微RNA-204-5p、蛋白锌指E盒结合同源盒蛋白1在新生儿肺炎血清中的表达

目的 探讨微RNA-204-5p(miR-204-5p)、蛋白锌指E盒结合同源盒蛋白1(ZEB1)在新生儿肺炎(NP)病儿血清中的表达变化及其在病情评估及预后预测中的临床价值。方法 选取2021年10月至2022年5月张家口市妇幼保健院收治的NP病儿80例为NP组,另选取同期该院出生的健康新生儿80例为对照组。检测血清miR-204-5p、ZEB1、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)及C反应蛋白(CRP)水平并比较;采用Pearson法分析NP病儿血清miR-204-5p、ZEB1水平及其与临床指标的相关性;应用受试者操作特征(ROC)曲线分析miR-204-5p、ZEB1及二者联合预测NP不良预后的价值。结果 NP组血清miR-204-5p水平(0.47±0.16比1.01±0.21)、血氧饱和度[(83.99±6.15)%比(95.32±6.74)%]显著低于对照组,血清ZEB1[(4.76±0.71)ng/L比(2.15±0.36)ng/L]、CK、CK-MB[(46.25±12.52)U/L比(23.22±9.64)U/L]及CRP水平[(18.09±4.29)mg/L比(3.31±0.71)mg/L]均显著高于对照组(P<0.05)。重症组血清miR-204-5p水平、血氧饱和度显著低于轻症组,血清ZEB1、CK、CK-MB及CRP水平均显著高于轻症组(P<0.05)。血清miR-204-5p与CPIS评分、CK-MB及CRP水平呈负相关(r=-0.33、-0.30、-0.40,P<0.05),与血氧饱和度呈正相关(r=0.41,P<0.05);血清ZEB1水平与CPIS评分、CK-MB及CRP水平呈正相关(r=0.28、0.37、0.44,P<0.05),与血氧饱和度呈负相关(r=-0.36,P<0.05);血清miR-204-5p与ZEB1水平呈负相关(r=-0.56,P<0.05)。预后不良组血清miR-204-5p水平、血氧饱和度低于预后良好组(P<0.05),血清ZEB1、CK、CK-MB及CRP水平均显著高于预后良好组(P<0.05)。ROC曲线显示,miR-204-5p对NP不良预后预测的AUC为0.89,截断值为0.47,其灵敏度、特异度分别为95.12%、72.41%;ZEB1对NP不良预后预测的AUC为0.92,截断值为5.16,其灵敏度、特异度分别为87.80%、86.21%;二者联合对预后预测的AUC为0.99,明显高于二者单独诊断,其灵敏度、特异度分别为97.56%、94.83%。结论 miR-204-5p在NP病儿血清中低表达,ZEB1在NP病儿血清中高表达,均与NP病情严重程度有关,二者联合对NP不良预后具有较高的预测价值。

微RNA-204靶向硫氧还蛋白相互作用蛋白对脓毒症大鼠急性肺损伤的保护作用

目的探讨微RNA-204(miR-204)靶向硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)对脓毒症大鼠急性肺损伤的保护作用。方法选择无特定病原体级雄性Sprague Dawley大鼠48只,随机分为假手术组、模型组、阴性对照(NC)组、miR-204过表达(miR-204 agomir)组,每组12只。模型组、NC组、miR-204 agomir组大鼠通过盲肠结扎穿刺法建立脓毒症模型,假手术组大鼠仅开腹不做盲肠结扎及穿孔;脓毒症模型建立后,NC组、miR-204 agomir组大鼠分别通过尾静脉注射2μL agomir NC和2μL miR-204 agomir,模型组和假手术组大鼠注射等体积的生理盐水。于造模24 h后,断颈处死各组大鼠,取肺组织,采用光学显微镜观察各组大鼠肺组织病理变化,采用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测各组大鼠肺组织中miR-204、TXNIP及硫氧还蛋白(Trx)mRNA表达水平;取HEK-293T细胞,采用双荧光素酶报告基因法检测试剂盒检测miR-204和TXNIP 3′UTR非编码区(3′UTR)靶向关系;Western blot法检测各组大鼠肺组织中TXNIP及Trx蛋白表达水平;酶联免疫吸附测定法检测各组大鼠肺组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平。结果假手术组大鼠肺泡形态结构正常;模型组和NC组大鼠肺泡壁增厚,肺组织中出现大量炎症细胞浸润;与模型组和NC组比较,miR-204 agomir组大鼠肺组织炎症细胞浸润减少,肺泡损伤明显改善。模型组和NC组大鼠肺组织miR-204相对表达量显著低于假手术组(P<0.05);模型组与NC组大鼠肺组织中miR-204相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05);miR-204 agomir组大鼠肺组织中miR-204相对表达量显著高于假手术组、模型组和NC组(P<0.05)。模型组和NC组大鼠肺组织TXNIP mRNA和蛋白相对表达量显著高于假手术组(P<0.05);模型组与NC组大鼠肺组织TXNIP mRNA和蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05);miR-204 agomir组大鼠肺组织TXNIP mRNA和蛋白相对表达量显著低于假手术组、模型组和NC组(P<0.05)。miR-204 agomir+TXNIP 3′UTR-野生型组荧光素酶活性显著低于阴性对照+TXNIP 3′UTR-野生型组(P<0.05);miR-204 agomir+TXNIP 3′UTR-突变型组与阴性对照+TXNIP 3′UTR-突变型组荧光素酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组、NC组和miR-204 agomir组大鼠肺组织Trx mRNA和蛋白相对表达量显著低于假手术组(P<0.05);miR-204 agomir组大鼠肺组织Trx mRNA和蛋白相对表达量显著高于模型组和NC组(P<0.05);模型组与NC组大鼠肺组织中Trx mRNA和蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组、NC组和miR-204 agomir组大鼠肺组织中TNF-α、IL-6和MDA水平显著高于假手术组,SOD水平显著低于假手术组(P<0.05);miR-204 agomir组大鼠肺组织中TNF-α、IL-6和MDA水平显著低于模型组和NC组,SOD水平显著高于模型组和NC组(P<0.05);模型组与NC组大鼠肺组织中TNF-α、IL-6、MDA和SOD水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论miR-204可通过靶向TXNIP抑制脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织炎症反应和氧化应激,其机制可能与Trx表达升高有关。

微RNA-204-5p靶向调控SOX4缓解髓核细胞退变和衰老

目的:探讨微RNA-204-5p(miR-204-5p)对椎间盘退行性变的生物学效应和作用机制。方法:收集2022年6—12月因脊柱疾病进行手术治疗的患者术中切除的废弃椎间盘组织。首先构建miR-204-5p的地高辛生物素探针,对正常与退行性变椎间盘髓核组织切片进行染色,并观察miR-204-5p的表达;然后采用5 ng/mL白细胞介素1β(IL-1β)分别刺激正常椎间盘髓核细胞0、6、12、24、48 h,构建不同退变程度髓核细胞模型,随后采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-204-5p与miR-204-3p的表达;进一步利用生物信息学数据库预测miR-204-5p与SOX4潜在结合序列,并构建双荧光素酶报告基因质粒验证该位点;使用miR-204-5p过表达模拟物(miR-204-5p mimics)和mimics control对原代退行性变椎间盘髓核细胞进行转染,并采用qRT-PCR和蛋白质印迹法分别检测细胞外基质(ECM)代谢标志物表达水平,采用β-半乳糖苷酶染色检测退行性变椎间盘髓核细胞衰老水平。结果:RNA-地高辛生物素探针染色显示,miR-204-5p在退行性变椎间盘髓核组织中表达较正常椎间盘髓核组织显著下调(91.7%vs.13.7%);在IL-1β诱导髓核细胞退行性变模型中,刺激12 h内miR-204-5p表达显著上调,而刺激12 h后其表达显著下调(P<0.05);对SW1353细胞系共转染含SOX43'非翻译区(3'UTR)野生型(WT)报告序列质粒与miR-204-5p mimics的报告萤光素酶活性显著低于对照组(P<0.05),但是在SOX43'UTR序列突变后,该差异被中和;过表达miR-204-5p后,退行性变椎间盘髓核细胞在RNA和蛋白质水平上ECM合成代谢相关葡萄聚糖(Aggrecan)表达显著上调,而潜在靶基因SOX4与基质金属蛋白酶3(MMP3)表达均显著下调(P均<0.01)。且β-半乳糖苷酶染色结果显示,过表达miR-204-5p后退行性变椎间盘髓核细胞衰老程度缓解。结论:miR-204-5p可能通过靶向抑制SOX4的转录后水平而缓解髓核细胞衰老,并维持ECM稳态,有望作为椎间盘退行性变治疗的新靶点。

微RNA-204通过调控埃兹蛋白表达影响宫颈癌Hela细胞的侵袭性

目的 探讨微RNA-204（miR-204）对宫颈癌Hela细胞侵袭性的影响及其机制.方法 将Hela细胞分为4组,阴性对照组加入随机序列对照物,miR-204模拟物组和miR-204抑制物组分别加入miR-204模拟物（agomir-204）和miR-204抑制物（antagomir-204）,空白对照组不进行处理.72 h后收集细胞,荧光定量实时PCR检测各组细胞miR-204水平,免疫印迹法检测各组细胞埃兹蛋白（EZR）表达.使用在线工具预测EZR基因3′非翻译区（3′UTR）序列中的miR-204靶向序列.将EZR基因上的miR-204靶向序列克隆到双荧光素酶报告载体上,载体分别与agomir-204（miR-204模拟物组）、antagomir-204（miR-204抑制物组）、随机序列对照物（阴性对照组）共转染Hela细胞,设空白对照组不进行转染,检测各组细胞双荧光素酶相对活性比值.Transwell法检测miR-204对Hela细胞侵袭性的影响.结果 荧光定量实时PCR显示,与空白对照组和阴性对照组比较,miR-204模拟物组Hela细胞miR-204表达显著增加,而miR-204抑制物组miR-204表达显著降低（均P〈0.05）.免疫印迹显示,随着miR-204表达增加EZR蛋白表达下调.预测软件发现EZR基因3′UTR序列上1个miR-204结合靶点,测序验证显示靶点序列已经正确克隆入双荧光素酶报告载体.双荧光素酶报告基因系统检测显示,与空白对照组和阴性对照组比较,miR-204模拟物组双荧光素酶相对活性比值显著下调,而miR-204抑制物组双荧光素酶相对活性比值显著上调（均P〈0.05）.Transwell法检测显示,与空白对照组和阴性对照组比较,miR-204模拟物组穿膜细胞数显著减少,而miR-204抑制物组穿膜细胞数显著增加.结论 miR-204能够通过作用于EZR基因的靶点序列负调控宫颈癌Hela细胞EZR蛋白表达,并抑制细胞的侵袭性.

LncRNA MIAT靶向miR-204对氧糖剥夺/复氧诱导PC12细胞损伤的保护作用

目的探究氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株PC12细胞损伤的分子调控机制,以期为临床上靶向治疗缺血性卒中提供新的思路。方法该研究于2021年6—12月进行,购买PC12细胞后对其进行OGD/R诱导,在诱导后的细胞中分别转染长链非编码RNA(LncRNA)心肌梗死相关转录本(MIAT)过表达载体及微RNA-204模拟物(miR-204 mimic),以对应的载体阴性对照(pcDNA3.1-NC)或模拟物阴性对照(mimic-NC)作为阴性对照,以未转染PC12细胞作为空白对照。使用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测LncRNA MIAT与miR-204的表达;CCK-8与流式细胞术分别检测细胞活力与凋亡;Elisa试剂盒检测炎性因子白细胞介素(IL)-6、IL-1β,抗炎性因子IL-10的表达。RNA下拉检测MIAT在miR-204上的富集;通过starbase预测LncRNA MIAT与miR-204的结合位点,随后采取双萤光素酶报告实验验证LncRNA MIAT与miR-204的靶向结合。结果与空白对照组[1.011±0.113,1.001±0.002,1.473±0.224,(8.16±0.84)%,(96.75±6.73)ng/L,(46.28±2.84)ng/L,(39.45±1.45)ng/L]相比,OGD/R组细胞中LncRNA MIAT表达显著降低(0.362±0.085),miR-204表达显著升高(2.234±0.306),细胞活力显著降低0.806±0.115,凋亡率显著增加[(28.25±4.13)%];炎性因子IL-6[(525.19±15.62)ng/L]、IL-1β[(292.54±19.54)ng/L]的表达显著增加,抗炎性因子IL-10的表达(14.33±2.36)ng/L显著降低(均P<0.01)。与阴性对照组相比[2.198±0.324,0.811±0.117,(8.16±0.84)%,(96.75±6.73)ng/L,(46.28±2.84)ng/L,(39.45±1.45)ng/L],MIAT过表达后OGD/R细胞中miR-204表达显著降低1.373±0.268,细胞活力显著升高1.137±0.116,凋亡率显著降低(28.25±4.13)%;炎性因子IL-6(525.19±15.62)ng/L、IL-1β(292.54±19.54)ng/L的表达显著降低,抗炎性因子IL-10(14.33±2.36)ng/L的表达显著升高(均P<0.01)。与MIAT过表达的OGD/R细胞相比,MIAT过表达载体和miR-204模型物共转染的OGD/R细胞中miR-204表达显著升高,细胞活力显著降低,凋亡率显著升高;炎性因子IL-6、IL-1β的表达显著升高,抗炎性因子IL-10的表达显著降低(均P<0.01)。结论在OGD/R诱导的PC12细胞中,低表达LncRNA MIAT促进miR-204表达上调,最终促进细胞损伤。

miRNA-204靶向LC3B在AngⅡ诱导的心肌肥厚中的作用

目的探讨体外血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导原代大鼠心肌细胞肥大中miRNA-204靶向自噬微管相关蛋白轻链3B(LC3B)表达的作用。方法以原代大鼠心肌细胞为研究对象,根据不同的处理分为对照组、AngⅡ组、联合1组(心肌细胞给予人AngⅡ刺激同时感染阴性对照慢病毒载体)和联合2组(心肌细胞给予人AngⅡ刺激同时感染miRNA-204慢病毒过表达载体)。各组在干预治疗后48~72h,行激光共聚焦检测心肌细胞肥大变化,荧光定量PCR探测miRNA-204的表达,蛋白印迹测定LC3B的表达;同时,双荧光素酶活性基因报告验证miRNA-204的靶基因。结果与对照组比较,AngⅡ组心肌细胞相对表面积明显增大,同时LC3B蛋白表达明显升高、miRNA-204表达上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。与联合1组比较,联合2组能明显减少LC3B蛋白表达,同时使心肌细胞相对表面积缩小(P<0.05)。进一步的荧光素酶活性报告基因实验结果提示,miRNA-204能结合LC3B的非翻译区的野生型片段减少荧光素霉活性(P<0.05);但不能结合其突变型片段灭活荧光素酶活性(P>0.05)。结论 miRNA-204能抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大,其作用是通过靶向LC3B的表达实现的。