加权基因共表达网络分析微RNA-92b-3p在食管鳞状细胞癌中的作用及机制

目的通过加权基因共表达网络分析(WGCNA)对食管鳞状细胞癌(ESCC)发展相关基因进行筛选,并通过实验验证。方法以基因芯片平台(GPL)570、GPL571、GPL96/97或GPL14613为基础,从基因表达数据库(GEO)中下载ESCC基因表达谱数据集;将所得差异基因结合癌症基因组图谱(TCGA)的81例ESCC患者的基因表达谱数据和临床信息,通过WGCNA方法构建由mRNA和miRNA组成的共表达模块。实时荧光定量PCR检测ESCC癌组织和癌旁组织中miRNA表达,免疫组织化学法检测Kruppel样因子4(KLF4)和细胞桥粒胶蛋白2(DSC2)的表达;转染ESCC细胞系ECA-109 miRNA模拟物后,流式细胞术检测细胞周期,Transwell小室和划痕实验检测细胞侵袭和迁移能力,激光共聚焦显微镜和蛋白质印迹法检测KLF4和DSC2的表达,双荧光素酶报告基因系统验证靶基因。统计学分析采用t检验、秩和检验、卡方检验和Pearson相关分析。结果共筛选出4 023个差异蛋白编码基因(DEG)和328个差异表达微RNA(DEM);通过WGCNA共构建出11个基因模块。其中brown模块与肿瘤分级和T分期均呈负相关(r=-0.340、-0.268,P=0.002、0.016),has-mir-92b及其潜在靶基因KLF4和DSC2同时包含于brown模块。实时荧光定量PCR显示,ESCC组织中miRNA-92b-3p(has-miR-92b成熟体)表达水平高于癌旁组织[3.052(1.652, 5.371)比0.985(0.558, 2.032)],差异有统计学意义(Z=-4.021,P<0.01)。免疫组织化学显示KLF4和DSC2在ESCC组织中的阳性率分别为43.3%(13/30)和20.0%(6/30),分别低于对应癌旁组织的70.0%(21/30)和63.3%(19/30),差异均有统计学意义(χ^2=4.344、11.589,P均<0.05)。转染miRNA-92b-3p模拟物后,ECA-109细胞G0/G1期缩短[(63.71±2.83)%比(54.62±4.00)%],S期和G2/M期均延长[分别为(31.81±2.88)%比(41.20±2.87)%,(3.87±1.75)%比(8.10±1.71)%],差异均有统计学意义(t=3.215、4.000、2.998,P=0.032、0.016、0.040)。细胞侵袭和迁移能力显著增强[分别为79.67±27.54比280.33±46.18,(69.72±3.91)%比(84.90±5.25)%],差异均有统计学意义(t=6.465、4.019,P=0.003、0.016)。蛋白质印迹法检测结果显示,与转染对照模拟物组比较,转染miRNA-92b-3p模拟物组DSC2和KLF4表达水平均下降(分别为1.00±0.23比0.42±0.03,1.00±0.20比0.55±0.21),差异均有统计学意义(t=4.470、5.493,P=0.042、0.032)。双荧光素报告酶系统证实miRNA-92b-3p可以直接结合DSC2和KLF4。结论WGCNA是一种有效的系统生物学方法,通过此方法可识别出新的促癌基因miRNA-92b-3p。