猪德尔塔病毒H223株的分离鉴定和持续传代及N基因遗传进化分析

从江西某猪场疑似病毒性腹泻的发病猪采集部分小肠内容物样品,应用RT-PCR检测,在排除猪传染性胃肠炎病毒(PEDV)和猪流行性腹泻病毒(TGEV)感染后,检测结果为猪德尔塔病毒(丁型冠状病毒,PDCoV)阳性,将处理后的肠道组织研磨液在ST细胞上进行连续盲传,传至第9代观察到细胞病变(CPE),且普通PCR检测为阳性,目前已连续传代至65代。针对PDCoV编码的N基因设计一对特异性引物,成功克隆了该病毒的N段基因,序列长度为1248bp。使用DNAStar和MEGA7软件对扩增该片段的测序结果进行遗传进化分析,序列同源性分析确证该毒株属于PDCoV,命名为H223。

德尔塔病毒疫情期间急诊患者的特点及救治策略

目的分析德尔塔病毒疫情暴发期间医院急诊患者的特点及医院救治策略。方法通过医院病历系统调取2021年8月、2020年8月、2019年8月的急诊就诊患者病历信息以及医院缓冲病房收治的患者病历信息,分析急诊就诊患者的特点,评价医院救治策略的效果。结果2019年8月就诊患者数量总计19490例次,其中男性10182例次,女性9308例次。2020年8月就诊患者数量总计16872例次,其中男性8903例次,女性7969例次。2021年8月就诊患者数量总计12263例次,其中男性6544例次,女性5719例次。2021年8月急诊就诊患者的性别分布与2019年8月以及2020年8月比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。2021年8月急诊外科就诊原因与2019年8月以及2020年8月比较,因外伤就诊比率下降,因泌尿系结石就诊比率增高,差异有统计学意义(P<0.05)。设立的缓冲病房在2021年8月期间共收治患者277例,所有患者连续3次核酸检测阴性后安全转入专科病房。结论2021年8月德尔塔病毒疫情暴发期间,急诊各科室就诊患者数量较2019年、2020年同期均减少。医院在急诊前端要严格遵守规范的预检分诊流程,在急诊后端建立缓冲病房,将新型冠状病毒肺炎的院内感染风险降至最低。

猪德尔塔冠状病毒病流行现状与防控策略

猪德尔塔冠状病毒病属于我国二类传染病,是由猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)引起的,2007年,科研人员在亚洲豹猫和一些鸟类样本中检测到了该病毒,这表明该病毒可以感染哺乳动物及鸟类,尤其是规模化养猪场最易造成该病毒的广泛传播,一旦感染,仔猪成活率和生长速度都会受到直接影响,可引起5-15日龄哺乳仔猪腹泻、呕吐、脱水、食欲不振等临床症状,导致机体迅速脱水后脏器衰竭而亡,给猪场带来一定的经济损失。

稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的Vero细胞系的建立及鉴定

为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)核衣壳(N)蛋白的非洲绿猴肾(Vero)细胞系,本研究将PDCoV-N基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒pLVX-PDCoV-N,利用慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,慢病毒感染Vero细胞,嘌呤霉素加压筛选目的细胞。RT-PCR扩增N基因和测序表明细胞系基因组中存在N蛋白编码序列,Western blot和IFA试验表明N蛋白可在细胞系中稳定表达。应用制备的细胞系对临床PDCoV阳性血清样品进行检测,与ELISA检测结果符合率达到100%。本研究成功建立了稳定表达PDCoV N蛋白的Vero细胞系,为PDCoV N蛋白生物学特性研究和PDCoV的临床检测、流行病学调查奠定了基础。

基于转录组测序技术分析猪德尔塔冠状病毒感染ST细胞机制的初步研究

猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)感染可导致仔猪出现水样腹泻和死亡,严重危害猪的健康。为研究PDCo V感染引起宿主细胞基因转录水平的变化及初步研究其感染机制,本研究提取PDCo V感染组和不感染该病毒的阴性对照组ST细胞样品总RNA,构建二者的cDNA文库后采用Illumina HiSeq 6000高通量测序平台进行转录组测序(RNA-Seq)。结果显示,所有样品的测序错误率均≤0.03%;Q20/%和Q30/%分别达98%和94%以上;GC含量在51.09%~55.15%;相关性分析结果显示,阴性对照组及感染组细胞样品各组内的R值均>0.9,上述结果表明测序数据可靠,可用于后续转录组学数据分析。采用ggplot2软件分析两组细胞组内测序结果的相关性,并以相关系数R>0.9判定各组内测序数据的准确性;采用DESeq2软件并以P<0.05和log2(Fold change)>1为条件筛选两组细胞中转录显著差异基因;采用ClusterProfiler R软件对转录显著差异基因进行GO功能和KEGG信号通路的富集分析;采用Pheatmap软件对各组ST细胞中与免疫反应相关的转录显著差异基因进行聚类分析;随机选择9个转录显著差异基因经RT-q PCR验证RNA-Seq的结果。筛选结果显示,与阴性对照组细胞相比,共筛选出5719个转录显著差异基因,其中3573个转录显著上调基因,2146个转录显著下调基因。GO功能和KEGG信号通路富集分析结果显示,转录显著上调的基因与ST细胞的免疫应答、防御反应等功能有关;转录显著下调的基因与细胞的氧化还原和新陈代谢等功能有关;转录显著上调的基因参与细胞因子受体互作、天然免疫反应相关、肿瘤坏死因子等的信号通路;转录显著下调的基因与细胞物质代谢信号通路有关,包括氨基酸代谢、脂代谢、乙醛酸和二羧酸代谢等信号通路。与免疫反应相关的转录显著差异基因的聚类分析结果显示,与阴性对照组细胞相比,PDCo V感染的ST细胞中白细胞介素基因(IL-1R1、1L-6、IL-10RB、IL-15和IL-12A等)、抗病毒基因(MX1、OAS)和干扰素基因(INFAR1、IFN-ALPHAOMEGA)的转录水平均显著上调。上述结果表明PDCo V感染后,ST细胞的天然免疫反应被激活,但细胞的代谢反应降低,这更有利于减弱病毒在ST细胞中的复制,起到一定的抗病毒效果。9个转录显著差异基因的RT-q PCR结果与RNA-seq结果基本一致,表明转录组测序数据可靠。本研究为进一步解析PDCo V的感染机制提供参考依据。

猪德尔塔冠状病毒致病机理研究进展

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是流行于猪群中的一种新发肠道冠状病毒,能引起猪腹泻、呕吐、脱水甚至死亡,给养猪业带来巨大威胁。PDCoV可在猪、禽类和牛体内复制,甚至在人体血浆样品中检出,具有潜在的公共安全问题,存在引发大流行的威胁,深入开展PDCoV的致病机理研究对该病的防控有重要意义。本文从其入侵宿主细胞以拮抗干扰素反应、诱导细胞凋亡、调控细胞自噬、抑制细胞焦亡途径来逃避宿主免疫应答,以及其他影响PDCoV复制的分子机制方面对其致病机理进行总结,为后续科学研究和有效防治提供借鉴。

猪德尔塔冠状病毒N蛋白单克隆抗体2D7的制备与生物学特性鉴定

为获得猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白的特异性单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并鉴定其生物学特性,本研究利用RT-PCR方法扩增PDCoV-N基因,构建表达质粒,转化BL21感受态细胞获得重组大肠杆菌,诱导表达后获得PDCoV-N重组蛋白,将其进行纯化后再免疫小鼠,制备针对PDCoV-N蛋白的mAb,并进行了抗体的效价测定、免疫荧光(IFA)、Western blot、亚类的鉴定、mAb特异性的鉴定。结果,成功构建pColdⅡ-PDCoV-N重组原核表达质粒,SDS-PAGE显示重组N蛋白成功表达,分子质量约为38 kDa;经小鼠免疫、细胞融合、亚克隆筛选获得1株分泌PDCoV-N蛋白抗体的阳性杂交瘤细胞株;制备的腹水经间接ELISA方法测定抗体的效价为2.048×10^(6)。IFA、Western blot试验表明该mAb可以与PDCoV-N蛋白及全病毒特异性结合,亚类鉴定其亚型为IgG1,轻链为κ链。该mAb只与PDCoV反应,而与其他猪肠道病毒无交叉反应,表明本研究制备的mAb具有良好的特异性。本研究成功制备了PDCoV-N蛋白的mAb,为进一步研究PDCoV的生物学特性和诊断试剂的开发提供技术支持。

基于重组核衣壳蛋白的猪德尔塔冠状病毒间接ELISA检测方法的建立

目的:建立一种关于猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus, PDCoV)抗体的检测方法。方法:对猪德尔塔冠状病毒的核衣壳蛋白(N)进行原核表达,通过Western Blot、SDS-PAGE等方法,对重组蛋白进行鉴定;在获得正确表达的重组蛋白后,以此为抗原,对ELISA反应条件进行优化,并对其特异性、敏感性、重复性进行测试,最终建立ELISA检测方法,并对临床样品进行检测。结果:优化后的抗原包被浓度为2μg/孔,37℃孵育1 h;1%BSA 37℃封闭1 h;一抗稀释最佳浓度为1∶1 600,孵育时间为1 h;酶标二抗最佳孵育时间为60 min。重组蛋白能与猪德尔塔冠状病毒血清发生特异性反应,所建立的检测方法具有优良的敏感性、特异性、重复性。结论:本研究建立了一种针对猪德尔塔冠状病毒的间接ELISA检测方法,为猪德尔塔冠状病毒的抗体水平检测及疾病的防控提供了一种有效的方法。

猪德尔塔冠状病毒N蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】构建猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)核衣壳(N)蛋白原核表达系统并制备多克隆抗体,为新型疫苗、诊断试剂研发及PDCoV致病机制的深入研究提供基础。【方法】提取PDCoV HeN17株RNA,经RT-PCR扩增,将N基因克隆至pGEX-6P-1载体构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行IPTG诱导表达。利用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化重组蛋白,采用3C蛋白酶去除标签。以纯化后的N蛋白为免疫原免疫3月龄新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗体效价,并通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)和免疫沉淀(IP)试验对其进行鉴定。【结果】成功构建原核表达载体pGEX-6p-1-PDCoV-N,获得的PDCoV-N-GST重组蛋白主要以可溶性形式表达,大小约69 kD,经去除GST标签可获得单一目的蛋白条带,经测定蛋白浓度为12.6 mg/mL,获得的PDCoV-N蛋白能与PDCoV阳性血清反应产生单一特异性条带。制备的兔源抗PDCoV-N多克隆抗体效价达1∶4096000,可特异性识别pCAGGS-Flag-N转染HEK-293T细胞中表达的Flag-N蛋白和PDCoV感染LLC-PK1细胞中表达的PDCoV-N蛋白,且能检测到PDCoV-N真核表达载体pCAGGS-Flag-N转染HEK-293T细胞中表达的PDCoV-N蛋白。【结论】成功构建高效PDCoV-N原核表达系统,获得纯度好、浓度高且免疫原性佳的PDCoV-N蛋白,制备的兔源抗PDCoV-N多克隆抗体效价高,具有较强亲和力和特异性,可用于Western blotting、IFA和IP检测。

一例猪德尔塔冠状病毒感染的诊治报告

2022年10月8日,安徽省来安县某猪场产房中的仔猪发生严重腹泻,发病率达40%,死亡率为13%。为探明腹泻症状的原因,笔者通过临床症状观察、剖检、病原学检测及基因测序等方法,确诊该猪群的腹泻由猪德尔塔冠状病毒感染引起,并结合临床情况提出了针对性的防治方案。

一例猪德尔塔冠状病毒感染的诊治

猪德尔塔冠状病毒是在养猪生产中不常见的流行病,临床上常常以严重呕吐、腹泻、病死率高为特征,养殖场(户)很容易把此病误诊为猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒引起的传染性疾病,导致治疗措施与防治措施一系列错误,耽误了最佳治疗时间,引起大量猪只死亡,特别是仔猪死亡率更高,因为不常发生,此病防疫工作往往也被忽视,若造成地方性流行,会给当地养殖业造成不可估量的经济损失。

猪德尔塔冠状病毒病的诊断与防治

猪德尔塔冠状病毒属于较为严重的猪类传染病,可感染不同生长阶段的猪群,其中以5~15日龄哺乳仔猪最易感,主要症状包括高热、咳嗽、打喷嚏、流涕、呼吸困难、腹泻等,且哺乳仔猪感染后死亡率高达30%~40%,而成年猪、生长猪及生产母猪症状表现轻微,一般可不治而愈,猪德尔塔冠状病毒的出现给世界养猪业造成了巨大的经济损失。研究显示,猪德尔塔冠状病毒与α-冠状病毒具有相似的临床症状和病理变化,感染后可引起猪只的水样腹泻、脱水和死亡。据此,本文结合猪德尔塔冠状病毒病诊断进行探讨,并结合实际提出相应的防治措施,旨在为生猪养殖产业安全发展提供参考。

猪德尔塔冠状病毒RT-nPCR检测方法的建立与N基因变异分析

建立一种基于猪德尔塔冠状病毒(PDCo V)N基因的RT-n PCR检测方法,对陕西省猪群PDCo V感染情况进行流行病学调查,分析PDCo V流行毒株N基因变异情况。通过病毒分离、检测引物设计、反应体系与条件优化、灵敏性试验和特异性试验,建立了PDCo V RT-nPCR检测方法,并对N基因片段进行序列分析。结果表明:建立的RT-n PCR方法能够扩增出303 bp的N基因目的片段,检测单链c DNA的极限为2.0194×10^(-3)ng·μL^(-1),该方法检测PEDV、TGEV、PRo V、CSFV与PRRSV均无交叉反应,特异性良好;陕西省猪场184份样品检测结果显示,PDCo V阳性率为6.52%(12/184);N基因序列分析发现,获得的HY2019、QLS2020的N基因片段同源性为99.0%,提示可能为同一来源;进化树分析发现,HY2019、QLS2020与我国四川株SCNC201705、Sichuan2017、Sichuan2019同处于一个小的进化分支上,且均存在168~179位“TGTCTGTCTCTA”共12个核苷酸缺失,推测陕西株与四川株高度同源,可能起源于早期四川毒株。

猪德尔塔冠状病毒CHN/20GXNN-1/2020分离鉴定及遗传进化分析

为了解广西地区猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的流行特点,对该地区PDCoV进行分离鉴定及遗传进化分析。将20份检测为PDCoV阳性的样品接种于LLC-PK细胞,经RT-PCR及IFA鉴定,获得1株PDCoV,命名为CHN/20GXNN-1/2020。通过TCID50和RT-qPCR测定,该毒株的病毒滴度及病毒载量在连续传代过程中逐步增高。其S基因核苷酸在153 bp-155 bp位置存在3 bp的缺失,氨基酸有23个位点发生突变。S基因同源性分析结果表明,PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020与中国多数流行毒株的亲缘关系更近。结果表明,分离鉴定出1株新的PDCoV毒株,为冠状病毒生物学特性研究提供了材料,也为进一步开展病毒致病性研究及疫苗研制奠定了基础。

基于网络药理学和分子对接技术探讨宣肺化浊汤防治新冠肺炎德尔塔变异病毒的作用机制

目的研究宣肺化浊汤治疗德尔塔变异型新冠肺炎轻症的机制。方法在线查询TCMSP、PubChem、SwissTargetPrediction数据库获取蜜麻黄、连翘、前胡、法半夏、麸炒苍术、广藿香、羌活、酒大黄、陈皮、黄芩10味中药的主要活性成分,利用GeneCards、OMIM等数据库获取德尔塔病毒作用靶点。Venny网站在线获取药物与疾病靶点交集,使用STRING数据库构建蛋白互作网络,并筛选核心靶点,通过DAVID数据库对核心靶点进行GO和KEGG通路富集分析,借助Cytoscape3.8.2软件将主要活性成分、关键靶点和信号通路之间的关系进行可视化处理。最后通过Autodocking vina v1.2.0将核心成分和核心靶点进行分子对接验证。结果宣肺化浊汤中含主要活性成分39个,对应靶点53个;酒大黄、陈皮、黄芩、广藿香、连翘、羌活为宣肺化浊汤的关键作用药物;naringenin、onjixanthone I、bicuculline、acacetin、baicalein、pachypodol为核心活性成分;JAK2、KIT、MMP-9、PIK3R1、KDR、GSK3B等靶点为蛋白互作网络中的核心靶点,各核心靶点和核心活性成分具有稳定的结合能。结论宣肺化浊汤通过多成分作用多靶点,调节多条信号通路宣肺透邪、清热化浊,发挥对新冠肺炎德尔塔变异病毒的治疗作用。

猪德尔塔冠状病毒的诊断与防治措施

猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新型肠道病毒,该病毒原属于冠状病毒科重要成员,可引起仔猪腹泻,造成高死亡率,给养猪业造成巨大的经济损失。目前暂无针对该病的有效疫苗或药物,对于该病的防控主要以提高生物安全措施为主。本文主要综述PDCoV的流行病学特征、临床症状、诊断方法及防控措施等,旨在为该病的防控提供科学参考。

猪德尔塔冠状病毒病的诊断与防控

一、流行现状猪德尔塔冠状病毒病是由猪德尔塔冠状病毒引起的一种以水样腹泻、呕吐、脱水、食欲不振为临床症状的肠道传染性疾病。临床上猪德尔塔冠状病毒常与其他病毒混合感染,给肠道病毒的防控带来了更大的挑战。

猪德尔塔冠状病毒的流行、传播及防控策略

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是德尔塔冠状病毒属的成员,是一种猪肠道致病性冠状病毒,可引起新生仔猪急性腹泻、呕吐和脱水。PDCoV最初于2012年在香港地区进行的一项分子监测研究中被发现,后来于2014年在美国俄亥俄州腹泻猪群中出现。随后,疫情在全球蔓延,目前,已在韩国、中国内地、泰国、越南和老挝等多国的仔猪粪便样本中检测到该病毒。

猪德尔塔冠状病毒病原学特征与致病机制研究进展

猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)作为最近几年新暴发的冠状病毒之一,虽然检出率和致死率低于猪流行性腹泻病毒(PEDV),但感染PDCoV的猪场越来越多,对养殖业造成了严重的经济损失。PDCoV的结构蛋白可能起到免疫调节功能,但目前针对PDCoV病毒蛋白如何调控宿主功能,利用宿主机制逃避免疫反应利于自身存活和增殖的研究较少,对PDCoV各结构蛋白在病毒复制和转录中的具体功能尚无深入研究。文章对PDCoV及其致病机制的研究进展进行综述,以期为基于免疫调节病毒蛋白开发疫苗、通过病毒蛋白直接防控疾病提供参考。

一起由德尔塔病毒株引起的新型冠状病毒肺炎聚集性疫情分析

目的 分析一起由德尔塔病毒株引起的新型冠状病毒肺炎(新冠肺炎)聚集性疫情及传播链,为进一步做好防控工作提供依据。方法 对淮安市一起新冠肺炎聚集性疫情的流行病学调查资料、临床特征、新冠疫苗接种史、传播链进行描述性分析。结果 该起疫情发病时间为2021年7月28—31日,共报告新冠肺炎确诊病例12例,男女性别比为2∶1,年龄中位数为55.50岁;均从核酸筛查中发现,普通型11例,轻型1例;发病初期症状不明显者占66.67%,12例病例均接种了新冠疫苗,完成2针次9例(75.00%)。二代病例潜伏期为2 d。密切接触者326人,发病2例,总续发率为0.61%。1号病例密切接触者107人,发病1例,续发率为0.93%;3号病例密切接触者115人,发病1例,续发率为0.87%。本次病例1、2、3号的病毒基因测序结果显示为德尔塔毒株,病毒序列和南京市某报告病例一致。结论 本次新冠肺炎聚集性疫情病毒序列为德尔塔毒株,近距离接触传播为其主要传播方式。经采取相关管控措施,有效遏制了疫情传播扩散。