扶芳藤益心方对缺血再灌注损伤后心内膜微血管内皮细胞的保护机制

目的 :研究扶芳藤益心方对人心内膜微血管内皮细胞(HUMCE)缺血再灌注损伤(IR)后的保护机制。方法 :体外培养HUMCE至第3代,将HUMCE分为造模组:扶芳藤益心方组(FY)、益心方组(Y)、卡托普利高(CAP1)、中(CAP2)、低(CAP3)浓度组、模型对照组和非造模组(N)。造模组进行缺氧/复氧(H/R)处理,非造模组不做缺氧/复氧处理,两组均添加相应的含药血清干预培养24 h后,采用硝酸还原酶法测定NO、NOS的含量,蛋白印迹法测定内皮素(ET-1)、内皮素转化酶(ECE)蛋白表达率,荧光定量测定ET-m RNA、i NOS-m RNA基因表达水平。结果:与非造模组对照,造模对照组细胞NO、NOS含量及i NOS-m RNA基因表达降低,ET-1、ECE蛋白表达及ET-m RNA基因表达明显增加(P<0.05)。与模型对照组比较:扶芳藤益心方组、益心方组NO、NOS含量和i NOS-m RNA基因表达升高,ET-1、ECE蛋白表达及ET-m RNA基因表达明显降低(P<0.05)。与扶芳藤益心方组比较:益心方组NO、NOS含量及i NOS-m RNA基因表达均明显降低(P<0.05),ET-1、ECE蛋白表达及ET-m RNA基因表达均明显增加(P<0.05);CAP1组NO、NOS含量及i NOS-m RNA基因表达均升高(P<0.05),ET-1、ECE蛋白表达及ET-m RNA基因表达均降低(P<0.05);CAP2组、CAP3组的NO含量及i NOS-m RNA基因表达均降低(P<0.05),ET-1、ECE蛋白表达及ET-m RNA基因表达均升高(P<0.05)。与益心方组比较:CAP1组、CAP2组、CAP3组的NO、NOS含量均升高(P<0.05),ET-1、ECE蛋白表达及ET-m RNA基因表达均降低(P<0.05),CAP3组的i NOS-m RNA基因表达降低(P<0.05);CAP1组、CAP2组的i NOS-m RNA基因表达均升高(P<0.05)。结论 :扶芳藤益心方通过下调人心内膜微血管内皮细胞缺血再灌注后的ET-1、ECE蛋白表达及ET-m RNA基因表达,导致内皮细胞缺血再灌注后ET-1分泌降低,上调i NOS-m RNA基因表达,提高内皮细胞NO、NOS的分泌,从而维持ET/NO平衡关系防止内皮细胞在缺血再灌注后的损伤。

壮药扶芳藤对缺氧/复氧后人心内膜微血管内皮细胞VEGFR-2、VEGF的影响

目的:研究壮药扶芳藤对人心内膜微血管内皮细胞缺氧/复氧(H/R)后VEGFR-2、VEGF表达的影响。方法:取第3代HUMCE随机分为正常组(N)和造模组:扶芳藤组(F)、卡托普利低浓度组(Cap1组)、卡托普利中浓度组(Cap2组)、卡托普利高浓度组(Cap3组)、模型对照组(H/R)。对造模组进行H/R损伤后,添加相应的含药血清干预培养24 h,正常组不做缺氧/复氧处理。采用MTT比色检测各组细胞吸光值及酶联反应吸附法(ELISA)检测其内VEGFR-2、VEGF含量,研究扶芳藤对人心内膜微血管内皮细胞(HUMCE)缺氧/复氧后保护作用的机制。结果:模型对照组较正常组VEGFR-2、VEGF水平明显增高。F组较正常组、Cap低浓度组、Cap中浓度组VEGFR-2、VEGF水平高。F组较模型对照组、CAP高浓度组VEGFR-2、VEGF水平低(P<0.05),有统计学意义。结论:壮药扶芳藤能提高人心内膜微血管内皮细胞中VEGFR-2、VEGF水平并相对下调缺氧/复氧后人心内膜微血管内皮细胞的VEGFR-2、VEGF水平,从而对缺氧人心内膜微血管内皮细胞功能起到保护作用,安全有效,值得临床推广。

扶芳藤益心方对缺氧/复氧后人心内膜微血管内皮细胞的增殖作用

目的:研究扶芳藤益心方对缺氧/复氧后人心内膜微血管内皮细胞(HUMCE)增殖的影响。方法:取体外培养的第4代HUMCE分为造模组:扶芳藤益心方组(FY)、益心方组(Y)、卡托普利高、中、低浓度组(10-2μmol/L、10-3μmol/L、10-4μmol/L)、对照组(H/R)和非造模组(N)。造模组行缺氧/复氧(H/R)处理,非造模组不做缺氧/复氧处理,两组均添加相应的含药血清干预培养24h后,通过MTT法测定各组OD值,流式细胞仪检测细胞Caspase-3阳性细胞数,酶联免疫法(ELISA)检测各组血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)、血管内皮生长因子(VEGF)的含量。结果:与造模组比较,非造模组OD值大(P<0.05),VEGFR-2、VEGF含量与Caspase-3阳性细胞数均高于造模组(P<0.05)。与对照组比较,扶芳藤益心方组OD值高(P<0.05);Caspase-3阳性细胞数升高9.87%(P<0.05);VEGFR-2、VEGF浓度升高(P<0.05)。与扶芳藤益心方组比较,益心方组、卡托普利中、低剂量组OD值低,卡托普利高剂量组OD值高(P<0.05);卡托普利低剂量组VEGFR-2、VEGF浓度低(P<0.05),卡托普利高、中剂量组均高于扶芳藤益心方组(P<0.05);益心方组、卡托普利中、低剂量组Caspase-3阳性细胞数分别较扶芳藤益心方组降低6.77%、2.49%、5.7%,卡托普利高剂量组升高4.39%(P<0.05)。结论:扶芳藤益心方可以提高内皮细胞在缺氧/复氧后的增殖活性,降低内皮细胞的凋亡率,优于益心方组、卡托普利低、中剂量组,且提高缺氧/复氧损伤后内皮细胞VEGFR-2、VEGF浓度,优于卡托普利低浓度组和益心方组,改善内皮功能。

温肾通络止痛方对小鼠H型骨微血管内皮细胞/骨髓间充质干细胞共培养体系的影响

背景:骨骼依赖血管与骨细胞之间的密切连接来维持完整性,骨骼处在生理低氧环境中,因此在低氧环境下研究血管生成与骨生成具有重要意义。目的:探究在低氧环境下温肾通络止痛方对H型骨微血管内皮细胞/骨髓间充质干细胞共培养体系的影响及相关机制。方法:运用酶消化法及流式分选技术,分选小鼠H型血管特异型骨微血管内皮细胞;应用骨髓贴壁法分离获取小鼠骨髓间充质干细胞;采用Transwell小室以及缺氧培养工作站建立两种细胞低氧共培养体系,使用50,100μg/m L质量浓度温肾通络止痛方冻干粉进行干预;通过划痕迁移实验与管形成实验评估共培养体系内H型骨微血管内皮细胞的成血管功能;通过碱性磷酸酶染色与茜素红染色评估共培养体系内骨髓间充质干细胞的成骨分化能力;使用Western Blotting与q-PCR检测共培养体系内H型骨微血管内皮细胞中PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白表达及mRNA表达。结果与结论:(1)与常氧组相比,低氧组H型骨微血管内皮细胞划痕迁移率及新生血管长度均显著升高(P<0.05),骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强(P<0.05);PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白、mRNA表达升高(P<0.05);(2)与低氧组相比,经不同质量浓度温肾通络止痛方干预后H型骨微血管内皮细胞划痕迁移率及新生血管长度进一步提高(P<0.05),骨髓间充质干细胞成骨分化能力更强(P<0.05),PDGF/PI3K/AKT信号轴相关分子的蛋白、mRNA表达也进一步升高(P<0.05)。结果表明:低氧条件下H型血管生成及骨生成可能与PDGF/PI3K/AKT信号轴有关,而温肾通络止痛方可能通过激活PDGF/PI3K/AKT信号轴促进“H型血管生成-骨生成”作用从而防治骨质疏松症。

常压高浓度氧对新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤与Nrf2/HO-1信号通路的影响分析

目的探究常压高浓度氧(NBO)对新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤及核因子E2相关因子2/血红素氧合酶-1(Nrf2/HO-1)信号通路的影响。方法取新生SD大鼠45只,采用随机数字表法分为常氧组、NBO组和NBO+Nrf2激活剂组,每组各15只。常氧组大鼠置于普通空气(21%氧气)中饲养,NBO组和NBO+Nrf2激活剂组大鼠置于90%常压氧气饲养,NBO+Nrf2激活剂组每日灌胃5 mg/kg Nrf2激动剂莱菔硫烷。测定脑组织伊文思蓝(EB)含量,采用酶联免疫法检测血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)含量,干湿重法检测脑组织含水量,HE染色和TUNEL染色观察脑组织病理变化,蛋白质印迹法检测海马组织Nrf2/HO-1信号通路蛋白表达,水迷宫检测大鼠认知功能。结果与常氧组比较,NBO组脑组织EB、VEGF、MMP-9含量及脑组织含水量升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组脑组织EB、VEGF、MMP-9含量及脑组织含水量降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。病理染色结果显示,常氧组大鼠神经细胞形态及结构完整,未见明显病理变化和细胞凋亡;NBO组神经细胞形态及结构不规则,出现明显的水肿和空泡,并伴有大量的凋亡细胞;NBO+Nrf2激活剂组脑组织病理损伤较NBO组明显减轻。与常氧组比较,NBO组脑组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组Nrf2、HO-1蛋白相对表达量升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与常氧组比较,NBO组第2~4天逃避潜伏期延长,穿越平台次数减少,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组第2~4天逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增多,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论NBO可诱导新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤,导致远期认知功能障碍,可能与下调Nrf2/HO-1信号通路表达有关。

微血管内皮细胞在脊髓损伤中的作用机制及中药干预脊髓损伤的研究进展

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种神经破坏性疾病,引起患者感觉、运动及自主神经功能障碍[1]。根据病因,SCI可以分为创伤性与非创伤性,研究[2]发现,发展中国家创伤性SCI发病率逐年下降,而其中坠落伤及老年患者占比上升,男性多于女性,且以不完全性四肢瘫多见。

胃饥饿素对高糖下视网膜微血管内皮细胞氧化应激及铁死亡的抑制作用

目的研究胃饥饿素对高糖下人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)氧化应激及铁死亡的影响。方法将体外培养的HRMEC分为对照组、高糖组、高糖+胃饥饿素组,分别采用常规培养基、含30 mmol/L D-葡萄糖培养基、含30 mmol/L D-葡萄糖+10 nmol/L胃饥饿素培养基培养24 h。采用细胞计数试剂盒8检测细胞增生情况;采用流式细胞术检测细胞活性氧簇(ROS)水平;采用试剂盒检测细胞中氧化应激指标还原型谷胱甘肽(GSH)浓度、丙二醛(MDA)浓度、超氧化物歧化酶(SOD)活性及Fe^(2+)浓度;采用透射电子显微镜观察线粒体结构;采用Western blot法检测HRMEC中铁死亡关键分子谷胱甘肽过氧化合物酶4(GPX4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)蛋白表达。结果对照组、高糖组、高糖+胃饥饿素组细胞增生率分别为(100.62±3.40)%、(63.74±4.25)%和(88.19±4.65)%,ROS荧光强度分别为15512.20±1347.53、46457.00±1072.65和22220.87±1669.20,GSH浓度分别为(68.52±7.61)、(21.45±1.57)和(55.68±5.15)μmol/L,MDA浓度分别为(0.79±0.10)、(2.47±0.27)和(1.08±0.15)μmol/L,SOD活性分别为(111.67±10.32)、(37.75±5.92)和(97.45±9.12)U/ml,Fe^(2+)浓度分别为(3.02±0.30)、(9.45±0.71)和(4.63±0.32)mmol/mgprot。各组间细胞增生率、ROS荧光强度、GSH浓度、MDA浓度、SOD活性及Fe^(2+)浓度总体比较,差异均有统计学意义(F=61.82、414.59、61.28、67.24、61.64,146.14,均P<0.001);与对照组相比,高糖组细胞增生率、GSH浓度和SOD活性均明显降低,ROS荧光强度、MDA浓度和Fe^(2+)浓度明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);与高糖组相比,高糖+胃饥饿素组细胞增生率、GSH浓度和SOD活性明显升高,ROS荧光强度、MDA浓度和Fe^(2+)浓度明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与对照组相比,高糖组细胞内线粒体铁死亡现象明显;与高糖组相比,高糖+胃饥饿素组线粒体状态明显改善。各组间细胞中GPX4、SLC7A11蛋白相对表达量总体比较,差异均有统计学意义(F=63.94、182.84,均P<0.001);与对照组相比,高糖组和高糖+胃饥饿素组细胞中GPX4、SLC7A11蛋白相对表达量均明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);与高糖组相比,高糖+胃饥饿素组2种蛋白表达水平均升高,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论胃饥饿素可促进高糖下的HRMEC增生,抑制高糖诱导的氧化应激和铁死亡。

卡巴胆碱对失血性休克大鼠肺微血管内皮细胞功能的影响

目的 观察大鼠失血性休克时卡巴胆碱对肺微血管内皮细胞的作用。方法 将30只健康雄性SD大鼠(SPF级)按每组10只随机分为假休克组(SS组)、失血性休克组(HS组)、失血性休克+卡巴胆碱组(CBL组)。失血性休克动物模型按照Wiggers改良法制作,各组模型制备完毕后6 h,经右侧股动脉采血,检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,取右肺下叶肺组织检测Src抑制的蛋白激酶C的底物(SSeCKS)、E-选择素蛋白质水平,取右肺下叶行透射电镜检查肺微血管内皮细胞超微结构。结果 SS组表达少量的TNF-α、SSeCKS、E-选择素,HS组和CBL组表达升高(P<0.05),与HS组相比,CBL组表达降低(P<0.05)。SS组肺微血管内皮细胞细胞膜表面光滑,细胞膜、细胞质、细胞核形态结构正常;HS组肺微血管内皮细胞出现细胞水肿、坏死和凋亡表现(细胞膜表面皱折、细胞膜表面凹凸不平、细胞器水肿、异染色质染色加深边集等);CBL组较SS组,细胞有所损伤,但好于HS组。结论 大鼠失血性休克时卡巴胆碱对肺微血管内皮细胞具有保护作用,也可通过抑制炎症细胞合成和释放炎症介质减轻对血管内皮细胞的损伤。

秃疮花异紫堇碱对LPS诱导的牛肺微血管内皮细胞炎症因子和TLR2/MYD88/NF-κB通路的影响

试验旨在探究秃疮花异紫堇碱(ICD)对脂多糖(LPS)诱导的牛肺微血管内皮细胞(CPA 47)炎症因子和Toll样受体2/髓样分化因子88/核转录因子-κB(TLR2/MYD88/NF-κB)通路的影响。选取CPA 47分为5组接种于6孔板中,每组设置4孔,对照组细胞加入1640培养基,LPS组加入脂多糖处理建立炎症模型,ICD高剂量组细胞加入20 mg/L ICD+50μg/L LPS,ICD中剂量组细胞加入15 mg/L ICD+50μg/L LPS,ICD低剂量组细胞加入10 mg/L ICD+50μg/L LPS。分别利用ELISA检测各组的炎性因子含量,实时荧光定量PCR检测TLR2/MYD88/NF-κB通路中关键基因的表达量,免疫印迹法(Western blot)检测上述通路中各蛋白含量。结果显示,与对照组相比,LPS处理组和ICD低剂量组牛肺微血管内皮细胞白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子(TNF-α)含量显著升高(P<0.05),TLR2、NF-κB、MYD88的mRNA表达量和蛋白含量显著升高(P<0.05)。与LPS组相比,ICD高、中剂量组中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量显著降低(P<0.05),TLR2、NF-κB、MYD88的mRNA表达量和蛋白含量显著降低(P<0.05)。研究表明,15~20 mg/L ICD可以有效缓解LPS诱导的牛肺微血管内皮细胞的炎症反应,抑制LPS诱导的牛肺微血管内皮细胞TLR2/MYD88/NF-κB炎症通路的激活。

过表达BIRC5基因对氧糖剥夺/复氧诱导的脑微血管内皮细胞活性及VEGF表达的影响

目的探讨过表达BIRC5基因对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的小鼠脑微血管内皮细胞损伤的保护作用,并分析其可能的机制。方法将小鼠源性脑微血管内皮细胞,根据不同干预方式分为正常对照组(细胞正常培养)、细胞损伤组(细胞正常培养24 h,随后OGD3h/R3h损伤细胞)、BIRC5干预组(细胞预先转染腺病毒-BIRC5质粒并培养24 h,随后OGD3h/R3h处理)和阴性对照组(细胞预先转染腺病毒空质粒并培养24 h,随后OGD3h/R3h处理)。采用激光共聚焦显微镜观察各组细胞形态学变化;用MTT法和流式细胞仪分别检测各组细胞存活率和凋亡率;用RT-PCR和免疫印迹法分别检测各组细胞BIRC5和VEGF mRNA及蛋白表达。结果正常对照组的细胞骨架微丝彼此连接,分布规则,丝网状有序排列;细胞损伤组和阴性对照组的细胞微丝断裂,收缩变短或移向周边,微丝网状排列紊乱,可见细胞外形皱缩,间隙加大,少部分微丝缺失出现空隙;BIRC5干预组的细胞微丝连接,形态成长梭形,排列较规则,可见细胞间隙缩小,显示过表达BIRC5基因能够减轻损伤细胞的骨架微丝紊乱。与正常对照组相比,细胞损伤组、BIRC5干预组及阴性对照组细胞存活率降低,而细胞凋亡率增高,差异均有统计学意义(P<0.05);与细胞损伤组相比,BIRC5干预组的细胞存活率增高,而细胞凋亡率降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组相比,细胞损伤组、BIRC5干预组和阴性对照组的BIRC5和VEGF的mRNA及蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);与细胞损伤组相比,BIRC5干预组细胞BIRC5和VEGF的mRNA及蛋白表达增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论过表达BIRC5基因对OGD/R诱导的脑微血管内皮细胞损伤具有保护作用,机制可能与上调VEGF表达有关,提示BIRC5调控VEGF表达促进血管新生可能是脑侧支循环建立和形成的重要机制之一。

基于内皮细胞功能障碍探讨糖尿病微血管病变“微型癥瘕”病机理论的科学内涵

基于中医理论及当前科学研究发现,糖尿病微血管病变内皮细胞功能障碍与中医“微型癥瘕”病机理论存在着深刻的联系。糖尿病热伤气阴,病久入络后可致血脉气血阴阳亏虚,人体正气亏虚,瘕聚阶段无形可查;持续进展可致痰、热、郁、瘀痼结于络脉形成癥积而有形可征。国医大师吕仁和教授称之为“微型癥瘕”病机理论,其中正气亏虚是瘕聚发生的基础,痰热郁瘀是癥积形成的关键,这与微血管在内皮细胞功能异常的基础上进一步进展至结构改变,最终导致糖尿病微血管内皮细胞功能障碍的病理过程相一致。内皮细胞功能异常与结构改变可视为正气亏虚及痰热郁瘀的微观体现,共同诠释糖尿病微血管病变“微型癥瘕”病机理论的科学内涵。此认识可为中医药防治糖尿病微血管病变提供新的研究角度和方向,为临床和科研的开展提供充分的理论支撑。

天麻素与薯蓣皂苷元配伍对大鼠缺氧损伤脑微血管内皮细胞的保护作用

目的探讨天麻素(Gas)、薯蓣皂苷元(Dio)及其组合物(GDC)对大鼠缺氧损伤脑微血管内皮细胞(BMECs)的保护作用和对脑微血管新生的影响及其作用机制。方法将BMECs分为5组:正常对照组,模型对照组,Gas组(1、2、4、8、16、32μmol·L^(-1)),Dio组(0.25、0.5、1、2、4、8μmol·L^(-1)),GDC组(Gas和Dio浓度分别为1和0.25、2和0.5、4和1、8和2、16和4、32和8μmol·L^(-1))。分组给药12 h后,对模型对照组、Gas组、Dio组和GDC组通过氧糖剥夺法建立BMECs缺氧模型。检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、白细胞介素1β(IL-1β)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)浓度;观察Hoechst 33258、FITC-Annexin V/PI染色,采用Transwell小室实验、细胞划痕实验和小管形成实验,考察Gas、Dio及GDC对缺氧损伤BMECs的保护作用及促进血管新生作用。进一步利用网络药理学和分子对接方法研究GDC抗脑缺血的作用机制。结果Gas、Dio以2、0.5μmol·L^(-1)组合时,可显著提高缺氧损伤BMECs细胞活力(P<0.05),促进细胞增殖;与模型对照组比较,Gas组LDH漏出率降低(P<0.05);Gas组、Dio组与GDC组IL-1β含量均显著下降(均P<0.05),Gas组、GDC组SOD活力升高(P<0.05),Gas组、Dio组以及GDC组凋亡小体减少。GDC可促进BMECs缺氧模型的增殖、侵袭、迁移以及小管形成,表明其在细胞水平上一定程度促进血管新生。网络药理学研究发现,Gas与半胱天冬酶3(CASP3)、过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARG)、凝血因子Ⅱ(F2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)1蛋白具有良好的结合活性,Dio与内皮一氧化氮合成酶(NOS3)、KDR蛋白具有良好的结合活性,Gas、Dio可能主要通过血管内皮生长因子(VEGF)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)-Akt信号通路以及缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路调控脑缺血后血管新生。结论Gas、Dio及GDC具有抗缺氧损伤作用并可促进缺氧损伤后血管新生,作用机制可能与其作用于Akt1、NOS3、VEGFR2等蛋白,调控VEGF/Akt/MAPK等信号通路促进血管新生有关。

中药保护心脏微血管内皮细胞在慢性冠脉综合征治疗中的研究进展

心脏微血管内皮细胞是心脏微血管系统的重要组成部分,在冠状动脉粥样硬化、急性心肌梗死后无复流及再灌注损伤、微血管性心绞痛、缺血性心律失常、心肌梗死后心力衰竭等慢性冠脉综合征(CCS)的发生发展的过程中具有重要作用。本研究基于当前证据对心脏微血管内皮细胞与CCS的发病机制以及中药复方及单体抑制心脏微血管内皮细胞损伤的相关研究机制进行综述,以期为临床提供参考。

中性粒细胞胞外诱捕网通过激活NLRP3炎症小体诱导人肺微血管内皮细胞焦亡

目的探讨中性粒细胞胞外诱捕网作用于肺微血管内皮细胞并诱发内皮细胞死亡的具体机制。方法以200 ng/mL的体外分离的中性粒细胞胞外诱捕网刺激人肺微血管内皮细胞,碘化丙锭染色法检测细胞死亡情况,蛋白质印迹法和免疫荧光法检测焦亡标记物。结果与对照组相比,中性粒细胞胞外诱捕网刺激后的肺微血管内皮细胞死亡加剧,NLRP3炎症小体和焦亡相关标记物GSDMD、N-GSDMD表达明显升高,NLRP3抑制剂MCC950预处理可有效减弱NLRP3的激活,抑制细胞焦亡的发生。结论中性粒细胞胞外诱捕网可通过激活NLRP3炎症小体诱发人肺微血管内皮细胞焦亡。

缺氧时培养的心内膜内皮细胞内皮素自分泌调节的探讨

本实验观察缺氧对心内膜内皮细胞（ＥＥＣ）内皮素－１（ＥＴ－１）分泌的影响。传代培养的新生小牛右心室ＥＥＣ的ＥＴ－１免疫组织化学显色强阳性。采用放免测定发现ＥＥＣ可向培养液中分泌ＥＴ－１，其分泌速度与细胞密度呈线性负相关（ｒ＝－０．９５４２，Ｐ＜０．００１），与温育时间呈指数负相关（ｒ＝－０．９９８，Ｐ＜０．００１）。０％Ｏ２缺氧６～１２ｈ后，ＥＥＣ的ＥＴ－１分泌约增加１倍（Ｐ＜０．００１）。无论在常氧还是缺氧情况下，硝普钠抑制ＥＥＣ的ＥＴ－１分泌，而ＮＯ合酶抑制剂ＬＮＡ则促进ＥＴ－１分泌。上述结果表明：ＥＥＣ可能通过分泌ＥＴ－１调节心脏功能，内源性ＮＯ抑制ＥＴ－１分泌；

lncRNA SNHG6对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞损伤的影响

目的:探讨lncRNA SNHG6对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)损伤的影响及其可能的作用机制。方法:采用高糖诱导hRMECs建立细胞损伤模型。高糖(HG)组将hRMECs培养在浓度为25 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培养基24 h;正常(NG)组将hRMECs培养在浓度为5.5 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培养基;按照实验设计分别将si-NC、si-SNHG6、si-SNHG6和anti-miR-NC、si-SNHG6和anti-miR-186-5p转染至hRMECs,随后25 mmol/L D-葡萄糖孵育24 h,分别记为HG+si-NC组、HG+si-SNHG6组、HG+si-SNHG6+anti-miR-NC组、HG+si-SNHG6+anti-miR-186-5p组。qRT-PCR法检测lncRNA SNHG6、miR-186-5p的表达量;双荧光素酶报告实验检测lncRNA SNHG6与miR-186-5p的靶向关系;MTT法与流式细胞术分别检测细胞增殖及凋亡;ELISA法检测IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-10的水平;采用试剂盒检测SOD的活性和MDA的水平;Western blot检测cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表达量。结果:HG组与NG组比较lncRNA SNHG6表达升高,miR-186-5p表达降低(均P<0.05);lncRNA SNHG6可靶向结合miR-186-5p。转染si-SNHG6后细胞增殖抑制率、凋亡率、cleaved-caspase3、Bax蛋白水平,IL-1β、TNF-α、IL-8含量以及MDA活性降低(P<0.05),而Bcl-2蛋白、IL-10含量以及SOD的活性升高(P<0.05)。共转染si-SNHG6和anti-miR-186-5p后,细胞增殖抑制率、凋亡率、cleaved-caspase3、Bax、IL-1β、TNF-α、IL-8以及MDA升高(P<0.05),而Bcl-2蛋白、IL-10和SOD降低(P<0.05)。结论:干扰lncRNA SNHG6表达可通过促进miR-186-5p表达而抑制高糖诱导的hRMECs凋亡、炎症反应及氧化应激。

脂肪间充质干细胞外囊泡通过增加LC3B表达对人微血管内皮细胞损伤的影响

目的:探讨低氧微环境诱导下脂肪间充质干细胞(ADSCs)外囊泡(Evs)通过增加微管相关蛋白轻链3B(LC3B)表达对人微血管内皮细胞损伤的保护作用。方法:分离大鼠ADSCs,并通过成骨、成脂分化和细胞表面标志物的表达进行鉴定。利用常氧(21%O2)和低氧(1%O2)条件分别获得常氧Evs和低氧Evs,通过形态和表面标志物的表达进行鉴定。构建心肌微血管内皮细胞(CMECs)细胞氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型,并将CMECs分为对照组(Control组)、氧糖剥夺/再灌注组(OGD/R组)、常氧Evs组(N-Evs组,给予常氧Evs培养24 h)、低氧Evs组(H-Evs组,给予低氧Evs培养24 h)、低氧Evs+自噬抑制剂组(H-Evs+3-MA组,给予低氧Evs和3-MA 5 mmol/L培养24 h)。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法、5-乙炔基-2-脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色、划痕实验、Transwell实验、管腔形成实验和透射电镜分别检测CMECs增殖、迁移、侵袭、血管形成和自噬能力;采用酶联免疫吸附法(Western Blot)检测增殖细胞核抗原(PCNA)、Ki67、基质金属蛋白酶(MMP)-2/MMP-9、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、LC3B、重组人自噬效应蛋白1(Beclin1)蛋白表达。结果:与Control组比较,OGD/R组CMECs增殖、迁移、侵袭、血管形成、自噬能力减弱(P<0.05),PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达减少(P<0.05)。与OGD/R组比较,N-Evs组和H-Evs组CMECs增殖、迁移、侵袭、血管形成、自噬能力增强(P<0.05),PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达增加(P<0.05),且H-Evs组优于N-Evs组(P<0.05)。与H-Evs组比较,H-Evs+3-MA组CMECs增殖、迁移、侵袭、血管形成、自噬能力减弱(P<0.05),PCNA、Ki67、MMP-2/MMP-9、HIF-1α、VEGF、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达减少(P<0.05)。结论:低氧微环境诱导下的ADSCs-Evs通过增加LC3B表达可促进OGD/R损伤CMECs的增殖、迁移、侵袭、血管形成和自噬能力。

丹参酮ⅡA对脓毒症肺微血管内皮细胞损伤的保护作用

目的探寻丹参酮ⅡA对脓毒症肺血管内皮细胞损伤的保护作用。方法采用盲肠结扎穿孔术构建脓毒症肺损伤小鼠模型,分为6组:假手术组、模型组、丹参酮1组(10 mg/kg)、丹参酮2组(30 mg/kg)、丹参酮3组(50 mg/kg)、丹参酮4组(100 mg/kg)。药物干预24 h后检测肺组织病理变化、肺微血管通透性、肺组织湿/干重比、白细胞计数以及炎症因子等各项指标,假手术组仅行盲肠探查术。结果丹参酮各组较模型组小鼠肺组织损伤及评分均减轻(P<0.05)。与模型组比较,丹参酮各组小鼠肺组织Evans Blue含量、肺组织湿/干比明显降低(P<0.05),BALF白细胞计数、蛋白含量、炎症因子明显减少(均P<0.05),且呈剂量依赖性,其中丹参酮2组、丹参酮3组和丹参酮4组之间,肺组织病理损伤、Evans Blue含量、肺组织湿/干比以及肺泡灌洗液中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)表达水平差异无统计学意义(均P>0.05)。结论丹参酮ⅡA能够剂量依赖性地降低脓毒症所致的肺微血管内皮细胞损伤,从而改善肺损伤;30 mg/kg剂量的丹参酮ⅡA即可达到最佳效果。

丹参通络解毒汤含药血清调控MALAT1对缺氧/复氧大鼠心肌微血管内皮细胞的保护作用及机制研究

目的研究丹参通络解毒汤含药血清调控转移相关肺腺癌转录本1(MALAT1)对缺氧/复氧大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)的保护作用及机制。方法体外培养大鼠CMECs,构建缺氧/复氧损伤细胞模型,转染过表达/沉默空白MALAT1慢病毒,将细胞分为过表达空白+中药组、过表达MALAT1+中药组、过表达MALAT1组、沉默空白+中药组、沉默MALAT1组、沉默MALAT1+中药组,分别予相应血清培养,免疫荧光染色检测Beclin-1蛋白表达,Western blot检测丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(SRPK1)、丝氨酸丰富剪接因子1(SRSF1)、血管内皮生长因子(VEGF)及Bax蛋白表达,RT-PCR检测MALAT1、SRPK1、SRSF1 mRNA表达。结果与过表达空白+中药组比较,过表达MALAT1+中药组Beclin-1蛋白表达升高,SRPK1、SRSF1、Bax蛋白表达显著升高(P<0.05,P<0.01),VEGF蛋白表达显著降低(P<0.01),MALAT1、SRPK1、SRSF1 mRNA表达显著升高(P<0.05,P<0.01);与过表达MALAT1组比较,过表达MALAT1+中药组Beclin-1蛋白表达降低,SRPK1、SRSF1、Bax蛋白表达显著降低(P<0.01,P<0.05),VEGF蛋白表达显著升高(P<0.01),MALAT1、SRPK1、SRSF1 mRNA表达显著降低(P<0.05);与沉默空白+中药组比较,沉默MALAT1+中药组Beclin-1蛋白表达降低,SRPK1、SRSF1、Bax蛋白表达显著降低(P<0.01),VEGF蛋白表达显著升高(P<0.01),MALAT1、SRPK1、SRSF1 mRNA表达显著降低(P<0.01);与沉默MALAT1组比较,沉默MALAT1+中药组Beclin-1蛋白表达降低,SRPK1、SRSF1、Bax蛋白表达显著降低(P<0.05),VEGF表达显著升高(P<0.01),MALAT1、SRPK1、SRSF1 mRNA表达显著降低(P<0.01,P<0.05)。结论上调MALAT1表达可促进缺氧/复氧损伤模型CMECs自噬,丹参通络解毒汤含药血清能通过抑制MALAT1表达抑制自噬、促进血管新生,其机制可能与下调SRPK1、SRSF1表达有关。

水蛭素对缺氧诱导心脏微血管内皮细胞间质转分化的作用及机制研究

目的探讨通络药物水蛭素对缺氧诱导的人心脏微血管内皮细胞(HCMECs)间质转分化(EndMT)的作用及可能机制。方法取常规培养的HCMECs细胞,随机分为对照组、缺氧组、水蛭素组(包括0、20、40、80、100μg/ml 5个浓度)。对照组常规培养不做任何处理,缺氧组置入低氧培养箱72 h,水蛭素组预加入Hirudin工作液,4 h后置入低氧培养箱72 h。MTS比色法检测HCMECs增殖能力;倒置显微镜观察HCMECs形态;免疫荧光鉴定HCMECs间质转分化情况,Western-blot检测内皮间质转分化相关蛋白:包括内皮细胞标记血小板—内皮细胞黏附分子(PECAM-1/CD31)、血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin),间质细胞标记α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、成纤维细胞特异性蛋白-1(FSP-1),以及低氧诱导因子1α(HIF-1α)、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad同源物2/3(Smad2/3)、锌指转录因子(snail)等相关信号通路的蛋白表达。结果MTS法检测显示,缺氧显著抑制细胞活性(P<0.01),水蛭素在20~100μg/ml浓度范围内可提高细胞活性,且呈现浓度依赖性,当浓度为100μg/ml时细胞活性最强(P<0.01)。各组细胞培养72 h后,倒置显微镜下观察发现:对照组细胞呈铺路石样或鹅卵石状结构,缺氧组细胞由鹅卵石状结构变为分散的长梭形,接近成纤维细胞形态,水蛭素组长梭形细胞形态明显改善,细胞恢复鹅卵石样。Western-blot与免疫荧光结果显示:与对照组比较,缺氧组CD31、VE-cadherin蛋白水平降低(P<0.01),且vWF表达减少,α-SMA、FSP-1蛋白水平升高(P<0.01),且vimentin表达增强;与缺氧组比较,水蛭素明显增加CD31、VE-cadherin蛋白表达(P<0.01),并增强vWF表达,下调α-SMA、FSP-1蛋白表达(P<0.01),并减弱vimentin表达;与对照组相比,缺氧组信号通路HIF-1α、TGF-β1、p-smad2/3、snail蛋白表达均升高(P<0.01),与缺氧组比较,水蛭素下调HIF-1α、TGF-β1、p-smad2/3、snail蛋白表达(P<0.01)。结论水蛭素可以改善缺氧诱导的HCMECs细胞发生EndMT,其机制可能与调控HIF-α/TGF-β1/smad/snail通路有关。