风湿性心脏病心房纤颤和非心房纤颤患者心房肌细胞内钙离子浓度变化

目的 观察风湿性心脏病 (RHD)心房纤颤 (AF)患者心房肌细胞内是否存在 Ca2 + 超载 .方法 急性分离 RHD伴 AF和非 AF患者的心房肌细胞 ,用 Fluo- 3作为钙指示剂 ,用共聚焦显微镜测定细胞内 Ca2 +浓度 .结果 AF组心房肌细胞内 Ca2 +浓度明显高于非 AF组心房肌细胞内 Ca2 +浓度(5 17± 98) nmol· L- 1 vs(2 6 2± 6 5 ) nmol· L- 1 ,两组间差异显著 (P<0 .0 1) .结论 RHD伴 AF患者心房肌细胞内存在Ca2

共聚焦显微技术分析卡维地洛对人心房肌细胞内钙离子的影响

目的:研究卡维地洛对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的人心房肌细胞内钙超载的拮抗作用。方法:急性分离单个人心房肌细胞。实验分4组:正常对照组; AngⅡ组:加入终浓度为0.1μmol/L的AngⅡ;卡维地洛组:加入终浓度为1μmol/L的卡维地洛; AngⅡ+卡维地洛组:卡维地洛1μmol/L与AngⅡ0.1μmol/L同时加入。以Fluo 3/AM荧光指示剂负载,应用激光共聚焦显微镜技术,分别于加入干预药物后即刻与15 min检测[Ca2+]i变化。结果:对照组和卡维地洛组人心房肌细胞内荧光强度和荧光光密度值较低。AngⅡ加入后即刻,细胞内荧光光密度值开始增加,15 min后细胞内荧光强度和荧光光密度值显著增高(P<0.05)。而AngⅡ+卡维地洛组细胞内荧光光密度值显著低于AngⅡ组(P<0.05)。结论:AngⅡ可引起人心房肌细胞内Ca2+超载,卡维地洛能显著减轻AngⅡ诱导的人心房肌细胞内Ca2+超载。

血管紧张素Ⅱ对人心房肌细胞内Ca^(2+)的影响及替米沙坦的拮抗作用

目的:研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对人心房肌细胞[Ca2+]i的影响,以及AngⅡ受体拮抗剂替米沙坦的拮抗作 用.方法:急性分离单个人心房肌细胞,实验分4组:正常对 照组;AngⅡ组,加入终浓度为0.1μmol/L的AngⅡ;替米沙 坦组,加入终浓度为10nmol/L的替米沙坦;AngⅡ+替米沙 坦组,替米沙坦10nmol/L与AngⅡ0.1μmol/L同时加入.以 Fluo 3/AM荧光指示剂负载,应用激光共聚焦显微镜技术,分 别于加入干预药物后即刻与15min检测[Ca2+]i变化. 结果:对照组和替米沙坦组人心房肌细胞内荧光强度和荧光 光密度值较低.AngⅡ加入后即刻,细胞内荧光光密度值开始 增加,15min后细胞内荧光强度和荧光光密度值显著增高 (P<0.01vs对照组).而AngⅡ+替米沙坦组细胞内荧光光 密度值显著低于AngⅡ组(P<0.01vsAngⅡ组).结论:Ang Ⅱ可引起人心房肌细胞内钙超载,替米沙坦能显著减轻Ang Ⅱ诱导的?

胡椒碱减轻H2O2引起的兔心房肌细胞内向整流钾电流及超速激活延迟整流钾电流的异常改变

目的:研究胡椒碱对H2O2引起的兔单个心房肌细胞内向整流钾电流(IK1)及超速激活的延迟整流钾电流(IKUr)异常的影响。方法:采用全细胞膜片钳技术分析50μmol/L H2O2对兔单个心房肌细胞IK1和IKUr的影响,并研究预先应用7μmol/L胡椒碱对其的保护作用。结果:7μmol/L胡椒碱对正常兔心房肌细胞IK1和IKUr及其通道动力学无显著影响。在50μmol/L H2O2作用下,兔心房肌细胞IK1峰值由(-148.2±16.7)pA/pF降低至(-64.2±9.8)pA/pF(P<0.05),电流-电压曲线上移;而IKUr峰值由(16.0±2.1)pA/pF降低至(6.1±1.4)pA/pF(P<0.05),电流-电压曲线下移,通道稳态激活曲线右移,通道稳态失活曲线左移及恢复时间减慢,而且存在频率依赖性特征。预先给予7μmol/L胡椒碱,明显减轻H2O2对IK1和IKUr的抑制作用(P<0.01),并可减少H2O2对超速激活延迟整流钾通道动力学的异常影响。结论:胡椒碱可减轻氧化应激对心房肌细胞IK1和IKUr的影响。

大蒜素对小鼠心房肌细胞多种钾电流的阻滞效应

目的 探讨大蒜素对小鼠心房肌细胞多种钾电流的作用及其机制。方法 采取双酶消化法将单个小鼠心房肌细胞分离出来,灌流法将药物作用于细胞,采用全细胞膜片钳技术,分别记录心房肌细胞的外向钾电流(I_(K,peak))、瞬时外向钾电流(I_(to))和超极化激活延迟整流钾电流(I_(KUr))。结果 钳制电压在+70 mV时,30μmol/L大蒜素可使小鼠心房肌细胞I_(K,peak)、I_(to)和I_(KUr)峰值显著降低,对I_(to)表现出抑制作用,该作用还呈现出一定的浓度依赖性和电压依赖性,半数抑制浓度(IC_(50))为(21.0±3.8)μmol/L。深入研究门控机制结果显示,I_(to)通道稳态失活曲线在大蒜素的作用下发生左移,且失活后再次激活的时间有所延迟,对于通道的关闭态失活过程影响不大,提示大蒜素主要通过抑制通道稳态失活和失活后恢复过程,减少I_(to)电流密度,同时对I_(KUr)也有阻滞作用,进而导致对总的外向电流抑制。结论 大蒜素可以直接降低小鼠心房肌细胞多种钾电流,这为进一步应用于房性心律失常提供潜在的可能。

SD大鼠乳鼠心房肌细胞间歇性低氧模型制备

目的采用间歇性低氧(IH)干预SD大鼠乳鼠原代心房肌细胞,为探索阻塞性睡眠呼吸暂停与心房颤动之间的关系提供体外实验模型和依据。方法选择1~3 d龄SD大鼠乳鼠30只,雌雄不限。分离、纯化、培养、鉴定SD大鼠乳鼠心房肌细胞。按常氧(N)、6 h IH、12 h IH、24 h IH和48 h IH随机分组,以体积分数5%O230 min+体积分数21%O230 min为1个循环,对心房肌细胞实施6、12、24、48 h的IH干预。四唑氮化合物(MTS)法检测细胞活力;收集细胞总蛋白,使用Western blot检测各组缺氧诱导因子-1α(HIF-1ɑ)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved caspase-3)、缝隙连接蛋白43(Cx43)的表达量。结果随IH刺激时间延长,细胞活力在6 h IH时明显下降,随IH时间延长,细胞活力逐渐升高(1.66±0.12、1.38±0.14、1.69±0.08、1.70±0.18、2.19±0.17。P<0.001)。HIF-1ɑ蛋白表达的上调呈时间依赖性(0.19±0.06、0.50±0.26、0.84±0.31、1.10±0.28、1.62±0.36。P<0.001)。cleaved caspase-3表达量在6 h IH组最高,以后逐渐下降并趋于稳定(0.65±0.05、0.73±0.11、0.46±0.08、0.43±0.13、0.49±0.13。P<0.001)。IH下调Cx43的表达,但随着IH时间延长,Cx43表达趋于稳定(1.05±0.24、0.64±0.12、0.55±0.09、0.55±0.14、0.55±0.09。P<0.001)。结论成功建立了SD大鼠乳鼠心房肌细胞IH模型,为进一步研究提供方法学基础。

快速心房起搏对家兔心房肌细胞内钙离子浓度及L-型钙通道表达的影响

房颤是临床常见的心律失常，但对房颤产生的具体机制缺乏统一的观点。尽管研究发现细胞内钙超载导致心房肌发生了电生理重构，引起房颤的发生和维持，但对房颤早期心房肌细胞内是否存在钙超载仍缺乏直接证据。本文通过建立兔的快速心房起搏（rapid atrial pacing，RAP）模型，检测不同时相点心房肌细胞内游离钙离子浓度和L-型钙离子通道的基因表达改变，为揭示房颤早期的电生理机制提供实验依据。

胺碘酮对人心房肌细胞钙电流和钙离子浓度影响的研究

目的 采用血管紧张素(Ang)Ⅱ刺激人的心房肌细胞,观察细胞膜钙通道电流及胞内游离钙浓度的变化,了解AngⅡ参与房性心律失常的电生理机制,同时观察胺碘酮的干预作用,为临床应用胺碘酮提供实验依据。方法 急性分离单个人心房肌细胞,采用全细胞膜片钳方法记录L 型钙电流(ICa L),同时应用共聚焦显微镜技术测定细胞内游离钙的浓度。实验分为对照组、AngⅡ组(0.1μmol/L AngⅡ)、胺碘酮组(30 nmol/L胺碘酮)及AngⅡ+胺碘酮组。结果 与对照组相比,0.1μmol/L AngⅡ能使人心房肌细胞膜ICa L峰值电流密度明显增加[(-12.77±1.61) pA/pF比(-5.78±0.81) pA/pF,P<0.05];30 nmol/L胺碘酮对人心房肌细胞膜ICa L无明显影响[(-5.58±0.62) pA/pF];但胺碘酮可拮抗AngⅡ的作用,AngⅡ+胺碘酮组的ICa L峰值电流密度[(-7.16±0.82) pA/pF]与AngⅡ组的差异有显著性(P<0.05)。共聚焦显微技术发现,对照组和胺碘酮组人心房肌细胞内荧光强度和荧光吸光度值较低;加入AngⅡ后即刻,细胞内荧光吸光度值开始增加,15 min后细胞内荧光强度和荧光吸光度值明显增高,与对照组比较,差异有显著性(P<0.05);而AngⅡ+胺碘酮组细胞内荧光吸光度值显著低于AngⅡ组(P<0.05)。结论 AngⅡ使人心房肌细胞膜ICa L峰值电流密度明显增加。

阿托伐他汀抑制心房肌细胞CTGF及Cx43的表达

目的探讨阿托伐他汀(atorvastatin)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心房肌细胞结缔组织生长因子(con-nective tissue growth factor,CTGF)及缝隙连接蛋白43(Connexin 43,Cx43)表达的影响。方法 18只雌雄对半1周龄左右Wistar大鼠,用于体外心房肌细胞的分离培养与鉴定。设置6组(n=18):正常对照组、AngⅡ(终浓度1μmol/L)组、AngⅡ+二甲基亚砜(DMSO)组、AngⅡ+atorvastatin(0.1、1.0、10μmol/L)组,作用72 h后RT-PCR分别检测CTGF、TGF-β1及Cx43的mRNA表达。结果与正常对照组相比,AngⅡ组CTGF、TGF-β1和Cx43 mRNA表达呈显著增加(P<0.05),阿托伐他汀逆转上述变化,10μmol/L组作用最强(P<0.05),而作为溶剂的DMSO无明显作用(P>0.05)。结论阿托伐他汀可能通过抑制AngⅡ诱导的心房肌细胞CTGF mRNA的高表达来减轻心房纤维化,同时可能通过下调Cx43 mRNA的表达来逆转缝隙连接蛋白的重构,最终减低房颤发生率。

蝎毒素BmkTXKβ对家兔心房肌细胞瞬间外向钾电流的抑制作用

为研究蝎毒素BmkTXKβ对家兔心房肌细胞瞬间外向钾电流 (Ito)的影响 ,采用全细胞膜片钳技术记录应用BmkTXKβ前后的Ito电流 .结果显示BmkTXKβ (1μmol/L)使心房肌细胞Ito (刺激电压为 +5 0mV)从(13 6 3± 0 87)pA/ pF减少到 (7 98± 0 78) pA/pF ,抑制率为 4 1 4 % (n =16 ,P <0 0 0 1) .冲洗后 ,Ito部分恢复至 (11 18± 0 82 ) pA/pF (n =6 ,P <0 0 1,与给药后比较 ) .在 0 0 1～ 10 0 μmol/L范围内BmkTXKβ呈浓度依赖性地抑制Ito,IC50 的均值为 0 95 μmol/L (n =10 ,P <0 0 1) ,但无频率依赖性 (n =6 ,P >0 0 5 ) .1μmol/L的BmkTXKβ可使Ito通道的失活动力学曲线明显左移 ,V1/ 2 分别为 (- 2 3 6± 2 7)mV和 (- 35 3± 3 6 )mV(n =8,P <0 0 5 ) ,曲线斜率基本不变 .同时可使Ito通道的恢复过程明显减慢 ,恢复曲线右移 ,τ值从 (5 1 2±8 5 )ms延长至 (93 5± 13 4 )ms (n =9,P <0 0 1) ,但不影响其激活过程 .据此推断BmkTXKβ对家兔心房肌细胞Ito具有显著的抑制作用 ,主要作用于失活过程 。

快速电场起搏对心房肌细胞电生理特性的实验研究

目的利用原代培养的心房肌细胞建立快速电场起搏模型,对其电生理特性进行初步研究。方法原代培养大鼠心房肌细胞,建立快速起搏的细胞模型,利用全细胞膜片钳技术检测起搏前、后的动作电位周期和有效不应期变化。结果成功建立了原代心房肌细胞的快速起搏模型,细胞纯度符合实验要求。快速电场起搏6 h后心房肌细胞的APD50和ERP较起搏前无显著变化,APD90较起搏前显著缩短(P<0.05)。快速电场起搏后12、24和48 h后心房肌细胞的APD50和APD90均较起搏前显著缩短(P<0.05),ERP较起搏前无显著变化。结论建立了快速起搏的房颤模型,其电生理特性符合房颤电重构的特点,为房颤的进一步深入研究奠定基础。

伊布利特对兔心房肌细胞快钠电流活性的影响

目的探讨伊布利特对兔心房肌细胞快钠通道电流(I_Na)的影响。方法30只兔随机分为正常对照组(Con,10只),伊布利特10^(-6)moL/L度组(10^(-6),10只),伊布利特10^(-5)mol/L浓度组(10^(-5),10只)。用膜片钳技术研究伊布利特对兔心房肌细胞I_(Na)的改变。结果10^(-6)与10^(-5)组I_(Na)峰值电流密度均降低且呈浓度依赖型;10^(-6)与10^(-5)组的I_Na电压依赖性稳态失活曲线与正常对照组相比,失活曲线明显左移,以10^(-5)左移最明显。10^(-6)与10^(-5)组I_(Na)再恢复明显减慢,再恢复时程延长,与对照组比较有显著性差异;10^(-6)与10^(-5)组之间比较有明显差异(P<0.05)。结论伊布利特干预后心房细胞I_(Na)电流活性降低,I_(Na)电流-电压曲线(I-V曲线)上移。I_(Na)电压依赖性稳态失活曲线左移,I_(Na)失活后再恢复时间延长。

兔右冠状动脉缺血再灌注致窦房结与心房肌细胞凋亡及L-精氨酸的干预作用

目的 :观察缺血再灌注 (IR)致兔窦房结及其周围心房肌细胞凋亡及L 精氨酸干预作用。方法 :采用在体兔右冠状动脉缺血再灌注模型 ,分IR组 ,IR +NS组 ,IR +L arg组。结果 :(1)三实验组中细胞凋亡率从结中央、结周边到周围心房肌是加重递增的 ,呈不均一性 ;(2 )IR +L arg组各部位细胞凋亡率明显降低 ,仍显示梯度凋亡 ;(3)光镜下 ,三实验组窦房结周围心房肌细胞损伤程度则较结中央细胞重 ,而IR +L Arg组相同部位细胞损伤程度轻。结论 :缺血再灌注可诱导窦房结及其周围心房肌细胞不均一凋亡 ,且窦房结凋亡率低 ;补充一定量的外源性L 精氨酸可降低缺血再灌注所致的细胞凋亡作用。

三七总皂甙对豚鼠心房肌细胞电生理特性的影响

目的:研究三七总皂甙(panax notoginseng saponins,PNS)对离体豚鼠左心耳心肌细胞(left atrialappendage,LAA)电生理特性的影响,以探讨其抗心律失常的作用机制。方法:应用标准玻璃微电极细胞内记录技术,记录不同浓度PNS灌流时,离体豚鼠左心耳心肌细胞的动作电位(action potential,AP)和有效不应期(effectiverefractory period,ERP)。结果:0.7、7、70、700mg/L PNS在灌流20min时作用最突出,与对照组比较7mg/L PNS灌流20min时的动作电位时程(action potential duration,APD)APD80,70mg/L灌流20、30、40min时APD50和APD80均明显延长(P<0.05)。0.7-700mg/L4个浓度组的PNS灌流20min时豚鼠心房肌细胞的静息电位(restpotential,RP)、动作电位幅度(action potential amplitude,APA)和0相最大除极速率(Vmax)无明显变化。7mg/L和70mg/L的PNS灌流20min能明显延长心房肌细胞的ERP,与对照组比较由(127.00±7.26)ms分别延长为(153.00±9.19)ms和(161.00±10.21)ms,P<0.01。而在7000mg/L高浓度时,灌流10min以后即出现心律失常现象。结论:一定浓度的PNS能延长豚鼠心房肌细胞的APD和ERP,与胺碘酮(amiodarone)相似,这可能是其抗心律失常的作用机制。

犬心房肌细胞分离的方法学探讨

目的建立稳定的适于膜片钳实验研究的犬心房肌细胞分离方法。方法取健康成年犬心脏12个，采用Langendorff灌流，行回旋支插管，正常台式液灌流10s，使心脏自主收缩排除残留余血。持续高钾液灌流，同时结扎其他血管及分支，剪去其余心脏组织，待左房及左心耳充盈，无钙台氏液灌流5min，125U／ml胶原酶Ⅱ200ml反复灌流消化约30～45min，后用无钙台氏液冲洗心脏5min，剪下心房肌组织，KB液中室温下剪碎，吹打，孵育5min后，用200目筛网过滤，逐步复钙法复钙后，室温静置1h，应用于膜片钳记录。结果分离的活性心肌细胞比率约90％，形态呈杆状、横纹清晰、膜周边光滑完整。结论采用本方法可以获得高产量与高质量的用于膜片钳离子流检测的心房肌细胞。

维拉帕米抑制快速起搏诱导心房肌细胞离子通道重构的研究

目的利用原代培养的心房肌细胞建立快速起搏模型,研究维拉帕米对L型钙通道及钾通道Kv4.3在快速起搏早期的表达的影响。方法原代培养大鼠心房肌细胞,并建立快速起搏细胞模型,实验分为:对照组、快速起搏组、维拉帕米+快速起搏组以及维拉帕米组,利用RTPCR以及Westernblot方法检测L型钙通道α1c及钾通道Kv4.3在不同情况下mRNA和蛋白的表达变化。结果快速起搏24h后L型钙通道α1c的mRNA和蛋白表达较对照组明显降低,起搏前给予维拉帕米预处理,再经24h起搏后,L型钙通道α1c以及钾通道Kv4.3mRNA及蛋白表达较对照组稍降低,二者差异无显著意义,但与未经维拉帕米处理的起搏组比较差异有显著意义(P<0.05)。结论快速起搏早期,原代培养心房肌细胞L型钙通道α1c及钾通道Kv4.3的mRNA和蛋白表达均出现不同程度的降低,提示其发生了离子通道重构,但维拉帕米能明显抑制快速起搏早期离子通道重构的发生。

牵张刺激对乳大鼠心房肌细胞瞬时外向钾电流和内向整流钾电流的影响

目的:探究牵张刺激对乳鼠心房肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)、内向整流钾电流(IK1)和动作电位时程(APD)的影响。方法:取1日龄SD乳大鼠心脏,分离、消化获得心房肌细胞。于细胞牵引装置培养24 h分组:对照组不予牵张刺激;牵张组予增加12%硅胶膜面积牵张刺激24 h。膜片钳全细胞记录方法记录细胞膜Ito、IK1和APD的变化。结果:在+60 mV刺激电压水平,牵张组Ito密度与对照组相比明显降低[(1.6±0.4)pA/pF vs(12.1±2.9)pA/pF,P<0.01]。在-120 mV刺激电压下,牵张组IK1密度较对照组增大[(-10.8±0.8)pA/pF vs(-8.8±0.9)pA/pF,P<0.01]。牵张组动作电位复极50%(APD50)和复极90%(APD90)均较对照组明显缩短[(10.5±1.4)ms vs(15.5±2.4)ms,(30.0±2.8)ms vs(56.3±3.6)ms,P<0.01]。结论:牵张刺激可降低乳大鼠心房肌细胞Ito密度,增大IK1密度,缩短APD,这可能是压力负荷增大致心房电重构的基础之一。

二性霉素B与β-escin混合穿孔电极液在人心房肌细胞SK2电流记录中的应用

目的:为研究钙离子对人心房肌细胞小电导钙激活钾通道电流(ISK2)的调节作用,建立用二性霉素B(amphotericin B)与β-escin穿孔的膜片钳(PPR)技术。方法:体外循环术中取得右心耳,应用急性酶分离获得单个人体心房肌细胞,用二性霉素B和/或β-escin作为穿孔电极液,进行穿孔膜片钳实验,在此模式下测试钙离子对人心房肌细胞SK2电流的调控作用,并用胞内钙测试系统验证穿孔前后胞内钙变化。结果:混合使用穿孔电极液6.88μg/mlβ-escin和150μg/ml二性霉素B与单独用150μg/ml二性霉素B或6.88μg/mlβ-escin相比,前一种方法细胞容易封接,能形成稳定的穿孔膜片钳记录模式,可观察到SK2电流有激活,且胞内钙测试系统检测时可观察到穿孔后电极液至细胞内的游离钙离子浓度的增加,F340/380增强。结论:适当浓度的二性霉素B与β-escin混合使用进行穿孔膜片钳实验是一种稳定的全细胞膜片的记录技术,可以用于胞内游离钙离子对SK2电流调控的研究。