微重力旋转培养系统对骨髓间充质干细胞分化增殖的影响

目的:观察模拟微重力旋转培养系统(RCCS)对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)体外培养的影响。方法:将兔MSCs与三维载体PGA相复合后,置于RCCS系统中进行培养,观察MSCs增殖能力和超微结构的变化。结果:经过RCCS系统培养,MSCs增殖能力明显增强,细胞形态较静置培养组更接近生理情况。结论:采用RCCS系统进行细胞/载体结合物的体外培养,增殖能力有明显增强,细胞的形态更接近生理状态,有助于培养出接近正常软骨生物学特性的工程化软骨。

香菇多糖对抗模拟微重力环境培养的淋巴细胞免疫功能抑制的实验研究

本研究旨在探索香菇多糖对抗旋转式细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)模拟微重力环境下淋巴细胞免疫功能降低的作用。体外分离培养小鼠脾淋巴细胞,在正常重力环境和RCCS模拟微重力环境下分别添加10、20和40μg/ml的香菇多糖溶液,培养24、48和72 h取样,用MTT法、ELISA和流式细胞术分别检测香菇多糖对细胞增殖度、细胞因子分泌量和表面标志表达的影响。结果表明,10、20和40μg/ml香菇多糖在处理时间内对小鼠脾淋巴细胞增殖无明显促进作用;不同浓度的香菇多糖均可提高小鼠脾淋巴细胞在模拟微重力环境下IL-2和IFN-γ的分泌量和促进小鼠脾淋巴细胞表面CD4和CD8分子的表达。结论:香菇多糖具有对抗模拟微重力环境造成的淋巴细胞免疫功能降低的作用。

灌注式RCCS生物反应器CFD模拟分析微载体旋转对细胞氧供的影响

目的:探讨利用微重力旋转细胞培养系统(RCCS)生物反应器仿真模拟分析微载体旋转对细胞氧供的影响。方法:联立不可压缩牛顿流体连续性方程和动量守恒方程、微载体内以及流动空间中氧的传递和反应方程,设置参数并求解;以Gamb it建立RCCS网格模型,并用F luent软件在欧拉多相模式下进行生物反应器数值模拟及流体力学分析。结果:以微载体直径及RCCS旋转速度作为自变量,基于欧拉-欧拉多相模型和氧运输公式成功建立RCCS数值分析模型。微载体直径和旋转速度均影响细胞培养效率,直径200、300、400μm的微载体旋转速度分别为10、12、14 r/m in;旋转1 h后直径600μm的微载体RCCS中间区平均氧浓度增加85%。结论:CFD可以定量模拟分析影响微载体及氧供的相关因素,为优化培养条件提供参数。

HepG2细胞在模拟微重力条件下的生长研究——体外细胞三维生长模型构建

将人肝癌细胞(HepG2)接种于生物可降解支架聚羟基乙酸(polyglycolicacid,PGA)上,采用模拟微重力方法,在具有低剪应力和适宜气体扩散的旋转细胞培养系统(RCCS)中培养,构建体外三维培养模型.通过扫描电镜、透射电镜、RT-PCR、流式细胞术等方法观察分析.结果表明,细胞在此模型中生长良好,细胞呈多面体,含有丰富的微绒毛、线粒体以及胞间有紧密连接形成.该系统有利于细胞形成三维结构,更接近于体内细胞实际生长状况.另外,通过黏附分子表达分析,表明该模型重现了肝癌细胞某些体内侵袭转移特征.一些在肿瘤细胞侵袭和转移过程中具有重要作用的细胞黏附分子(celladhesionmolecules,CAMs)表达有了显著的变化,其中E-钙粘素(E-cadherin)表达降低,CD44、细胞间黏附分子-1(intercellularadhesionmolecule-1,ICAM-1,CD54)以及整合素β1(integrinβ1,CD29)表达增高.在体外实验中,对实验模型的适当选择是得到理想客观实验结果的必要前提,采用模拟微重力的方法构建的体外细胞三维培养模型,将为肿瘤生物学研究、药物敏感性试验等提供更为理想的研究模型.

模拟微重力条件HN13细胞的生长特点

目的:观察口腔鳞状细胞癌细胞HN13在模拟微重力条件下的形态学特点和生长情况,检测肿瘤细胞分化和侵袭相关基因的表达,并分析其生物学意义。方法:将HN13细胞接种于聚乳酸-羟基乙酸(poly lactic-co-glycolicacid,PLGA),应用旋转细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)进行模拟微重力培养14d,光学倒置显微镜下观察细胞的形态,以实时定量PCR检测分析立体培养和平面培养细胞中,HIF1α、TGFβ1、VEGF-C、NF-κB和CCND1等基因的表达。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果:细胞贴附于PLGA材料表面呈立体生长,表现为典型角化细胞形态,并形成类角化珠样结构,与口腔鳞状细胞癌细胞形态相似。HIF1α,TGFβ1和NF-κB表达降低(P<0.05),VEGF-C表达升高(P<0.05),CCND1表达无显著改变(P>0.05)。结论:模拟微重力条件下三维培养的细胞更接近体内细胞的真实形态,模拟微重力可作为构建体外细胞三维培养模型的方法。

旋转微重力细胞培养系统下Indianhedgehogd转染兔BMSCs促进成软骨分化并抑制老化的实验研究

目的探讨模拟微重力环境下,Indianhedgehog(IHH)基因过表达对兔BMSCs成软骨分化的影响。方法取第2代兔BMSCs,分为旋转微重力细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)组和传统组2个大组,每个大组进一步分为3个亚组,即IHH基因腺病毒载体转染组(RCCS 1组和传统1组)、绿色荧光蛋白腺病毒载体转染组(RCCS 2组和传统2组)及空白对照组(RCCS 3组和传统3组)。RCCS组细胞均在模拟微重力环境下进行成软骨细胞诱导分化;常规组在6孔板中进行常规细胞培养及成软骨细胞诱导分化。诱导分化过程中,检测IHH蛋白表达(ELISA法)及ALP活性;实时荧光定量PCR检测软骨及软骨肥大相关基因表达;Wertern blot法检测Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖(aggrecan,ANCN)蛋白表达;并取细胞爬片行甲苯胺蓝染色及膜联蛋白V(Annexin V)-cy3免疫荧光染色观察。结果转染后荧光显微镜下RCCS 1、2组可见明显绿色荧光,转染效率约95%。ELISA检测示,RCCS及传统1组IHH蛋白均明显高于2、3组(P<0.05);传统1组各时间点ALP活性均高于传统2、3组(P<0.05),RCCS 1组ALP活性仅于诱导分化3、7 d稍高于RCCS 2、3组(P<0.05)。实时荧光定量PCR检测示,传统1组在诱导分化早期高表达Ⅱ型胶原、ANCN,但在后期高表达Ⅹ型胶原、ALP及AnnexinⅤ(P<0.05);RCCS1组在诱导分化各时期均高表达软骨相关基因Ⅱ型胶原、ANCN、SOX9,且低表达软骨肥大相关基因Ⅹ型胶原、ALP及AnnexinⅤ(P<0.05)。Wertern blot法检测示,诱导21 d时传统1组Ⅱ型胶原蛋白表达量明显低于传统2、3组(P<0.05);RCCS 1组各时间点Ⅱ型胶原、ANCN蛋白表达量均明显高于RCCS 2、3组(P<0.05)。甲苯胺蓝染色示,诱导21 d时传统1组染色浅于传统2、3组,RCCS 1组各时间点染色均明显深于RCCS 2、3组;Annexin V-cy3免疫荧光染色示,各时间点传统1组红色荧光均强于传统2、3组,RCCS各亚组红色荧光表达均较弱且组间无明显差异。结论在模拟微重力环境下,IHH基因转染BMSCs可有效促进软骨生成,并抑制软骨老化或向成骨发展,适合软骨组织工程的需要。

模拟微重力培养肝细胞的形态特点

目的 模拟微重力方法培养大鼠原代肝细胞 ,初步分析其形态学特点及其意义。方法 改良Seglen原位胶原酶灌注法获得大鼠肝脏单细胞悬液 ,2 .2× 10 5个 /ml加微载体Cytodex 3(4 g/L)接种 ,采用旋转细胞培养系统 (RCCS)进行模拟微重力培养。第 0、6、2 4、72、12 0、168小时取样 ,相差、体视显微镜观察活细胞形态 ,第 2 4小时标本苏木素 伊红 (HE)染色观察组织学形态 ,电镜观察超微结构。结果 模拟微重力培养中肝细胞 2 4h内贴附微载体并出现三维结构 ,2 4～ 72h发展为独特的肝细胞 微载体聚球体。电镜下可见细胞膜的 3种不同形态 ,其分布与功能相一致。结论 模拟微重力培养方法能使肝细胞形成分化的三维类组织结构 。

模拟微重力条件对神经细胞分泌功能的影响

目的分析微重力条件下和正常重力条件下神经细胞培养的上清液中蛋白质表达的差异。方法用旋转细胞培养系统提供的微重力环境进行神经细胞微重力培养。应用表面增强激光解吸离子化（SELDI）蛋白质芯片技术检测微重力和正常重力条件下神经细胞培养上清液的蛋白质谱。用PBSII—C型蛋白质芯片阅读机读取数据，采用Ciphergen Protein Chip3．2．1软件分析数据。结果WCX2两种蛋白芯片共捕获246个蛋白峰，发现14个差异蛋白。与正常重力培养组蛋白谱相比，11个蛋白在微重力培养后高表达，3个蛋白在微重力培养后低表达。结论微重力条件下和正常重力条件下神经细胞培养的上清液中存在差异蛋白表达，这些差异蛋白为进一步了解失重对神经细胞的影响提供了重要线索。

模拟微重力对小鼠肝kupffer细胞增殖及相关基因表达的影响

目的探讨旋转式细胞组织培养系统（RCCS）模拟微重力对小鼠肝Kupffer细胞增殖及相关基因表达的影响。方法应用RCCS建立模拟微重力细胞培养系统。将小鼠肝原代Kupffer细胞随机分为模拟微重力组（SMG）和正常重力组（NG）。分别于培养第3、5、7天收获细胞。采用血球计数板进行细胞计数，流式细胞仪检测细胞周期，实时荧光定量PCR测定PCNA、Ki．67、ERK、CDK2以及CyclinB基因表达水平。结果培养第3天时，SMG组细胞计数明显低于NG组（2．6±0．1比3．1±0．2，P〈0．05），培养第5、7天SMG组明显高于NG组（6．9±0．4比5．9±0．2，P〈0．05；8．4±0．3比6．5±0．3，P〈0．05）。流式细胞仪检测结果显示，培养第3天SMG组G0／G1期比例明显高于NG组（78．1±0．2比59．7±1．2，P〈0．05），S期、G2／M期比例明显低于NG组（12．0±0．4比27．6±0．9，P〈0．05；9．9±0．3比12．7±0．4，P〈0．05）；培养第5天，SMG组G0／G1期比例低于NG组（69．5±1．5比74．8±0．7，P〈0．05），S期、G2／M期比例高于NG组（21．2±1．5比17．3±0．4，P〈0．05；9．3±0．4比7．9±0．4，P〈0．05）；培养第7天，SMG组G0／G1期比例依然低于NG组（73．9±1．9比81．7±1．3，P〈0．05），S期、G2／M期比例亦高于NG组（18．9±1．9比12．1±0．8，P〈0．05；7．3±0．2比6．2±0．6，P〈0．05）。实时荧光定量PCR结果显示，与NG组相比，SMG组PCNA、Ki-67、ERK、CDK2以及CyclinB基因表达在培养3天时均下调，第5和7天呈现明显上调趋势。结论在RCCS模拟失重应激损伤期，小鼠肝Kupffer细胞增殖功能受到抑制，以后Kupffer细胞增殖能力在相关基因的参与调节下得以恢复并被激活强化。

胰腺癌肝转移体外模型的构建

目的使用旋转细胞培养系统(rotatingcellculturesystem,RCCS)模拟微重力环境,建立胰腺癌肝转移的体外模型。方法将人肝组织块和人胰腺癌细胞株BxPC3置于旋转细胞培养系统中混合培养,在额定时间点取肝组织块送病理,HE染色观察肝组织结构和胰腺癌细胞在肝组织块中生长情况。结果混合培养第1天人肝组织块周围和管腔内即有胰腺癌细胞粘附并聚集;第3天可见肝组织块中有散在癌细胞浸润;第7天可见微小转移灶形成;混合培养第10天胰腺癌肝转移灶、肝细胞形态和肝小叶结构可保持完好,并可见癌组织块形成。结论使用旋转细胞培养系统模拟微重力环境,构建胰腺癌肝转移体外模型,可以用于胰腺癌肝转移过程和机制的研究,为研究胰腺癌细胞和肝组织间的相互关系提供新的方法。

提高冻存胚胎胰岛移植效果的实验研究

目的探讨三维组织细胞旋转培养系统(RCCS)对胚胎胰岛冻存复苏后质量的影响。方法将胚胎胰岛平均分为3组,实验组1、2为胚胎胰岛冻存前后分别用RCCS培养和普通培养,对照组新鲜胰岛经RCCS培养。切取胚胎胰腺,胶原酶V消化,纯化。然后进行标准冻存步骤,复苏后继续培养。并检测各组胰岛数量、活性、胰岛素刺激实验结果。结果纯化后收获胰岛最多每个胚胎5012.73IEQ,最少2432.68IEQ,平均(3548.07±273.46)IEQ。微重力培养组胰岛细胞存活率、胰岛素释放量、胰岛素刺激指数等均高于普通培养组。移植经过微重力培养的(2000±1)%IEQ新鲜胚胎胰岛或冻存胚胎胰岛在移植后1周内可达100%纠正糖尿病。结论微重力旋转培养有利于胰岛细胞的生长繁殖,使胰岛具有更好的胰岛素分泌能力,该方法同胰岛冻存相结合,可以进一步提高胰岛的冻存效果,为胰岛库的成功建立探索出一条新的途径。