二甲亚砜诱导人骨髓基质干细胞心肌分化中的基因表达

目的 研究二甲亚砜 (dimethylsulfoxide ,DMSO)诱导人骨髓基质细胞 (humanbonemarrowstromalcells ,hBMSC)心肌分化过程中心肌特异转录因子和心肌基因的表达变化。方法 取第 8代hBMSC ,以DMSO诱导 2 4h。在诱导后 2 1天 ,通过免疫荧光染色检测干细胞标志CD90和肌性标志Desmin表达变化 ,并在诱导后1、2、3周提取RNA。以RT PCR方法检测细胞心肌特异转录因子 (Nkx2 .5和GATA4 )和特异基因 (connexin4 3、ANP等 )的表达变化。结果 经DMSO诱导后 ,MSC体积变大 ,细胞排列趋于一致 ,连接紧密 ,并逐渐形成肌节样结构 ,CD90阳性细胞减少 ,Desmin阳性细胞增加。在DMSO诱导hBMSC后 1周 ,开始可检测到细胞发生转录水平变化 (Nkx2 .5、GATA - 4表达和connexin4 3、ANP表达 ) ,并均可持续至诱导后 3周 ;前三者的表达量有随诱导后时间延长而增加的趋势。结论 DMSO在体外可诱导hBMSC向心肌前体细胞分化 。

外源表达Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化

目的:构建人Nkx2-5基因融合绿色荧光蛋白真核表达质粒pEGFP-N1-Nkx2-5,探讨外源性Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化的作用。方法:以真核表达质粒pEFSA-HA-Nkx2-5为模板,PCR扩增得到人Nkx2-5基因,将目的片段亚克隆到pEGFP-N1载体,鉴定正确。将重组质粒pEGFP-N1-Nkx2-5以脂质体法转染P19细胞,G418筛选2周,聚集4d,贴壁培养16d。以免疫细胞化学检测desmin、α-sarcomeric actin和cardiac Troponin T(cTnT)的表达。结果:将Nkx2-5基因正确插入pEGFP-N1载体,外源表达Nkx2-5基因可使P19细胞在无诱导剂、聚集条件下表达desmin、α-sarcomeric actin和cTnT蛋白。结论:成功构建真核表达质粒pEGFP-N1-Nkx2-5,外源表达Nkx2-5基因诱导P19细胞向心肌分化。

FGF-2诱导骨髓间充质干细胞获得心肌分化表型

目的观察碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,FGF-2)对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)定向分化的影响。方法分离培养大鼠BMSCs,利用浓度为25ng/mL的FGF-2诱导BMSCs分化,21d后观察细胞形态学变化,并采用免疫荧光染色法检测BMSCs中cTnI、a-sarcomeric actinin和MEF-2C等心肌特异性蛋白的表达,观察BMSCs获得心肌分化表型的情况。结果经FGF-2诱导后,BMSCs逐渐增大、变长,并开始形成肌管样结构;与对照组相比,FGF-2诱导组中部分MSCs可表达一系列心肌表面标记物,如心肌特异性cTnI蛋白等。结论FGF-2可诱导BMSCs获得心肌分化表型。

5-氮杂胞苷诱导骨髓源性心肌干细胞向心肌分化过程中心肌肌钙蛋白T的表达变化

目的研究5_氮杂胞苷诱导骨髓源性心肌干细胞(MCSC)向心肌分化过程中,心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达变化和超微结构。方法从SD大鼠骨髓间充质干细胞(MMSC)中筛选MCSC,用5_氮杂胞苷诱导向心肌定向分化。取分化后不同时间的细胞作cTnT免疫细胞化学染色,并对结果进行图像分析。透射电镜下观察分化细胞的超微结构。取不同发育期和成熟期的SD大鼠心肌作对比研究。结果用5_氮杂胞苷诱导后2周,细胞内开始表达cTnT;诱导后3周,cTnT表达增强,可见横纹样结构;诱导后4周,cTnT表达明显增强,横纹增多,但排列不规则。诱导后4周的细胞内出现心房粒,可见丰富的粗面内质网和糖原。胚胎11d大鼠的心肌内,横纹样结构较少且排列不规则。新生大鼠心肌内横纹增多,排列较规则。1月龄和3月龄心肌的横纹样结构发达,排列规则。诱导分化后4周的细胞cTnT表达特征与胚胎11d的心肌相似。结论MCSC经5_氮杂胞苷诱导后可分化为心肌细胞,表现为未成熟心肌的结构和功能特征。

三氯乙烯对人胚胎干细胞心肌分化的影响和机制

目的:探讨三氯乙烯(TCE)对人胚胎干细胞心肌发育分化的影响。方法:以人胚胎干细胞H9体外心肌定向分化为模型,分化培养液中添加不同剂量的TCE(分别为处理组100 ppb组,1 ppm组,10 ppm组)以及DMSO(对照组)。对诱导后形成的拟胚体以及不同发育阶段的细胞进行检测,通过MTT法测定细胞的生存能力,统计有自主节律跳动的拟胚体的数量;流式细胞仪计数分析细胞分化比例;荧光定量PCR检测心肌特异性基因表达;并应用基因芯片方法初步筛选检测三氯乙烯对心肌细胞钙离子通道相关的基因表达的影响。结果:TCE的三个浓度处理组均未显示细胞毒性,但高浓度组明显抑制向心肌细胞分化,能产生自主节律搏动的拟胚体比例显著降低,同时心肌特异性标记物c Tn T表达随剂量的增加而显著降低。在具有自主节律性的拟胚体中,钙离子通路的相关基因表达受到影响。结论:推测TCE通过降低成熟心肌的比例,以及影响心肌细胞中钙离子通道相关基因表达来共同导致心脏发育异常。

多氯联苯对P19细胞向心肌分化进程的影响

目的探讨多氯联苯对P19细胞向心肌分化进程的影响。方法在P19细胞向心肌细胞分化的培养液中加入多氯联苯(Aroclor 1254)2.5μmol/L,同时设立阴性对照组。显微镜下连续观察P19细胞形态的变化,并采用实时荧光定量RT-PCR技术对分化过程的第0、4、10天中GATA4及Nkx2.5基因mRNA的表达水平进行检测。结果在分化全程(0～10天),实验组与对照组无细胞形态上的差别;而GATA4、Nkx2.5基因的表达量除在分化开始前(第0天)差异无统计学意义外,在分化中期(第4天)及末期(第10天),实验组中GATA4、Nkx2.5基因的相对表达量均显著低于对照组。结论多氯联苯可通过对早期心脏发育相关重要基因的表达影响心肌分化进程。

5-氮胞苷诱导外源表达Nkx2-5的P19细胞向心肌分化的研究

目的研究在单层培养条件下,5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)诱导表达Nkx2-5的P19细胞向心肌分化的可能性和效率。方法实验分为实验组和对照组,实验组细胞为稳定表达Nkx2-5的P19细胞,对照组为P19细胞。2组细胞均在单层培养条件下,以5-aza(1μmol/L)诱导。倒置显微镜观察细胞的生长状态;诱导4、8、12、16d,Western blot检测α-sarcomeric actin和cTnT的表达;并用免疫荧光双标检测α-sarcomeric actin和cTnT的共表达。结果实验组和对照组细胞在5-aza诱导下,生长缓慢,死亡细胞数目增多。随贴壁细胞密度增加,形成类似于聚集体贴壁生长的状态,中心细胞小、密集,周边细胞呈放射状排列,胞体长梭形,伸出突起。实验组诱导8、12、16d检测到α-sarcomeric actin和cTnT2种蛋白的表达和共表达,表达量呈增多趋势;诱导12、16d时α-sarcomerica ctin的表达量与8d比差异有统计学意义(P<0.01),诱导16d的表达量与12d比差异有统计学意义(P<0.01);cTnT在诱导12、16d的表达量与8d比差异有统计学意义(P<0.01)。对照组没有2种蛋白的表达和共表达。结论5-aza可诱导单层生长的表达Nkx2-5的P19细胞向心肌分化。

心肌分化过程中经典Wnt信号促进Isl1表达

ISL1是第二生心区的分子标志,在心血管发育中发挥重要作用.在心脏发育过程中,Isl1的表达具有鲜明的时空特异性.本研究利用P19CL6畸胎瘤干细胞作为心肌分化模型,探讨了Isl1在心肌诱导分化过程中的时间特异性表达及经典Wnt信号通路对其的调控.研究发现,Isl1在心肌分化早期高表达,于诱导第4 d到达高峰,随后快速下调.其表达趋势与经典Wnt通路的激活模式具有时间上的同步性.通过加入Wnt3a蛋白及Li Cl激活经典Wnt通路,能够促进Isl1基因的表达,而Wnt通路抑制分子Frizzled-4/Fc和DKK1能够下调Isl1表达.β-catenin过表达及RNAi实验也获得相似的结果.染色质免疫共沉淀实验证实,Wnt通路效应分子LEF1,在细胞分化第4 d与其在Isl1基因启动子上游-2 300 bp处的结合增强,因而促进了Isl1基因的表达.本研究表明,经典Wnt信号能够通过LEF1/β-catenin与Isl1启动子特异结合,调控Isl1基因在心肌早期分化阶段的表达.

脂肪间充质干细胞CD73亚群心肌分化能力评价

目的探讨CD73+和CD73-脂肪间充质干细胞(ADMSCs)两个亚群向心肌分化能力的差异,筛选出心肌分化优势亚群,为进一步开展细胞治疗心肌疾患提供实验参考。方法流式细胞仪分选CD73+/CD73-ADMSCs亚群,HE染色观测其形态。体外5-氮杂胞甙(5-aza)诱导CD73+/CD73-亚群,免疫荧光法检测心肌特异性肌钙蛋白T(c Tn T),Real-time PCR检测c Tn T、Gata-4变化;4’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)标记两个亚群后,移植到大鼠心肌内,免疫荧光法检测移植细胞c Tn T表达。结果 CD73+ADMSCs形态以小细胞为主呈细长形或纺锤状,CD73-细胞以宽大扁平或方形等为主。体外成心肌诱导后,CD73+ADMSCs心肌特异性c Tn T表达率为45.5%、CD73-亚群为5.75%,基因水平上CD73+亚群表达c Tn T、Gata-4明显高于阴性亚群(P<0.01)。体内CD73+亚群较阴性亚群高表达c Tn T。结论 CD73+ADMSCs较CD73-ADMSCs具有更高向心肌分化的潜能,CD73+ADMSCs可能更具有心肌治疗的前景。

5-氮胞苷诱导单层P19细胞向心肌分化

目的:研究Nkx2-5基因在5-氮胞苷(5-aza)诱导单层P19细胞向心肌分化中的作用.方法:实验分实验组和对照组,实验组细胞为稳定表达Nkx2-5的P19细胞,对照组为P19细胞.两组细胞均单层培养,以5-aza(1μmol/L)诱导,倒置显微镜观察细胞的生长状态;5-aza诱导的4,8,12,16d,免疫细胞化学检测横纹肌α-actin(α-SA)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达;取5-aza诱导16d的细胞透射电镜观察超微结构的变化.结果:实验组5-aza诱导的8,12,16d检测到α-SA和cTnT的阳性表达,表达量逐渐增多.对照组没有两种抗体的阳性表达;实验组5-aza诱导16d,电镜观察发现部分相邻细胞分化出细胞连接和心肌发育早期的闰盘结构,胞质中出现密集平行排列肌丝样结构.对照组没有发现分化的细胞.结论:外源表达Nkx2-5基因促进P19细胞单层生长时向心肌分化.

Wnt8a在小鼠胚胎心肌分化中的作用

目的研究Wnt8a在小鼠胚胎心肌分化中的作用。方法实验组以二甲基亚砜(DMSO)作为诱导剂,对照组以DMSO和Frizzled-8/Fc作为诱导剂,诱导小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化,检测分化过程中Wnt8a的表达,对比分化率。结果两组在分化第2,3,4天Wnt8a表达,分化细胞具有自动收缩性;实验组分化率为92.22%,对照组分化率为37.78%,差异性具有统计学意义。结论Wnt8a促进小鼠胚胎心肌分化。

细胞接触诱导骨髓间充质干细胞获得心肌分化表型的研究

目的观察不同浓度条件下,细胞接触对骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为心肌细胞(CM)的诱导作用。方法利用表达绿色荧光蛋白(GFP)的转基因大鼠的BMSCs与CM以不同比例(1∶1、1∶10、1∶20、1∶40)共培养1周,分别采用免疫荧光染色及流式细胞计数分析检测肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)、α-sarcom eric actin in和MEF-2C等心肌特异性蛋白,采用膜片钳技术检测分化细胞的电生理功能。结果在共培养条件下,部分GFP-BMSCs可表达一系列心肌表面标记物,如心肌特异性cTnI蛋白等,且获得心肌分化表型的数量随着CM数量的增加而增加。部分GFP-BMSCs与CM一起同步搏动,并可获得与CM相似的膜电位。结论细胞接触可诱导BMSCs获得有功能的心肌分化表型,其数量与心肌的数量不同浓度有相对的依赖性,随着心肌数量的增加而增加。

NKX2-5诱导P19细胞向心肌分化的研究

目的探索NKX2-5在心肌分化中的作用和机制。方法实验分转染组和未转染组,转染组为稳定表达NKX2-5的P19细胞,未转染组为P19细胞。两组细胞悬浮培养4d,形成聚集体后贴壁培养,于贴壁培养的4d、8d、12d、16d,免疫荧光双标和Western blot检测横纹肌α肌动蛋白(α-SA)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达;取贴壁培养16d的细胞透射电镜观察细胞超微结构变化。结果转染组α-SA和cTnT两种蛋白在聚集体贴壁4d时没有表达,8d、12d、16d出现表达和共表达。转染组部分细胞出现幼稚的细胞连接和肌丝样结构;未转染组没有发现两种蛋白的表达,电镜观察未发现分化的细胞。结论稳定表达NKX2-5基因的P19细胞可向心肌分化,但不适于作为心脏发育的体外模型。

Wnt3a在小鼠胚胎心肌分化中的作用

目的:探讨Wnt3a在小鼠胚胎心肌分化中的作用。方法:检测Wnt3a在小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化过程中的表达和作用。实验组以二甲基亚砜(DMSO)作为诱导剂,对照组以DMSO和Frizzled-8/Fc作为诱导剂,诱导小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化,检测分化过程中Wnt3a的表达,对比分化率。结果:两组在分化第二、三、四天Wnt3a表达,分化细胞具有自动收缩性;实验组分化率为91.67%,对照组分化率为37.50%,两组差异有显著性。结论:Wnt3a能够促进小鼠胚胎心肌分化。

APJ在hESCs定向心肌分化过程中的表达特征

目的在人胚胎干细胞（h ESCs）定向心肌分化过程中,以中胚层阶段（d2）、心肌细胞起始分化阶段（d3）、心肌细胞后分化阶段（d7）为时间节点,探索APJ的表达特征。方法 h ESCs经单层培养后,应用化学成分明确的诱导分化培养基定向诱导h ESCs向心肌细胞分化,再于d2、d3、d7阶段分别进行细胞免疫荧光检测,共聚焦显微镜观察Brachyury T、mesp1、Nkχ2.5与APJ的蛋白表达情况,实时荧光定量PCR法检测4种标志物mRNA的表达水平。结果诱导d7开始出现跳动的细胞,跳动细胞数量d7~d16逐渐增加,d16达高峰。细胞免疫荧光结果显示跳动的细胞心肌特异性标志物a-Actinin、c TNNT2表达阳性,并可见到明显的肌节及润盘结构;APJ在d2、d3、d7阶段分别与阶段特异性标志物Brachyury T、mesp1、Nkχ2.5共表达。3个阶段中APJ mRNA呈持续性表达,在中胚层起始时表达最高,中胚层后表达逐渐降低。结论 APJ与代表h ESCs心肌分化过程中的阶段特异性标志物Brachyury T、mesp1、Nkχ2.5共表达,证实APJ在人心肌细胞发育的整个过程中持续性表达。

骨髓间充质干细胞亚群心肌分化基因的筛选

目的利用基因芯片筛选小鼠骨髓间充质干细胞4个亚群的差异表达基因,寻找心肌分化特异性基因。方法将小鼠骨髓间充质干细胞通过CD45和CD31的磁珠分选,获得SCA-1^＋/CD45^-/CD31^-、SCA-1^＋/CD45^-/CD31^＋、SCA-1^＋/CD45^＋/CD31^＋及SCA-1^＋/CD45^＋/CD31^-4群细胞。采用基因芯片技术完成Agilent小鼠全基因4＊44K芯片表达谱基因检测,分析差异表达基因。根据基因芯片中所检测的基因表达量在SCA-1^＋/CD45^＋/CD31^＋亚群中最高,且为其他亚群表达量的两倍以上为原则,通过RT-PCR验证各亚群及未分选细胞中的差异基因的表达量。结果根据皮尔森关联算法计算4组细胞亚群之间的关联值位于0.979～0.995之间,通过RT-PCR检测发现,Rock2基因在SCA-1^＋CD45^-CD31^-亚群中表达最高,而在SCA-1^＋CD45^＋CD31^＋亚群中表达很低,Itga4在未分选群中表达最高;Cxadr在SCA-1^＋CD45^-CD31^-亚群中表达最高;Epor在SCA-1^＋CD45^-CD31^＋亚群中表达最高;myl3在SCA-1^＋CD45^＋CD31^＋亚群中表达最高。结论 Rock2、Cxadr、Itga4、Epor和myl3基因在干细胞亚群向心肌分化中发挥不同作用。

Foxa2调控P19胚胎癌细胞心肌分化过程的分子机制

目的:研究转录因子forkhead box A2(Foxa2)在P19胚胎癌细胞心肌分化过程中的作用及其分子机制。方法:运用在P19细胞胚胎小体(embryoid bodies,EBs)培养基中加入二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)的方法将P19细胞诱导分化成心肌细胞,运用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)方法检测诱导分化过程中不同时间点细胞样本中胚胎性干细胞多能性相关基因(Nanog)、心肌分化相关基因[Cerberus1(Cer1)和Sonic Hedgehog(Shh)]及Foxa2的mRNA水平,用免疫荧光染色的方法检测分化成熟的心肌细胞。同时分别运用转染真核表达质粒pCMV-rFoxa2(大鼠Foxa2)和构建稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)-rFoxa2 P19细胞株的方法以提高P19细胞中Foxa2的表达水平,采用RT-PCR和Western印迹的方法检测上述细胞样本中多能性相关基因和心肌分化相关基因的mRNA和蛋白水平,及其EBs分化体系中心肌分化相关基因的mRNA水平。结果:P19细胞经DMSO诱导后分化形成心肌细胞,并伴随有Foxa2的表达激活。转染pCMV-rFoxa2质粒能在P19细胞中瞬时高量表达rFoxa2并激活其下游Cer1的转录。运用稳定表达GFP-rFoxa2的P19细胞株增高Foxa2的表达可以抑制Nanog的表达,并激活Shh的表达,促进P19细胞EBs心肌分化,表达Cer1和心脏α肌动蛋白(actin,alpha cardiac muscle 1,Actc1)。结论:Foxa2参与P19细胞心肌分化过程,Foxa2在DMSO诱导P19细胞心肌分化过程中的作用机制可能为直接抑制Nanog的表达,并激活Cer1和Shh的表达。

hHO-1联合GATA-4修饰大鼠骨髓间充质干细胞抗凋亡及向心肌分化的实验研究

目的探讨经人血红素加氧酶1(hHO-1)基因和GATA-4基因联合修饰的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在缺血缺氧环境中抗凋亡及体外分化为心肌细胞样细胞的能力是否优于hHO-1或GATA-4单基因修饰的BMSCs。方法采用全骨髓贴壁法分离、培养BMSCs并进行鉴定,重组腺病毒转染BMSCs,Western blotting法确定基因表达的最佳时间;以缺氧无血清条件模拟体内缺血缺氧微环境培养基因修饰的BMSCs,采用CCK-8试剂盒和台盼蓝染色法分别检测缺血缺氧培养12、24、48、72h细胞存活率,流式细胞术检测缺血缺氧培养24h细胞凋亡情况,Western blotting及细胞免疫荧光法检测特异性心肌肌钙蛋白I(cTnI)表达情况。结果缺血缺氧培养12、24、48、72h的hHO-1+GATA-4组细胞生存率均高于hHO-1组(P<0.05)和GATA-4组(P<0.05)。缺血缺氧培养24h的hHO-1+GATA-4组细胞凋亡率低于hHO-1组(P<0.05)和GATA-4组(P<0.05);GATA-4组与hHO-1+GATA-组的c Tn I表达差异无统计学意义。结论 hHO-1与GATA-4联合修饰可明显增强缺血缺氧BMSCs的存活;与GATA-4单基因修饰相比,联合修饰并没有增强BMSCs向心肌细胞分化的能力。

干细胞心肌分化的表观遗传学机制

表观遗传学是一门新兴的遗传学分支,研究细胞核内DNA序列没有改变的情況下,基因功能的可逆的、可遗传的改变。表观遗传学调控机制涉及DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰、染色质重塑和微小RNA调控等领域。有研究表明干细胞心肌分化过程中伴随着表观遗传学的改变,促进干细胞表观遗传修饰发生改变的药物可以诱导干细胞心肌分化,表观遗传学机制已成为目前研究干细胞心肌分化机制的热点,为干细胞在发育生物学、遗传学和再生医学等领域的应用提供了新的理论依据和手段。

miR-148a通过DNMT1调控MSCs向心肌分化的内在作用机制研究

目的:验证DNA甲基转移酶1(DNMT1)是miR-148a直接调控的靶基因,探究miR-148a通过靶向DNMT1调控骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌分化的作用机制。方法:MSCs细胞经5'-氮胞苷(5'-aza)诱导向心肌分化后,使用miRNA芯片筛选出诱导前后表达差异的miRNAs。Targetscan软件分析异常表达的miR-148a的靶基因,将野生型或突变型DNMT1的3'-UTR区域克隆到荧光素酶报告基因的下游(DNMT1-wt或DNMT1-mut)并分别与miR-148a mimics(miR-148a模拟物)或scramble(miR-148a阴性对照)共转染,荧光素酶报告基因实验验证所预测的靶基因DNMT1,qRT-PCR和Western blot分别检测转染miR-638 mimics和scramble后,对DNMT1的mRNA和蛋白表达的影响。构建miR-148a慢病毒质粒,分别在转染到MSCs后的第1、7、14和28天后检测miR-148a对GATA结合因子4(Gata-4)基因上游DNA调控序列CpG甲基化水平的影响、qRT-PCR和Western blot分别检测转染miR-148a慢病毒质粒后对心肌特异蛋白:球蛋白重链(MHC)和心脏肌钙蛋白T(cTnT)、MSCs分化特征蛋白CD90和CD29表达的影响,以及对心肌特异转录因子心脏特异性同源盒基因(Nkx2.5)和Gata-4表达的影响。结果:miRNA芯片筛选5'-aza诱导MSCs向心肌分化后表达异常的miRNAs,包括miR-146a-5p、miR-148a、miR-539等,其中miR-148a表达明显上调。Targetscan、荧光素酶报告基因实验和qRT-PCR验证DNMT1是miR-148a直接调控的靶基因。miR-148a慢病毒感染MSCs细胞,证实在转染的不同时间,Gata-4上游基因甲基化水平发生改变,且随着转染时间延长,Gata-4甲基化水平呈不断降低趋势,MSCs细胞内MHC和c Tn T表达提高,CD90和CD29表达降低,Nkx2.5和Gata-4表达提高,MSCs细胞出现向心肌分化。结论:miR-148a可通过靶向调控DNMT1而调控MSCs细胞的向心肌分化。