应用PCR微量板杂交法检测植物病毒和类病毒

近年来,核酸杂交技术已广泛用于病毒和类病毒的检测。通常采用PCR(聚合—酶链式反应)微量板杂交法。它是由Inouye和Hondo(1990)首先改正的一种新的杂交方法,是以RT-PCR为基础,类似于ELISA高灵敏度的诊断技术,可以检出极微量的病原物,如10fg病毒RNA,灵敏度为ELISA的10000倍,特异性比PCR强,很适宜进出境植物苗木、种子的检疫。其基本原理:从感病植物叶片或种子中抽提病毒或类病毒核酸,经反转录(reverse transcription)为cDNA,再经聚合酶链式反应(Polymerase chain reacdon,PCR)扩增cDNA片断,把cDNA加热变性后直接吸附于聚苯乙烯微量板孔内;将吸附于孔内的cDNA与地高辛(DIG)标记的cDNA探针杂交;

微量板杂交法和斑点杂交法检测菊花矮化类病毒的比较

利用狄高辛(DIG)标记制备菊花矮化类病毒(CSV)特异性探针,由反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进行CSV RNA的反转录和cDNA的扩增,然后比较2种核酸杂交方法——微量板杂交和斑点杂交检测CSV的灵敏度。本研究结果表明,30 mg干燥样本抽提的CSV RNA被稀释400倍,取4 μL(约750 pg样本抽提的RNA)经RT-PCR,其产物再用10×SSC稀释100倍,采用微量板杂交仍可以很容易得到阳性结果,而采用斑点杂交法,同样条件下PCR产物被稀释8倍就不易得到阳性结果。所以,微量板杂交法比斑点杂交法具更高的灵敏度。