启膈散对人食管癌EC9706细胞增殖、凋亡及miR-133a/Akt/mTOR信号通路的影响

目的:观察启膈散对EC9706细胞增殖、凋亡的影响和对微RNA-133a(miR-133a)/蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响。方法:采用乙酸乙酯法提取启膈散有效部位;噻唑蓝(MTT)比色法筛选启膈散细胞用药剂量及检测启膈散对EC9706细胞增殖的影响;流式细胞仪检测启膈散对EC9706细胞凋亡的影响;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测启膈散对miR-133a及胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)mRNA表达的影响;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测启膈散对miR-133a/Akt/mTOR通路靶蛋白Akt,mTOR的表达。结果:与空白组比较,启膈散可抑制EC9706细胞的增殖(P<0.01),并呈剂量依赖性,筛选30%抑制浓度(IC30)40 mg·L^(-1)和半抑制浓度(IC50)80 mg·L^(-1)进行后续实验;与空白组比较,抑制剂组、抑制剂+启膈散组均可抑制EC9706细胞增殖(P<0.01),筛选抑制剂0.25μmol·L^(-1)进行后续实验;与空白组比较,启膈散80 mg·L^(-1)组可明显促进EC9706细胞晚期凋亡率及总凋亡率(P<0.05),启膈散40 mg·L^(-1)组可促进EC9706细胞晚期凋亡率(P<0.05),与Akt/mTOR抑制剂联合用药后,可协同增效。与空白组比较,各组均能提高miR-133a表达(P<0.05),其中抑制剂与中药抑制剂+启膈散组促进作用明显。与空白组比较,各组均能够均可明显降低Akt,mTOR蛋白表达(P<0.05),与单独用药比较,抑制剂与中药联合应用组Akt,mTOR的蛋白表达有所降低。结论:启膈散能够抑制食管癌EC9706细胞的生长,促进EC9706细胞的凋亡,其抑制机制可能与调控miR-133a的表达,影响其下游Akt/mTOR信号通路有关。

附子汤对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞MH7A增殖和miR-155表达的影响

目的:观察附子汤对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞MH7A增殖的影响,研究附子汤对miR-155表达的影响并进一步探讨其抗类风湿性关节炎的作用机制。方法:体外培养MH7A细胞,设空白组、附子汤高剂量组(25 g·L^(-1))、低剂量组(12.5 g·L^(-1))和硫酸羟氯喹阳性药组(0.00625 g·L^(-1)),采用细胞增殖与活性检测(CCK-8)试剂盒法检测细胞增殖,流式细胞术检测MH7A细胞周期的改变;应用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)法检测药物处理后miR-155及其下游基因含SH2结构域的肌醇5-磷酸酶-1(SHIP-1)、蛋白激酶B3(Akt3)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)mRNA表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、Akt3和mTOR的蛋白表达。结果:附子汤体外在质量浓度6.25 g·L^(-1)以上时,能明显抑制MH7A增殖,且呈明显的量-效关系和时-效关系。与空白组比较,附子汤高、低剂量组G2/M期细胞比例均明显增加(P<0.05),高剂量组G0/G1期细胞比例明显降低(P<0.05),其细胞周期的阻滞作用呈明显的量效关系。与空白组比较,附子汤高、低剂量组miR-155的表达均明显下调(P<0.05);附子汤高剂量组SHIP1 mRNA表达明显上调、Akt3 mRNA表达明显下调(P<0.05),附子汤高、低剂量组mTOR mRNA表达均明显下调(P<0.05)。与空白组比较,附子汤高、低剂量组的PI3K、Akt3和mTOR的蛋白表达均明显下调(P<0.05)。结论:附子汤对MH7A细胞增殖具有显著的抑制作用,作用机制与下调miR-155的表达,从而促进SHIP-1的表达,抑制其下游PI3K/Akt3/mTOR信号通路的基因表达有关。