基于微量中和试验的社区健康人群新型冠状病毒中和抗体高通量检测方法评价

目的:以微量中和试验为金标准,评价胶体金法和酶联免疫吸附法这两种高通量检测方法的检测能力。方法:以江苏省南京市某社区招募的250名健康成年人为研究对象,采集血样开展中和抗体水平分析,用微量中和试验、胶体金法和酶联免疫吸附法分别对血样进行测试,评价这两种高通量中和抗体检测方法的灵敏度、特异度及与金标准的相关系数等。结果:当金标准的判定界值取为1∶4时(<4为阴性),胶体金法的灵敏度为97.50%,特异度为98.82%,正确指数为0.963,与金标准之间的Kappa值为0.9632;酶联免疫吸附法的灵敏度为95.00%,特异度为100.00%,正确指数为0.950,Kappa值为0.9627。这两种方法相对于微量中和试验的相关系数为0.963。结论:建立的新型冠状病毒中和抗体高通量检测方法具有科学性和可行性。

猪瘟弱毒苗预防牛病毒性腹泻/粘膜病的短期安全性与微量中和试验

作者用猪瘟弱毒苗预防牛病毒性腹泻/粘膜病的短期安全性和中和抗体效价进行了测定.动物短期安全性试验结果表明:用大剂量(每头10～25个免疫剂量单位)猪瘟弱毒苗注射犊牛、成年奶牛、怀孕母牛和牦牛后,对体温、食欲、生产性能及妊娠牛的胎儿均无不良影响.微量中和试验结果表明:成年奶牛每头注射6个免疫剂量单位的猪瘟弱毒苗15d后,有50%产生保护性中和抗体;每头注射10个免疫剂量单位的猪瘟弱毒苗15d后,有83.3%产生保护性中和抗体;小牛每头注射3个免疫剂量单位的猪瘟弱毒苗15d后,有50%产生保护性中和抗体;抗体产生的滴度与免疫剂量成正比.上述结果表明用猪瘟弱毒苗预防牛病毒性腹泻/粘膜病是安全有效的,具有实用价值.

应用微量中和试验进行猪伪狂犬病血清学调查

应用细胞培养微量中和试验（固定病毒稀释血清法）对来自２４个猪场共４２６份血清进行了猪伪狂犬病血清学调查。共检出阳性血清１７１份，血清阳性率达４０．１％，出现血清阳性的猪场有２０个，占所检测猪场的８３．３％，说明伪狂犬病在我省及我国流行相当严重。对其中５０份血清的中和指数（固定血清稀释病毒法）进行了检测，结果中和效价大于１∶２血清的中和指数都在１０２．５以上。

整合猪瘟病毒囊膜糖蛋白假型鼠白血病病毒微量中和试验的建立和初步应用

将构建的真核表达载体pcDNA-E0、pcDNA-E2和pcDNA-E012分别与MuLV假型病毒构建体系的2种骨架载体pHIT60和pHIT111经磷酸钙瞬时共转染293T细胞,48h后收集假病毒上清,超速离心后用抗CSFV多抗通过Western blot分析发现只有E012蛋白能够在假病毒颗粒表面表达,说明E012能够整合到假型病毒粒子表面。将此假病毒(MuLV-E012)感染SK6、PK-15、ST、BHK21、Vero、COS7、293T和CEF等8种细胞,48h后检测发现只有在SK6、PK-15和ST等猪源细胞中标记基因LacZ能有效表达,表明所构建的假病毒具有感染性,只能感染猪源细胞,进一步证实了猪瘟病毒对猪的单一嗜性,并且感染性与NH4Cl浓度存在极显著的线性负相关性,结果表明猪瘟病毒进入宿主细胞的过程有pH依赖性。将假病毒MuLV-E012代替强毒Shimen株与标准阴性、阳性血清和倍比稀释的待检血清混合后感染PK-15细胞,建立了微量中和试验,与全病毒微量中和试验进行了比较,结果表明所建立的方法能够代替强毒进行血清中和试验,检测临床血清的猪瘟病毒抗体中和效价。

赤羽病细胞培养微量中和试验

引言赤羽病又名阿卡斑病(Akabane disease)。本病是由阿卡斑病毒(Akabane virus简称AKV)引起的牛、羊一种传染病。成年牛、羊临床上呈现隐性感染,但感染的敏感动物的后代发生流产、早产、死胎、新生胎儿发生关节弯曲(AG)和积水性无脑症(HE)为特征。

酶联免疫试验与微量中和试验方法对脊髓灰质炎服苗效果观察的比较

本文对30名儿童口服脊灰炎疫苗,用ELISA与微量中和试验方法对其服苗效果进行观察比较,它们之间Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型阳性符合率分别为96.2％、92.2％和85.7％,总符合率则分别为90％、86.7％和83.3％,认为ELISA-IgG法不失为检测脊灰炎抗体的一种特异、敏感的有效手段,可以代替MNT法,应用于脊灰炎血清流行病学调查,尤其更适于不具备开展组织培养的基层单位推广应用。

马病毒性动脉炎血清微量中和试验的研究及应用

参照美国的马病毒性动脉炎（ＥＶＡ）诊断技术和马动脉炎病毒（ＥＡＶ）标准种毒和阳性、阴性血清，确立了ＥＡＶ在ＲＫ－１３细胞上生长的最适条件，制备了标准ＥＡＶ高免血清建立了ＥＡＶ微量中和试验。通过对进出口的５５０头份马血清抗体检测，有１９头血清抗体滴度达１４～１１２８。用标准马传贫阳性血清进行交叉中和试验未发现交叉反应；用自制的琼扩抗原进行比较试验，有８头份为阳性，证实微量血清中和试验与琼扩试验的符合率为４２．１％。

水痘-带状疱疹病毒快速微量中和试验的建立与初步应用

目的 建立水痘-带状疱疹病毒（VZV）的快速微量中和试验筛查技术,用于高免原料血浆的筛选和VZV特异性免疫球蛋白（VZIG）的制备。方法 参考美国FDA批准的VZIG制品,设立原料血浆筛选滴度的下限;通过病毒滴度优化,设立快速微量中和试验筛查体系中的病毒使用滴度;建立筛选体系并引入VZIG国际标准品作为质量控制,对1∶2~1∶256倍比稀释的各滴度的单人份和混合原料血浆进行测定,同时利用抗VZV中和抗体ELISA检测试剂盒Vacc Zyme复核快速微量中和筛选结果,对其灵敏度进行分析。结果快速微量中和筛选试验中原料血浆的最低筛选下限为1∶16（VZV中和抗体滴度不低于0.4 U/ml）;筛选体系病毒使用滴度为1500 PFU/ml;20份单采血浆中有8人份的滴度≥1∶16,混合血浆中无符合筛选标准的样本;ELISA的复核结果与快速微量中和试验呈良好的直线关系（r=0.895 24,P〈0.0001）。结论 快速微量中和试验的灵敏性、通量和可操作性等,适于VZV高免原料血浆的筛选,解决了VZIG制备中原料血浆筛选的关键技术问题。

rRT-PCR与微量中和实验法用于脊灰病毒血清定型的比较

目的对实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)法和微量中和实验2种脊灰病毒的血清型鉴定方法进行评价。方法按世界卫生组织(WHO)《脊髓灰质炎实验室手册》第4版进行病毒分离,用rRT-PCR法和微量中和实验方法对分离到的L20B阳性分离物进行PV的血清型鉴定,用rRT-PCR法进行型内鉴定。结果 rRT-PCR法与微量中和实验对L20B阳性分离物进行脊灰病毒的血清型定型,2种方法检测脊灰病毒阳性率差异无统计学意义,检测NPEV阳性率差异也无统计学意义;rRT-PCR方法检测脊灰病毒的灵敏度为100%,特异度为100%;检测NPEV的灵敏度为63.16%,特异度为100%。结论作为WHO推荐使用的新的型内鉴定方法,rRT-PCR法对于脊灰病毒的血清型定型与常规微量中和实验一致率为100%,该方法方便快捷,可以缩短检测时限;对于NPEV的检测特异度较高,但灵敏度低于微量中和实验。

基于微量中和试验的新冠感染者血清样本中和抗体高通量检测方法评价

目的基于微量中和试验为金标准,评价两类三种高通量中和抗体检测方法的检测能力。方法以江苏省2020年以来发现的64例新冠病例为研究对象,采集早期和随访血清样本共117份开展中和抗体水平分析,用微量中和试验、假病毒中和抗体试验(PBNA)、竞争抑制试验[酶联免疫法(ELISA)和化学发光免疫法(CLIA)]别对血清样本进行测试,评价这些高通量中和抗体检测方法的相关系数及有效性的临界值等。结果新冠感染者假病毒中和抗体试验、酶联免疫法、化学发光免疫法相对于微量中和试验检测的相关系数分别为0.760、0.778和0.725,当微量中和试验的临界值取为1:10时(小于10为阴性),PBNA检测方法的Cutoff值为50时,ROC曲线下面积为0.901;ELISA检测方法的Cutoff值为1∶8时,ROC曲线下面积为0.934;CLIA检测方法的Cutoff值为1.28AU/ml时,ROC曲线下面积为0.838。结论建立的新冠病毒中和抗体高通量检测方法具有科学性和可行性,为新冠疫情常态化防控提供重要的技术手段。

人血清中寨卡病毒微量中和抗体检测方法的建立和应用

目的 建立人血清寨卡病毒（ZIKV）微量中和抗体检测方法,并用10例经核酸检测和/或病毒分离确诊的寨卡输入病例的急性期和恢复期血清样本进行分析验证.方法 采用分离自输入寨卡病例的寨卡病毒株开展组织培养微量中和抗体测定,在BHK21、VERO和VERO-E6 3种细胞系中选择感染寨卡病毒后能产生典型CPE的细胞系制备病毒储备液,滴定病毒滴度;使用100TCID50的病毒液与连续4倍稀释的经56℃ 30 min灭活的血清于37℃中和2h,然后加入细胞悬液.5％二氧化碳培养箱孵育,逐日观察CPE.结果 BHK21、VERO和VERO-E63种细胞系对寨卡病毒感染的敏感度不同,其中VERO细胞最为敏感,可出现典型的CPE;应用VERO细胞系建立寨卡病毒微量中和抗体检测方法能准确反映寨卡确诊病例急性期和恢复期血清中和抗体水平,并能作为一种特异性诊断方法.结论 寨卡病毒微量中和抗体检测方法不仅可用于人感染寨卡病毒的实验室诊断,还可用于人群血清流行病学调查.

赤羽病微量病毒中和试验诊断方法的研究

应用引自日本的赤羽病病毒 ,制备了微量病毒中和试验抗原和高免阳性血清 ,建立了赤羽病微量病毒中和试验诊断方法。应用此方法对广东省 72 4头牛血清进行了检查 ,阳性率为 35 .3% ,对上海 6 6 5头牛血清作了检查 ,阳性率为 6 7.7% ,说明这些地区曾流行过赤羽病。同时对澳大利亚当地牛 10 8头进行检查 ,阳性率为 5 5 .5 % ,与国外报道一致。对澳大利亚、加拿大、美国进口牛 173头的检查结果 ,全部阴性。对澳大利亚进口羊 992头的检查结果 ,发现阳性 1头 ,已得到澳方认可。

广州地区轮状病毒血清分型的研究 2.应用微量细胞病变定量读数中和试验对急性病毒性胃肠炎患儿HRV各血清型中和抗体的分析

用微量细胞病变定量读数中和试验,以HRV血清1、2、3、4型的四个标准毒株为抗原,分别检测了1987年广州地区51例健康儿童和30例急性病毒性胃肠炎患儿的急性期及恢复期血清中抗HRV各血清型中和抗体的水平。结果表明30例患儿中的23例,其恢复期血清中的中和抗体比急性期有4倍以上的增长,抗HRV血清4型者占39.1％,抗HRV血清3型占30.4％,抗HRV2型者8.7％,抗HRA1型为17.4％。初步认为1987年广州地区流行的HRV型别以血清型4型为主。

H5N1型禽流感病毒广谱中和单克隆抗体的筛选及其中和机制初步研究

利用杆状病毒-昆虫细胞表达H5N1型禽流感病毒的血凝素蛋白(HA),纯化后的重组蛋白HA免疫小鼠并制备杂交瘤单克隆抗体,用H5N1型禽流感病毒的全病毒进行筛选,成功地获得了抗H5N1型禽流感病毒血凝素蛋白HA的单抗.MDCK细胞微量中和试验表明,单抗8G10D7可对clade2和clade9的H5N1型禽流感病毒起中和作用.Western-blot及血凝抑制实验进一步证明了该单抗的结合位点位于HA蛋白的HA1亚基上.鸡胚感染病毒预防试验结果表明,8G10D7对禽来源的和人来源的H5N1型禽流感病毒均可达到100%的保护率;在治疗试验组中,8G10D7对禽来源的病毒感染具有较高的保护率,可达100%,对人来源的H5N1型禽流感病毒最高也可达87.5%的保护率.该抗体的获得不仅为H5N1型高致病性禽流感病毒的预防和治疗带来了希望,同时其中和位点的发现也为以后亚单位疫苗的研制提供新的思路.

qRT-PCR快速检测汉滩病毒抗体中和活性实验方法的建立

目的:建立一种基于qRT-PCR的微量细胞中和实验改良法,快速、定量检测汉滩病毒感染中的中和抗体活性。方法:将本室前期制备的抗汉滩病毒高中和活性鼠源性单抗3G1、鼠/人嵌合单抗1D9和感染剂量为100 TCID50的病毒混合液于37℃孵育1 h后感染Vero-E6细胞,提取细胞总RNA。根据GenBank数据库中汉滩病毒76-118株S基因序列设计特异性引物,在上述实验基础上以细胞总RNA为检测样品,建立qRT-PCR快速、定量检测汉滩病毒感染中中和抗体活性的实验方法。结果和结论:建立了一种基于qRT-PCR的微量细胞中和实验改良法,可定量测定汉滩病毒感染中的中和抗体活性,该法具有快速、灵敏、特异和重复性好等优点。

两种ELISA试剂盒与血清中和试验检测牛赤羽病的比较

为比较两种商品化赤羽病抗体ELISA试剂盒的敏感性和特异性,以及ELISA和微量血清中和试验(SNT)的符合率,采用两种ELISA试剂盒和血清中和试验,对690份澳大利亚纯种荷斯坦奶牛血清进行牛赤羽病检测。试验结果显示:法国某公司生产的赤羽病ELISA试剂盒敏感性为93.42%,特异性为81.23%,与SNT间的Kappa值为0.615,为高度符合;日本某公司生产的赤羽病ELISA试剂盒敏感性为39.47%,特异性为96.1%,与SNT间的Kappa值为0.427,为中度符合。比较结果表明:日本某公司生产的试剂盒敏感性较低,容易漏检,不适合用于牛赤羽病初筛;在出入境检疫中,可以采用高通量、半自动化、敏感性高的ELISA方法,对血清样本进行筛选,再采用特异性强的SNT试验进行辅助验证。

抗H7N9流感病毒中和抗体快速检测方法的建立及应用

目的:对建立的抗H7N9流感病毒中和抗体快速检测方法进行方法学验证及初步应用。方法:分别采用不同代次细胞对高、中、低不同滴度的阳性血清进行多次平行检测,考察细胞代次对检验结果的影响;采用NIBSC提供的参考品对方法学的特异性进行验证;同时应用抗H7N9的阳性血清检测进一步评估方法的准确性和精密性;采用ELISA-MNT法和血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)试验分别接种H7N9灭活流感疫苗免疫的小鼠血清样本20份,分析两种方法检测结果的相关性。结果:采用ELISA-MNT中和法,使用不同代次MDCK细胞(25、30和35代)检测相同的血清样本的中和抗体滴度结果相同;该方法只对羊抗H7N9的血清具有较高保护力,对其他血清基本没有交叉反应;该方法准确性良好;该方法组间、组内精密性的平均变异系数分别为4%和11%。该方法测定H7N9型流感疫苗免疫后的小鼠血清抗体效价,其结果与HI抗体的相关系数为0. 61,表明两种方法的检测结果之间呈良好的正相关性。结论:建立的微量病毒中和法能够满足H7N9流感病毒中和抗体效价检测的要求,可用于H7N9新型大流行流感疫苗的免疫评价。

应用FG细胞检测淋巴囊肿病毒中和抗体方法的建立

将提纯的淋巴囊肿病毒(LCDV)接种于牙鲆鳃细胞系(FG),可以观察到明显的细胞病变,半数细胞培养物感染量(TCID50)为22.88/40μL。微量细胞病变中和实验显示患淋巴囊肿病的牙鲆血清以及通过免疫获得的兔抗LCDV血清对LCDV感染都具有明显的中和作用,具有中和效果的血清最高稀释度分别为1∶64和1∶160。本文建立的FG细胞检测LCDV中和抗体方法可以作为筛选LCDV中和抗体的有效途径,且重复性和稳定性较好。

猪伪狂犬病油乳剂灭活疫苗的制备及安全性与免疫性试验

用本室分离鉴定的猪伪狂犬病毒鄂A强毒株接种仓鼠肾细胞 (BHK 2 1) ,制备病毒抗原液 ,毒价不低于 10 6TCID50 / 0 1ml。经一定浓度的甲醛溶液灭活后与油相佐剂乳化研制成油乳剂灭活油疫苗 4批。本研究对该制品的安全性、免疫性进行了测定。对 18g左右小白鼠接种 0 3ml,初生仔猪、断奶仔猪及妊娠母猪加倍剂量注射 ,均未出现不良反应 ,安全性良好。对母猪的繁殖性能不产生影响。后备母猪及妊娠母猪血清中和抗体指数于免疫后 2 1d达到 316以上 ,间隔 35d加强免疫一次后 ,中和抗体指数可达 10 0 0以上。断奶仔猪及初生仔猪免疫后对强毒的攻击 ,保护率分别为 10 0 %及 90 62 %。