人心室肌球蛋白轻链1基因的克隆及其体外的表达与纯化

通过聚合酶链式反应方法扩增人心室肌球蛋白轻链1的基因片段,并将其克隆到pET-22b质粒,构建表达重组体,转化大肠杆菌BL21细胞,转化子细胞经IPTG诱导,目的蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,凝胶成像扫描检测,其表达量接近细胞总蛋白的40%,经Ni2+亲和层析使目的蛋白得到纯化。

先天性心脏病家系心室肌球蛋白轻链1基因的RFLP分析

本研究利用人心室肌球蛋白轻链1cDNA探针对先天性心脏病家系心室肌球蛋白轻链1基因进行了RFLP分析。从患有四种不同先天性心脏病的9个家系40名成员和13名无血缘关系患者的RFLP分析结果发现,有两个家系呈现限制酶切片段多态性,但这种限制性酶切片段多态性似与先天性心脏病的发生没有联系。

猪Myl1基因启动子克隆及多态性研究

肌球蛋白轻链1基因(Myl1)编码的不同剪切体(主要是MLC1f和MLC3f)与哺乳动物骨骼肌肌纤维类型相关。通过猪BAC文库筛选及引物步行法测序获得Myl1基因的启动子序列,采用PCR-RFLP技术分析蓝塘猪、大花白猪、大白猪、长白猪和杜洛克猪5个品种Myl1基因启动子区的多态性。结果表明,Myl1基因-678C/T位点在蓝塘和大花白等本地猪种中多态性丰富,而在杜洛克、长白和大白等外来猪种中几乎只有CC基因型。

MYL1基因mRNA选择性剪切体的鉴定及其在不同发育时期的蓝塘与长白猪骨骼肌中的表达

肌球蛋白轻链1基因(MYL1)的2个剪切体MLC1f及MLC3f在骨骼肌不同发育时期中发挥着重要作用。为进一步了解MYL1基因在猪骨骼肌发育过程中的重要作用,通过电子克隆、RT-PCR扩增及实时定量PCR方法克隆和鉴定了猪MYL1基因mRNA 5个选择性剪切体(MLC1f、MLC3f、MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C)。其中MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C是在猪背最长肌中鉴定到的MYL1基因的3个新转录本,目前在人、鼠等其它物种尚无这三种转录本的报道。结果表明,剪切体MLC3f在180日龄长白猪中的表达量最高,而剪切体MLC1f则是在90日龄蓝塘猪的表达量最高;剪切体MLC5f-A在蓝塘与长白猪中各发育时期的表达量都很低;除了剪切体MLC1f外,其余转录本的表达量均为随个体体重的增加而逐步增加。通过对MYL1基因不同选择性剪切体的鉴定,为其在骨骼肌不同发育阶段或组织类型特异性表达调控研究奠定了基础,为该基因功能的研究提供重要线索。

ROCK通路在DLC-1基因调控人结肠癌HT29细胞侵袭中的作用

目的观察肝癌缺失基因1(DLC-1)对HT-29细胞侵袭能力的影响。方法用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-DLC-1转染HT-29细胞;应用Rho激酶(ROCK)特异性抑制剂Y27632处理HT-29细胞;Westernblot检测p-MLC蛋白表达;Transwell小室实验检测细胞侵袭能力。结果野生型HT-29细胞DLC-1基因表达呈阴性,经转染获得DLC-1稳定表达细胞系;与对照组及空载组HT-29细胞相比,转染组和ROCK抑制剂组p-MLC蛋白表达均下调,细胞侵袭能力受到抑制(P<0.05)。结论转染DLC-1基因可能通过抑制ROCK活性,从而抑制HT-29细胞的侵袭能力。

LncRNA SNHG1通过miR-101-3p/MYLIP轴调节宫颈癌细胞增殖、凋亡和迁移的研究

目的 探究长链非编码RNA(lncRNA)小核仁RNA宿主基因1(SNHG1)对宫颈癌(cervical cancer, CC)细胞增殖、迁移和侵袭的影响及分子机制。方法 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测人正常宫颈上皮细胞(H8)和人CC细胞(Hela、Caski、C-33A、SiHa)中SNHG1、microRNA-101-3p(miR-101-3p)、肌球蛋白调节轻链相互作用蛋白(MYLIP)的mRNA和蛋白表达。体外培养Hela细胞,使用Lipofectamine 3000试剂将si-SNHG1、anti-miR-101-3p及其阴性对照si-NC、inhibitor-NC转染到Hela细胞中,分为对照(Control)组、si-NC组、si-SNHG1组、si-SNHG1+anti-NC组、si-SNHG1+anti-miR-101-3p组。转染48 h后,qRT-PCR检测细胞中SNHG1、miR-101-3p和MYLIP mRNA的表达水平,Western blot检测细胞中MYLIP蛋白表达;CCK-8法检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力;通过双荧光素酶报告(DLRA)和RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验验证Hela细胞中SNHG1、miR-101-3p和MYLIP的调控作用。结果 CC细胞系(Hela、Caski、C-33A、SiHa)中SNHG1、MYLIP mRNA和蛋白水平升高,miR-101-3p表达水平降低(P<0.05)。敲低SNHG1可显著上调miR-101-3p表达,降低MYLIP表达,抑制Hela细胞增殖、迁移和侵袭,并促进Hela细胞凋亡(均P<0.05);下调miR-101-3p可显著减弱SNHG1敲低的促凋亡和抗迁移、侵袭作用(均P<0.05)。DLRA和RIP实验证实SNHG1可以靶向并结合Hela细胞中的miR-101-3p, MYLIP是miR-101-3p的靶标。结论 SNHG1敲低可能是通过上调miR-101-3p来抑制MYLIP表达,进而抑制CC细胞增殖、迁移和侵袭,并促进CC细胞凋亡。

香砂六君子汤调控RhoA/ROCK2/MYPT1信号通路改善功能性消化不良大鼠胃动力的机制

目的:基于RAS同源基因家族成员A(RhoA)/Rho关联卷曲螺旋蛋白激酶2(ROCK2)/肌球蛋白轻链磷酸酶靶向亚基1(MYPT1)信号通路探讨香砂六君子汤对功能性消化不良(FD)大鼠胃动力障碍的干预机制。方法:将60只SPF级雄性SD乳鼠随机分为正常组(n=10)和造模组(n=50),造模组大鼠采用综合造模法复制FD大鼠模型。模型复制成功后将造模组大鼠随机分为模型组、莫沙必利组和香砂六君子汤高、中、低剂量组,共5组,每组10只。正常组和模型组大鼠给予10 mL·kg^(-1)·d^(-1)生理盐水灌胃,莫沙必利组给予1.35 mg·kg^(-1)·d^(-1)莫沙必利灌胃,香砂六君子汤高、中、低剂量组分别给予12、6、3 g·kg^(-1)·d^(-1)香砂六君子汤汤剂灌胃,持续干预14 d。造模和给药前后观察大鼠一般生存状况,测定大鼠体质量、3 h平均进食量。给药干预结束后,测定大鼠肠推进率,采用苏木素-伊红(HE)染色观察胃组织病理改变,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定各组大鼠延髓和胃组织匀浆液中胆碱乙酰转移酶(ChAT)、血管活性肠肽(VIP)含量,采用冰冻切片染色技术观察各组大鼠胃窦平滑肌中腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)酶分布,采用蛋白免疫印迹法检测胃组织中RhoA、ROCK2、磷酸化(p)-MYPT1蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠毛发枯乱、倦懒怠动、行动缓迟,一般生存状况较差,体质量、3 h平均进食量以及肠推进率均明显下降(P<0.05);胃组织病理未见明显异常;延髓和胃组织中ChAT含量减少,胃组织中VIP含量增多,胃窦平滑肌中ATP酶分布明显减少,胃组织中RhoA、ROCK2、p-MYPT1蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。与模型组比较,各给药组大鼠一般生存状况明显好转,体质量、3 h平均进食量及肠推进率明显增加(P<0.05);胃组织病理未见明显差异;延髓和胃组织中ChAT含量明显增加,胃组织中VIP含量减少,胃窦平滑肌中ATP酶分布明显增加,胃组织中RhoA、ROCK2、p-MYPT1蛋白表达水平明显升高(P<0.05),上述指标香砂六君子汤组干预作用呈剂量依赖性。结论:香砂六君子汤能够有效改善FD大鼠一般生存状况及胃动力,其具体机制可能与香砂六君子汤激活胃组织中RhoA/ROCK2/MYPT1信号通路调控平滑肌舒缩,促进胃动力有关。

黄芪甲苷对小鼠神经母细胞瘤细胞神经突起回缩的影响及机制研究

目的观察黄芪甲苷对溶血磷脂酸(LPA)诱导的小鼠神经母细胞瘤细胞(N1E-115)神经突起回缩的影响,探讨其作用机制。方法将N1E-115细胞按随机数字表法分为空白组、模型组及0、40、80μg/ml黄芪甲苷组。0、40、80μg/ml黄芪甲苷组分别以20、40、80μg/ml黄芪甲苷干预24 h,空白组及模型组不做药物干预,每组以无血清培养12 h,模型组及黄芪甲苷各浓度组以40μmol/L的LPA干预10 min。于倒置显微镜观察并拍照,采用Image J软件计数N1E-115细胞神经突起数量;采用免疫荧光染色法检测细胞RAS同源基因家族成员A(RhoA)、Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶2(ROCK2)、p-ROCK2、磷酸化肌球蛋白轻链2(p-MLC2)蛋白表达;荧光实时定量PCR法检测RhoA、ROCK2 mRNA水平;Western blot法检测RhoA、ROCK2、p-MLC2、肌球蛋白轻链2(MLC2)蛋白表达。结果与20μg/ml黄芪甲苷组比较,40、80μg/ml黄芪甲苷组神经突起回缩抑制率升高(P<0.05);与模型组比较,20、40、80μg/ml黄芪甲苷组RhoA、p-ROCK2、p-MLC2蛋白平均荧光强度及40μg/ml黄芪甲苷组ROCK2蛋白平均荧光强度降低(P<0.05或P<0.01);20、40、80μg/ml黄芪甲苷组RhoA mRNA[(0.89±0.09)、(0.41±0.01)、(0.09±0.03)比(1.50±0.01)]、ROCK2 mRNA[(0.89±0.09),(0.14±0.01),(0.20±0.01)比(1.62±0.17)]水平降低(P<0.05或P<0.01);20、40、80μg/ml黄芪甲苷组ROCK2蛋白[(0.75±0.06,0.57±0.02,0.66±0.01)比(1.08±0.02)]、p-MLC2蛋白[(1.72±0.03)、(1.40±0.04)、(1.29±0.03)比(2.19±0.11)]、MLC2蛋白[(1.13±0.02)、(0.68±0.03)、(0.75±0.03)比(1.60±0.03)]及40、80μg/ml黄芪甲苷组RhoA蛋白[(0.35±0.01)、(0.40±0.03)比(0.57±0.08)]表达降低(P<0.05或P<0.01)。结论黄芪甲苷可阻止LPA诱导的神经突起回缩,促进受损神经再生,其机制可能与下调RhoA-ROCK2通路RhoA、ROCK2、p-ROCK2、p-MLC2、MLC2蛋白表达,抑制神经生长锥崩溃有关。