微透析-液相色谱-质谱联用技术在中药研究中的应用

微透析-液相色谱-质谱联用技术不仅可以实现活体、实时、连续地微创取样,还具有高灵敏度、分析速度快、检测范围宽等特点,是中药研究的利器,已广泛应用于中药体内过程及作用机制研究等方面。本文对微透析技术进行了简要介绍,并结合相关研究实例,着重介绍了微透析-液相色谱-质谱联用技术在中药活性成分筛选、体内外代谢、药代动力学、代谢组学等研究中的策略及应用。

北五味子对糖尿病脑病大鼠脑中神经活性物质含量影响的在线微透析-高效液相色谱-串联质谱联用分析

采用在线微透析-高效液相色谱-串联质谱联用方法,测定了糖尿病脑病大鼠大脑海马区的8种脑递质的含量,从脑中神经活性物质的角度研究五味子改善学习记忆能力的作用机制.实验结果表明,经五味子治疗后,痴呆大鼠脑透析液中的谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、多巴胺(DA)及5-羟色胺(5-HT)的含量显著降低(P<0.05),牛磺酸(Tau)及乙酰胆碱(Ach)的含量显著升高(P<0.01),天冬氨酸(Asp)和γ-氨基丁酸(GABA)的含量有降低趋势(P>0.05),8种神经活性物质的水平均向正常水平发生了调节.此结果说明五味子可能通过调节糖尿病大鼠大脑中神经活性物质的含量发挥保护中枢神经系统的作用,从而改善糖尿病脑病大鼠的学习记忆能力.Morris水迷宫实验结果表明,五味子水提物可以明显缩短糖尿病脑病大鼠的逃避潜伏期,增加穿越目标区域次数及中心区域(%)(P<0.05).

微透析与液相色谱-质谱联用在药物分析中的应用

目的综述微透析与液相色谱-质谱联用技术在药物体内化学成分分析中的研究进展。方法参阅近几年国内外相关文献,对微透析与液相色谱-质谱联用技术在药物体内内源性物质及外源性物质中的应用进行归纳与总结。结果与结论微透析与液相色谱-质谱联用作为一种新型的分析技术,具有快速简便、干扰少、前处理简单等优点。此项技术在体内药物分析中得到了迅速推广和应用,特别在药代动力学研究中显示出其独特的优势,具有十分广阔的应用前景。

在线微透析-液相色谱-串联质谱法测定人参水提物对糖尿病脑病大鼠脑内神经活性物质的影响

评价人参水提物对糖尿病脑病大鼠学习记忆能力及脑内神经活性物质的影响。建立糖尿病模型,采用Morris水迷宫实验以逃避潜伏期(ELT)、穿越目标区域次数及中心区域(%)为指标评价大鼠的学习记忆能力。利用在线微透析-液相色谱-串联质谱法,Venusil C18柱梯度洗脱,MRM方式检测各组大鼠海马区8种神经活性物质水平并进行比较。结果表明:糖尿病大鼠人参治疗后认知能力明显改善(p<0.05);在线检测方法线性良好(R2>0.99),准确度和精密度满足分析要求;相比模型组,人参组大鼠脑内牛磺酸、乙酰胆碱水平显著升高(p<0.01),谷氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸、γ-氨基丁酸、多巴胺和五羟色胺水平均显著降低,8种神经活性物质水平均向正常水平调节。

微透析-液相色谱-化学发光法测定大鼠脑组织中丹参酚类化合物浓度及其药代动力学研究

目的基于丹参素(DSS)、原儿茶醛(PAL)和丹酚酸B(SalB)对HAuCl4-luminol-H2O2化学发光的增强作用,建立测定大鼠脑微透析液中3种水溶性酚类化合物浓度的液相色谱-化学发光法(HPLC-CL),探讨该分析法在大鼠脑组织药代动力学研究中的应用。方法采用微透析体内连续采样技术,6只SD大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后,将微透析脑探针植入左侧皮质,用林格液2.0μl·min-1的流速灌流。尾静脉注射丹参滴注液(DSS2.5mg·kg-1、PAL0.4mg·kg-1、SalB0.4mg·kg-1)并收集脑透析液样品,脑透析液收集时间间隔为15min。用HPLC-CL法测定给药后大鼠脑透析液中的药物浓度,利用DAS软件拟合并计算其药代动力学参数。结果丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B的脑透析液浓度分别在1.64～430.40、5.30～528.00和8.00～800.00μg·L-1范围内线性关系良好,其检测限分别为0.33、0.22和2.56μg·L-1。以质控样品计算,在各浓度水平下,日间和日内精密度小于5.2%,符合生物样品分析要求。大鼠单剂量静注丹参滴注液后,丹参素在脑组织中的主要药代动力学参数T12、AUC0-∞、MRT0-∞和k分别为(0.64±0.20)h、(369.39±114.77)ng·h·ml-1、(0.64±0.18)h和1.36±0.27。结论建立的HPLC-CL法具有高选择性和高灵敏度等优点,结合微透析采样技术能够实现脑组织中游离丹参素浓度的动态监测,可用于丹参素的生物样品定量分析及药代动力学研究。其中丹参素的脑组织药代动力学参数为国内外首次报道。

超高效液相色谱-质谱联用法测定不同粒径活血散透皮吸收液中4种成分含量

目的比较粒径分别为0.150,0.075,0.048,0.038 mm的活血散透皮吸收前后的大黄素、黄柏碱、小檗碱、药根碱的含量,确定活血散的最佳粒径。方法采用超高效液相-质谱联用技术,对不同粒径活血散透皮吸收液24 h内大黄素、黄柏碱、小檗碱、药根碱的含量进行测定,比较各有效成分的含量,确定活血散的最佳粒径。结果粒径0.075 mm的活血散各有效成分含量较高,透皮吸收后各有效成分含量也较高。结论活血散以粒径0.075 mm的散剂最佳。

建立液相色谱-质谱串联法测定大鼠微透析样品中美罗培南的浓度

目的建立高效液相色谱-质谱串联法（HPLC-MS/MS）用于监测微美罗培南在透析液中实时变化的浓度,为应用微透析技术对感染靶部位美罗培南的药动/药效学研究奠定基础。方法采用COSMOSIL 5C18-PAQ（150 mm×4.6 mm,5μm）色谱柱进行分离,流动相为乙腈-0.1%甲酸水,梯度洗脱,流速1.0 ml/min,分析时间为8 min;美罗培南和内标（安替比林）均在ESI正离子模式扫描,以多反应监测（MRM）模式进行扫描,检测离子对美罗培南m/z 384.2→141.2,内标m/z 189.2→104.0。结果美罗培南在0.01～40μg/ml线性范围内线性关系良好（r=0.9979）;日内及日间精密度在9.76%以内,准确度-7.87～0.28%。结论本法灵敏度高、专属性强、精密度好、准确度高,适用于微透析样品的快速有效分析。

液相色谱-串联质谱法测定大鼠脑透析液中CTN986及其脱糖产物的含量

建立了测定CTN986及其脱糖产物芦丁和陆地棉苷在大鼠脑透析液中含量的高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法. 采用微透析技术结合HPLC-MS/MS, 以甲醇-异丙醇-水-甲酸（体积比20∶10∶70∶0.1）为流动相, 用Zorbax C8柱分离, 待测物通过电喷雾离子化四极杆串联质谱, 以多反应监测方式（MRM）进行检测. 采用外标法分析给予CTN986后大鼠脑透析液中CTN986及其脱糖产物的浓度, 经过体内回收率校正后, 计算出脑透析液中待测物的浓度. CTN986、芦丁和陆地棉苷的线性范围为2~500 ng/mL, 日内及日间精密度（RSD）均小于15%, 准确度（RE）在-4%~13%之间. 本方法专属性强、灵敏度高, 适用于脑透析液中CTN986的药代动力学分析, 为药代动力学研究提供了新的方法学参考.

高效液相色谱电化学法分析伊立替康对大鼠脑内组胺、5-羟色胺的影响

目的采用高效液相色谱电化学检测法,观察伊立替康(CPT-11)对大鼠脑透析液中的组胺(HA)和5-羟色胺(5-HT)含量的影响。方法将18只SD大鼠随机分组,分别为空白组、生理盐水组、伊立替康(CPT-11)组,采用高效液相色谱-电化学检测的方法检测大鼠脑透析液中组胺和5-羟色胺的含量,研究CPT-11对组胺和5-羟色胺含量的影响。结果大鼠注射CPT-11后脑内的组胺、5-HT含量比空白组及生理盐水组显著升高,随着时间和药物代谢的变化,HA及5-HT表现出一定的时效关系,且给药后分别在162.5min、320min达到顶峰。结论 CPT-11可升高大鼠脑内组胺和5-羟色胺的含量,推测抗癌药CPT-11可能对中枢神经组织中HA、5-HT产生影响,单胺类神经系统可能是CPT-11作用靶点之一使之达到透过血脑屏障的作用。

基于微透析-UPLC技术的异嗪皮啶大鼠脑纹状体细胞外液药动学研究

目的:考察大鼠口服给药异嗪皮啶(Isofraxidin)之后的脑纹状体细胞外液药动学特性。方法:大鼠单次灌胃给予异嗪皮啶10 mg.kg-1和20 mg.kg-1后,采用脑微透析活体取样技术和超高效液相色谱质谱联用技术(UPLC-MS),测定给药后60 min内各时间点大鼠脑纹状体细胞外液中透析液异嗪皮啶的浓度,经回收率校正后,采用WINONLIN 6.1程序以非房室模型法拟合药动学参数。结果:大鼠单次灌胃给予异嗪皮啶10 mg.kg-1和20 mg.kg-1后,其主要药动学参数分别为AUC0-∞(13973.88±1582.984)、(28059.76±4207.66)ng.min.mL-1;t1/2(16.68±0.49)、(17.41±2.88)min;Cmax(498.87±64.36)、(899.81±133.22)ng.mL-1;tmax均为15 min,其中Cmax和tmax均为实测值。结论:异嗪皮啶经大鼠口服给药后能够迅速透过血脑屏障,到达纹状体部位,15 min浓度达到最大值,之后药物以较快速率消除,纹状体细胞外液异嗪皮啶浓度具有明显的剂量依赖性。

微透析结合HPLC-ECD测定头孢他啶在大鼠血中含量及其药动学研究

目的研究头孢他啶在大鼠血中的药动学。方法采用血液微透析技术结合高效液相色谱-电化学检测法(HPLC-ECD),以甲醇-0.25mol·L-1Na2HPO4(10:90)(pH7.0)为流动相,检测电压为800mV,在线分析静脉注射头孢他啶(90mg·kg-1)后大鼠的血药浓度,经过体内回收率校正后,用3P87程序拟合药动学参数。结果头孢他啶在0.1-100.0μg·mL-1内线性关系良好(r=0.9998),所测血药浓度经3P87程序拟合后药-时曲线符合一室模型,t1/2为27.82min,cmax为189.40μg·mL-1,AUC为7603.00μg·min·mL-1。结论本方法操作简便,结果准确,能满足头孢他啶药动学分析的需要,为药动学研究提供了新的方法学上的参考。

HPLC-MS/MS法同时检测大鼠微透析液中哌拉西林/三唑巴坦的浓度

目的建立高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS／MS）法同时检测大鼠微透析液中哌拉西林／三唑巴坦的药物浓度。方法利用微透析技术对大鼠肝脏局部给药，并进行采样。微透析样品通过HPLC-MS／MS检测，采用Agilent TC-C18柱，（150mm×4．6mm，5μm），流动相为乙腈-0．5％甲酸，等度洗脱，以负离子扫描多反应监测（MRM）扫描方式进行检测，检测离子对哌拉西林m／z 516.2→233．0，三唑巴坦m／z299．0→138．0，内标替米沙坦m／z513．2→287．0。结果哌拉西林／三唑巴坦的线性范围均为0．0625-43．75μg／mL；日间和日内精密度相对偏差均小于15％；准确度和稳定性均符合生物样品的测定要求。结论本方法灵敏度高，操作简便快捷，适用于微透析样品中哌拉西林／三唑巴坦的浓度测定。

基于LC-MS/MS技术的罗库溴铵微透析探针回收率测定的方法学研究

目的建立罗库溴铵微透析探针回收率的测定方法,考察罗库溴铵在体外及SD大鼠体内探针回收率的稳定性和重现性,为进一步体内微透析试验提供依据。方法采用LC-MS/MS技术测定透析液中罗库溴铵浓度,计算相应的探针回收率;采用增量法（正透析法）和减量法（反透析法）考察不同流速（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0μL/min）、不同药物浓度（50、200、500ng/mL）对体外探针回收率的影响。采用减量法测定SD大鼠体内的探针回收率,并与体外结果进行比较。结果在相同条件下,探针体外回收率在流速为0.5-4μL/min范围内随着流速增加而降低;同一流速下,探针回收率与罗库溴铵浓度无关;增量法和减量法所测得的体外探针回收率在相同条件近似相等,且稳定性良好。减量法测得的SD大鼠体内探针回收率结果与体外相近。结论微透析技术可用于罗库溴铵体内药物动力学研究,反透析法可作为罗库溴铵体内研究的探针回收率测定方法。

微透析活体取样与高效液相色谱-电化学检测法联用测定帕金森大鼠脑中神经递质

建立了一种微透析活体取样与高效液相色谱-电化学检测法联用技术测定自由活动大鼠脑中7种单胺类神经递质的方法。高效液相色谱采用AglientXDB-C18柱,流动相为pH 3.0的0.1 mol/L H3PO4-NaH2PO4缓冲液与甲醇的混合液(90:10,V/V),流速为0.3 mL/m in,电化学检测的工作电极为玻碳电极,工作电位为0.55V。去甲肾上腺素、肾上腺素、3,4-二羟基苯乙酸、多巴胺、5-羟吲哚乙酸和5-羟色胺的线性范围为1.0～5.0×103ng/mL,高香草酸的线性范围为10.0～1.0×104ng/mL;7种物质相关系数均大于0.999,检出限在0.01 ng/mL水平。结合微透析活体取样,成功测定了自由活动大鼠脑纹状体中的神经递质,结果表明帕金森模型组大鼠脑中7种单胺类神经递质的含量较正常对照组有所降低。

微透析法研究麻黄汤对大鼠脑海马区氨基酸类神经递质释放的影响

目的应用微透析技术,研究中医经典方剂——麻黄汤对大鼠脑海马区4种氨基酸类神经递质(谷氨酸Glu、甘氨酸Gly、天冬氨酸Asp、γ-氨基丁酸GABA)释放的影响,并与麻黄药材、麻黄生物碱的作用相对比。方法 SD大鼠分为6组:麻黄汤高剂量组(以麻黄生药计4 g·kg^(-1))、中剂量组(以麻黄生药计2 g·kg^(-1))、低剂量组(以麻黄生药计1 g·kg^(-1))、麻黄药材组(以麻黄生药计2 g·kg^(-1))、麻黄生物碱组(麻黄碱7 mg·kg^(-1)、伪麻黄碱2.4 mg·kg^(-1)、甲基麻黄碱1.12 mg·kg^(-1))以及空白对照组。在动物清醒状态下,微透析采样技术从大鼠脑海马区取样,建立邻苯二甲醛柱前衍生高效液相色谱-电化学法(HPLC-ECD)检测脑透析液中4种神经递质的含量。结果 4种氨基酸类神经递质在28 min内达到良好的分离。麻黄汤各剂量组、麻黄药材组和麻黄生物碱组大鼠脑海马区4种神经递质的含量均增加,与空白对照组比较差异有显著性(P<0.05)。与中剂量麻黄汤组比较,麻黄生物碱组在90 min时明显降低了抑制性氨基酸神经递质Gly和GABA水平。大鼠口服麻黄汤各剂量、麻黄药材水煎液后,海马区兴奋性神经递质Asp和Glu水平呈先增后降的趋势,麻黄汤各剂量组大鼠Glu和Asp水平在给药后90~120 min达峰值,随着麻黄汤给药剂量的增加,Asp和Glu含量亦增加。与中剂量麻黄汤组比较,麻黄水煎液组和麻黄生物碱组Glu水平分别在90 min和150 min达峰值,达峰值时Glu含量均明显增加。结论麻黄汤剂量与Asp、Glu含量的增加呈现一定的正相关性。麻黄汤中其它组分抑制了麻黄和麻黄生物碱升高Glu水平的作用,同时促进了麻黄生物碱对GABA及Gly含量的升高作用。

高效液相色谱-电化学法测定大鼠脑微透析液中多巴胺的方法建立及应用

目的:建立高效液相色谱-电化学(HPLC-ECD)法测定大鼠脑脊液中多巴胺的含量。方法:高效液相色谱采用WatersAtlantis T3色谱柱,以乙腈-缓冲液(75 mmol.L-1三水合醋酸钠,24 mmol.L-1无水柠檬酸溶液,1.2 mmol.L-1十二烷基硫酸钠溶液,0.5 mmol.L-1EDTA-2Na溶液)(20∶80)为流动相,流动相pH 5.4,流速0.32 mL.min-1。考察本方法的专属性、线性范围、精密度和回收率。进一步比较第一代(氟哌啶醇)及第二代(利培酮)抗精神病药对大鼠前额叶皮层(mPFC)和伏隔核(NAC)中多巴胺释放的影响。结果:多巴胺的保留时间为6.6 min,线性范围是0.2～20 nmol.L-1(r=0.9998),日内与日间精密度均<7.3%,回收率在101.4～106.2%之间。给予氟哌啶醇后,mPFC中多巴胺含量基本无变化,NAC中多巴胺显著升高;给予利培酮后,mPFC和NAC中多巴胺均显著升高。结论:该方法准确、灵敏、稳定,适用于脑微透析样品中多巴胺的定量分析。第二代抗精神病药物(利培酮)可能通过升高前额叶皮层多巴胺水平改善阴性症状及认知功能。

高效液相色谱-二极管阵列检测器研究丹参红花微透析回收率的体外测定及影响因素

目的建立同时测定丹参红花提取液中3种有效成分丹参素、羟基红花黄色素A(HSYA)、迷迭香酸含量的高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)方法;以丹参红花为模型药物,对微透析技术应用于中药复方药动学研究进行探索。方法 利用微透析法获得透析液,高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)梯度洗脱测定透析液中待测成分含量,计算丹参红花体外回收率,考察丹参素、羟基红花黄色素A、迷迭香酸在丹参提取液、红花提取液和丹参红花提取液透析媒介中回收率变化情况,并考察浓度、流速对回收率的影响。结果 3种待测成分在30 min内达到良好分离,线性关系良好(r>0.999 0,n=6)。当灌流速度为1.0μL·min-1时,混合标准液中丹参素钠、羟基红花黄色素A、迷迭香酸的回收率依次为11.05%,5.81%,6.73%,随着透析媒介中物质数量的增多,特定成分的回收率有下降趋势,在相同浓度下回收率随流速增大而减少,但与透析媒介中该成分的浓度无关。结论 微透析技术可以用于丹参红花复方药动学研究。本实验建立的HPLC-DAD可作为微透析研究中丹参红花回收率的测定方法。微透析实验应考虑影响回收率因素,选择合适的实验条件,以方便微透析检测。

膜透析/高效液相色谱-串联质谱法测定畜产品中9种β-受体激动剂残留

建立了膜透析/高效液相色谱-串联质谱法(MD/HPLC-MS/MS)检测畜产品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等9种β-受体激动剂的新方法。样品经乙酸铵缓冲液提取和β-葡萄糖苷醛甙酶/芳基硫酸酯酶酶解,采用标准再生纤维素膜(RC,截留分子量MWCO:1000D)透析净化,β-受体激动剂通过膜渗入透析液中,透析液用环已烷-乙酸乙酯(4:1)萃取,经Waters Xbridge C18色谱柱进行分离,以0.1%甲酸水和乙腈作为流动相进行梯度洗脱,电喷雾正离子(ESI+)模式电离,多反应监测(MRM)模式进行检测,外标法定量。结果表明,9种β-受体激动剂在0.5~10μg/kg浓度范围内线性关系良好。方法的定量限为0.5μg/kg,在0.5、1.0、2.5μg/kg 3个添加水平的回收率为72.5%~92.6%,相对标准偏差(n=6)在4.1%~12.7%之间。该方法采用膜透析技术进行净化,无需使用昂贵的固相萃取柱,适用于畜产品中9种β-受体激动剂的经济、高灵敏度的分析检测。

脂质体平衡透析-液质联用色谱法筛选四物汤药效物质的研究

目的:探讨四物汤有效成分与脂质体模拟生物膜的相互作用,以了解其有效成分体内吸收的情况。方法:采用平衡透析与高效液相色谱-质谱联用技术,对四物汤有效成分与脂质体模拟生物膜相互作用进行分析;同时考察了透析时间、脂质体溶液的浓度和缓冲溶液p H对四物汤有效成分与模拟生物膜相互作用的影响。结果:四物汤中有9个成分与脂质体相互作用明显,通过对照品对照及LC-MS方法鉴定了其中6个成分,分别是香草酸、芍药内酯苷、毛蕊花糖苷、芍药苷、洋川芎内酯Ⅰ、肉桂酸;模拟生物膜的浓度对四物汤有效成分与模拟生物膜相互作用影响较大,随着浓度增加,色谱峰面积明显减小,符合被动吸收规律;p H对其中4个成分有明显影响。结论:脂质体平衡透析液质联用色谱法可作为快速筛选中药潜在的活性成分的有效方法,为药效物质基础的进一步研究提供参考。