30℃的条件下获得,总脂与叶绿素a的含量随温度的升高而降低,类胡萝卜素含量随温度升高而增大。光生物反应器的光径对微绿球藻的生长和总脂、可溶性蛋白、色素的含量有极显著影响(P<0.01),对多糖含量有显著影响(P<0.05),比生长速率、最高细胞密度和单位体积产量均随光径的增大而减小,单位面积产量随光径的增大而增大;总脂、可溶性蛋白和多糖的含量随光径的增大而降低,叶绿素和类胡萝卜素含量随光径增大而增大,类胡萝卜素含量的增大趋势比叶绿素更明显。

微绿球藻对氮和磷营养盐需求的研究

通过单因子实验和正交实验方法 ,研究了对虾高位池一种优良藻株微绿球藻(Nannochlorisoculata)对N和P营养盐需求。结果表明 :微绿球藻在NO3 N浓度为28.30mg/L和PO4 P浓度为2.076mg/L时 ,比增长率最大值(μ max)出现最佳值 ,微绿球藻以各种起始密度培养和小规模培养均能得到较好的生长效果。

微绿球藻、隐藻、颤藻的种间竞争关系

采用陈海水配制的无机培养液,添加营养盐的无机培养液和对虾养殖池水3种培养液,分别对微绿球藻(Nannochloropsis oculata)、隐藻(Cryptomonas erosa)和颤藻(Oscillatoria sp.)进行单培养和混合培养,探讨3种微藻的增殖规律和相互关系。观测各处理组微藻的生长状况,并以Lotka-Volterra的双种竞争模型为基础,计算3种微藻在生长拐点后各取样点的竞争抑制参数。结果显示,在各处理组中,实验前期微绿球藻和隐藻对颤藻的生长都具有一定的促进作用,颤藻在混合培养组中的生物量大于单培养组,而微绿球藻和隐藻的最大生物量均出现在其单培养组。在各组生长拐点后,微绿球藻对颤藻的影响较小,隐藻对颤藻的抑制作用明显,各取样点隐藻对颤藻的竞争参数远大于微绿球藻对颤藻的竞争参数(P<0.05);颤藻对微绿球藻有较小的抑制作用,而对隐藻的抑制作用明显,各取样点颤藻对隐藻的竞争参数均为各组的最大值。实验结果表明,3种微藻按竞争力从大到小依次为颤藻,隐藻,微绿球藻。颤藻对隐藻和微绿球藻有较强的抑制作用,而微绿球藻和隐藻之间的竞争抑制作用较弱,能够达到"共存"状态。

微绿球藻固定化培养及其对对虾养殖水质调控

用褐藻酸钙作固定化载体,初步探讨了胶球直径、不同接种量、CaCl2溶液浓度、褐藻酸钠浓度等固定化条件对微绿球藻(Nannochloris oculata)生长及其对养殖水质的影响。结果表明,微绿球藻固定化培养的最好条件是胶球的直径为2.5mm、微藻接种量为1×106 Cell/mL, CaCl2溶液的质量分数为3%,褐藻酸钠溶液质量分数为2%。在此条件下制备的固定化藻珠, 微绿球藻生长率较高,生长周期较长。实验期间固定化微绿球藻的生物量增加了约17倍,证明了它的生理活性不会因固定化而受干扰。引入固定化的微绿球藻不但可以降低养殖水体中氨氮、亚硝酸氮等有害因子的浓度,还能提高水中溶解氧含量,使水体环境长时间处于良好的动态平衡状态。

不同生长阶段微绿球藻的营养价值

微绿球藻(Nannochloropsis oculata)是一种重要的海产经济微藻,易培养,是海产苗种生产中广泛应用的一种饵料微藻.在澳大利亚及以色列等国家,微绿球藻被规模化培养来用于生产高纯度的EPA[1].

微绿球藻DNA质粒文库的构建

微绿球藻（Nannochloropsis oculata）DNA被提取纯化并经超声波处理后，将所得大小在1．6～3kb之间的DNA片段用T4DNA聚合酶补平，再与Sma I酶切消化并经去磷酸化处理的质粒栽体pUCl8连接。转化至DH10B大肠杆菌（Escherichiacoli）的感受态细胞中。建立的DNA质粒文库容量含2×10^4个克隆，其中重组子占90％。随机挑选白色菌落并培养，抽提的质粒经XbaI和SacI双酶切鉴定，显示重组的质粒中均含有大小不等的DNA插入片段。

五种微绿球藻产油和产多不饱和脂肪酸的研究

从5种微绿球藻中鉴别出4个高产油藻种和1个产油量很低的藻种。4种高产油微绿球藻在平台期油脂含量最高,占细胞干重的57%以上,其中三酰基甘油的含量占细胞干重的32.4%—45.2%。分析5种微绿球藻细胞的脂肪酸组成及4种高产油藻三酰基甘油中的脂肪酸组成,发现在高产油藻中,总的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的比例达到95%以上,多不饱和脂肪酸在5%以下,而在产油量很低的微绿球藻中多不饱和脂肪酸比例达45%以上。高产油微绿球藻三酰基甘油的多不饱和脂肪酸含量在4%以下,是生物柴油的优质原料,而产油量低的微绿球藻可用于提取C20:5脂肪酸(EPA)。

眼点拟微绿球藻与扁藻在不同接种比例下的竞争

通过对眼点拟微绿球藻和扁藻进行共培养试验,结果表明,在共培养条件下,眼点拟微绿球藻和扁藻的生长速度均受到抑制,即两种藻的最大生长密度均比对照(分别单独培养)有显著降低,而且眼点拟微绿球藻降低的程度要大于扁藻。经计算两种藻的种间竞争系数可知,扁藻的种间竞争能力明显强于眼点拟微绿球藻。

氮对微绿球藻生长的影响

实验研究了氮源及其质量浓度对微绿球藻生长的影响 ,结果表明 ,作为虾、蟹、贝类幼体及海水仔鱼的生物饵料 ,微绿球藻在以尿素或硝酸钠作氮源 ,氮质量浓度在 2 4.6 4× 10 - 6 时 。

眼点拟微绿球藻在黑暗胁迫下的超补偿生长响应

采用LRH-GII型光照培养箱培养试验藻种,设置了持续黑暗胁迫(分6个强度处理)和间断黑暗胁迫(分4个模式处理)两项试验,研究了眼点拟微绿球藻(Nannochloropsisoculata)在不同环境胁迫下的生理生态变化和该藻种在黑暗胁迫下的超补偿生长响应情况.两个试验的结果均显示,眼点拟微绿球藻在持续黑暗胁迫和间断胁迫后,均表现出明显的超补偿作用现象.黑暗对眼点拟微绿球藻的生长造成显著抑制,但是适当进行黑暗胁迫以后恢复生长,微藻具有更强的生长繁殖能力,细胞净增率最大可达123%.经SSR测验,不同的胁迫方式、胁迫持续时间和胁迫模式与超补偿现象发生时间及强度密切相关.

微绿球藻油脂提取方法的优化

为了提高微藻油脂的提取率,以微绿球藻藻粉为原料,比较了不同提取剂、破壁方法、提取时间以及提取温度等因素对微藻油脂提取率的影响。单因素实验结果表明:所用提取剂中工业酒精的提取率最高;破壁方法中反复冻融破壁提取率最高,超声波次之;提取率随着提取时间的延长而增大,当提取时间大于2 h后,提取率无明显差异;提取率随着提取温度的升高而增大,当提取温度大于55℃后,提取率增大的幅度减小。正交实验优化的微藻油脂提取最佳工艺条件为:以工业酒精为提取剂,反复冻融法破壁,在65℃水浴中提取2 h,可获得较高的提取率,提取率为34.62%。

光、氮和半连续培养更新率对微绿球藻生长与采收量的影响

对水产养殖中的主要饵料微绿球藻(Nannochloropsisoculata(Droop)Hibberd)进行了5×3×2析因试验,培养液NO-3-N水平分别设置为0、3、6、12、24mg/L,光照强度分别为22.9μmol/(m2·s)、43.2μmol/(m2·s)、80.4μmol/(m2·s),更新率分别为10%和25%,研究了光、氮和半连续培养更新率对微绿球藻生长、采收量的影响。协方差分析结果显示,NO-3-N水平、光照强度、更新率及其交互作用对细胞密度、生长率和采收量的影响均存在显著差异(P<0.001),以更新率影响最大,其次是光照强度,影响最弱为NO-3-N水平。更新率25%时,平均细胞密度(753.2×104/mL)显著低于10%更新率下的细胞密度(1737.5×104/mL),但平均生长率和采收量都显著高于更新率10%时的生长率和采收量,分别为0.349/d和4.69×108/d。在光照强度22.9μmol/(m2·s)下,细胞密度、生长率和采收量都显著低于其他组,其最大值均在80.4μmol/(m2·s)光照强度组,该组细胞密度、生长率和采收量分别为1721.1×104/mL、0.283/d和6.51/×108/d。在不同NO-3-N水平处理下,不添加NO-3-N时的细胞密度、生长率和采收量都最低,3mg/L时次之,6mg/L以上组(包括6mg/L组)最高。研究结果还表明,更新率增加时,不仅光衰减变小,生长率随之变大,而且培养液中NO-3-N浓度也随之增加,从而促进?

pH对眼点拟微绿球藻的生长、总脂含量及脂肪酸组成的影响

pH对眼点拟微绿球藻(Nannocholoropsisoculata)的生长、总脂含量及脂肪酸组成有明显影响。研究表明 ,眼点拟微绿球藻的生长对pH有较强的适应性 ,在pH6.2～9.8的范围内均能较好的生长 ,但在 pH5.5的条件下生长受到较强的抑制。在不同 pH条件下 ,在同一细胞周期内总脂含量及脂肪酸组成均有相同的变化规律 ,即总脂含量在对数初期略有下降然后逐渐上升 ,在稳定期达到最大值。16∶0,18∶1n9的含量在稳定期显著升高 ,而EPA的含量在稳定期明显下降。在对数初期,藻细胞在pH6.8的条件下含有较高的EPA含量,而在 pH9.8的条件下 。

固定化微绿球藻去除NH_4^+-N、PO_4^(3-)-P效果的研究

为了探究固定化微绿球藻(Nannochloropsis oculata)去除污水中NH_4^+-N、PO_4^(3-)-P的效果,采用海藻酸钠固定化包埋技术进行实验。开展了固定化藻球大小、藻细胞包埋密度、藻球投放质量及充气培养条件对NH_4^+-N、PO_4^(3-)-P去除效果的单因子试验研究。结果表明,固定化藻球大小、藻细胞包埋密度、藻球投放质量和充气培养条件对NH_4^+-N、PO_4^(3-)-P的去除效果影响显著(P<0.05)。藻球直径3.5 mm时生长速率(K)值最大(0.332±0.002),同时NH_4^+-N、PO_4^(3-)-P去除率效果最佳,分别为(75.08±3.83)%和(80.80±3.81)%;藻细胞包埋密度100×10~4 cells/ball时K值最大(0.330±0.033),而NH_4^+-N、PO_4^(3-)-P去除率则以藻细胞包埋密度300×10~4 cells/ball组为佳,分别达(87.20±0.43)%和(82.58±1.72)%,但考虑单位藻细胞去除率,包埋密度以100×10~4 cells/ball为宜;随着藻球用量的增加K值下降,10g/L组K值最大(0.301±0.02)、50 g/L组K值最小(0.193±0.01),投放量30和50 g/L时NH_4^+-N去除率较高分别为(84.12±0.78)%和(84.63±0.45)%,30 g/L组PO_4^(3-)-P去除率最高达(77.13±1.43)%。综合考虑,藻球投放量选用30g/L为宜;充气条件培养K值、NH_4^+-N和PO_4^(3-)-P去除率显著(P<0.05)高于不充气,K值分别为(0.306±0.006)和(0.177±0.010);NH_4^+-N去除率分别为(85.93±0.45)%和(49.32±0.45)%;PO_4^(3-)-P去除率分别为(66.66±5.00)%和(46.29±2.12)%。研究优化了微绿球藻固定化条件:固定化微绿球藻应进行充气培养,藻球规格3.5 mm、藻细胞包埋密度100×10~4 cells/ball、藻球投放量30g/L。

培养条件对眼点拟微绿球藻油脂含量和EPA产率的影响

眼点拟微绿球藻（N.oculata）具有生长速度快、含油量高等优点,且其脂肪酸组成中含有大量二十碳五烯酸（EPA）,因此它是微藻生物柴油的良好原料.以眼点拟微绿球藻为对象,研究了培养时间、盐度、pH值等培养条件对眼点拟微绿球藻油脂含量和EPA产率的影响.试验表明：选择稳定5d为眼点拟微绿球藻的最佳采收时间,油脂含量为378.1 mg/g干藻,EPA产率为5.5 mg/（L·d）;当盐度为16.7时,眼点拟微绿球藻的油脂含量和EPA产率均能达到最高,油脂含量为506.0 mg/g干藻,EPA产率为7.37 mg/（L·d）;在适合眼点拟微绿球藻生长的pH值（8.0～10.0）下,保持整个培养过程中pH值为8.0i油脂含量和EPA产率均较高,油脂含量为471.7 mg/g干藻,EPA产率为7.45 mg/（L·d）.

微绿球藻富集油脂的培养条件优化

为了寻找提高微绿球藻油脂含量的培养方法,以微绿球藻为实验材料,比较了光照强度、温度、盐度、氮浓度、光径对油脂含量的影响。在单因素实验的基础上选择对油脂含量影响较大的因素进行正交实验设计优化培养条件。结果表明:选用5 cm的光生物反应器,在光照强度为5 000 lx、光周期L∶D=10∶14、温度24℃条件下缺氮培养,微绿球藻的油脂含量最高,为46.72%。