复方丹参滴丸含药血清诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

目的观察复方丹参滴丸含药血清体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的能力。方法采用全骨髓直接贴壁的方法分离培养大鼠MSCs,流式细胞仪鉴定细胞表面标记;采用复方丹参滴丸的含药血清体外定向诱导第四代MSCs,应用免疫细胞化学法、原位杂交组织化学法、透射电子显微镜鉴定心肌样细胞。结果大鼠MSCs细胞表面抗原CD90、CD106阳性,CD34、CD45、CD31阴性。经复方丹参滴丸含药血清诱导向心肌样细胞分化后,免疫细胞化学法显示α辅肌动蛋白(α-Actinin)、结蛋白(desmin)强阳性,原位杂交组织化学法显示肌球蛋白重链(MHC)强阳性表达。结论复方丹参滴丸含药血清能促使MSCs分化为心肌样细胞,为中药干预MSCs治疗缺血性心脏病提供干细胞实验依据。

人脐带间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究

目的探讨人脐带间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化可能性,为心肌细胞移植探索新细胞来源。方法采用5-氮杂胞苷(5-Aza)和二甲基亚砜(DMSO)诱导人脐带间充质干细胞分化。观察诱导后分化细胞形态变化,用免疫组织化学方法检测分化心肌样细胞的心肌肌钙蛋白I(troponin I)、心肌肌钙蛋白T(troponin T)和心肌结蛋白(desmin),逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定分化的心肌样细胞是否有细胞心肌特异转录因子(Nkx2.5)和心肌细胞desmin的cDNA表达。结果人脐带MSCs经5-Aza和DMSO诱导后可向心肌样细胞分化,分化细胞表达心肌细胞的标记troponinI、troponinT和desmin。RT-PCR检测证实,人脐带MSCs诱导前不表达Nkx2.5和desmin,经5-Aza和DMSO诱导后表达心肌细胞标记Nkx2.5和desmin。结论人脐带间充质干细胞可以分化为心肌样细胞,5-Aza和DMSO可作为心肌细胞诱导剂,人脐带间充质干细胞可以作为心肌细胞的来源。

地黄低聚糖诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的观察地黄低聚糖(RGOs)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化为心肌样细胞的作用。方法采用贴壁培养法分离大鼠MSCs,反复传代及纯化后,取第8代MSCs进行分组诱导:RGOs组(RGOs终浓度100μg/ml)、5-氮胞苷(5-Aza)组(5-Aza终浓度10μmol/L)、RGOs+5-Aza组和空白对照组。诱导后继续培养4周。采用Access化学发光法和干化学法分别检测诱导后MSCs内心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)和心肌酶CK、CK-MB的表达,免疫荧光法和Western blotting法检测诱导后MSCs内cTnI、缝隙连接蛋白43(Cx43)的表达。结果诱导后各组MSCs均表达cTnI、CK和CK-MB,RGOs+5-Aza组中CK、CK-MB的表达水平较RGOs组、5-Aza组增高,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光结果显示:在未诱导MSCs的空白对照组中未发现cTnI、Cx43阳性细胞,各诱导组MSCs均可见cTnI阳性细胞和Cx43阳性细胞,且RGOs+5-Aza组cTnI、Cx43荧光强度较RGOs组、5-Aza组增高。Westernblotting结果显示空白对照组无阳性条带出现,各诱导组均出现cTnI和Cx43阳性条带,且RGOs+5-Aza组cTnI和Cx43表达量较RGOs组、5-Aza组增高。结论RGOs可以在体外诱导大鼠MSCs分化为心肌样细胞,与5-Aza联合应用后其诱导MSCs内心肌特异性物质表达的作用较单药更强。

人羊膜上皮细胞有向心肌样细胞分化的特性

目的:通过体外诱导分化实验,评价人羊膜上皮细胞向心肌样细胞分化的能力。方法:实验于2005-09/2006-12在贵州省细胞工程重点实验室完成。①对象:经产妇知情同意,无菌采集健康足月剖宫产胎盘6份,实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法:采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离,D-Hank’s液冲洗后剪成碎片,加入含有0.2g/L乙二胺四乙酸的0.5g/L胰蛋白酶溶液,离心、消化、过滤,收集滤液,加入胎牛血清终止消化,重复消化2次。合并3次消化所得的细胞悬液,离心后将细胞沉淀悬浮于L-DMEM培养基中,按1.25×108L-1密度接种,常规培养3d后更换培养基,待细胞达80%～90%融合后用胰蛋白酶+乙二胺四乙酸联合消化,终止后离心弃上清,细胞沉淀用培养基重新悬浮,按1×107L-1密度传代。③实验评估:用流式细胞仪鉴定人羊膜上皮细胞表型;使用10μmol/L5-氮杂胞苷和1mmol/L抗坏血酸磷酸盐诱导第2代人羊膜上皮细胞,免疫荧光染色法检测诱导后细胞中特异蛋白结蛋白和α-辅肌动蛋白的表达,RT-PCR检测心肌特异性转录因子Nkx2.5、GATA-4和心肌特异性收缩蛋白α-肌球蛋白重链mRNA的表达。结果:①人羊膜上皮细胞的免疫组化特征:人羊膜上皮细胞几乎不表达CD44,不表达波形蛋白,表达角蛋白19。②人羊膜上皮细胞α-辅肌动蛋白和结蛋白的表达:人羊膜上皮细胞经诱导分化后,表达肌系细胞标志α-辅肌动蛋白和结蛋白。③人羊膜上皮细胞Nkx2.5、GATA-4和α-肌球蛋白重链mRNA的表达:人羊膜上皮细胞经诱导分化后,表达心肌特异性转录因子Nkx2.5 mRNA和GATA-4 mRNA,心肌特异的可收缩蛋白α-肌球蛋白重链mRNA未见表达。结论:通过胰蛋白酶消化法分离获得的人羊膜上皮细胞具有向心肌样细胞分化的特性,可能成为细胞心肌成形术的候选供体细胞。

三七总皂苷对骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的作用

目的探讨三七总皂苷(PNS)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分化为心肌样细胞。方法采用骨髓细胞体外培养技术分离大鼠MSCs,用流式细胞仪检测细胞表面标志,用第8代MSCs进行体外心肌细胞诱导分化,采用相差显微镜、免疫组化及RT-PCR鉴定心肌细胞。结果大鼠MSCs细胞表面抗原CD44阳性,CD34阴性;经PNS体外诱导后细胞形态发生变化,其细胞免疫组化呈结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白(cTnI)阳性;RT-PCR显示诱导后细胞转录肌球蛋白重链mRNA水平增加。结论大鼠MSCs体外在PNS诱导下可分化为心肌样细胞,为应用MSCs治疗心肌损伤提供了动物实验方法。

心肌组织裂解液诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:干细胞具有"环境依赖性分化"特性,以心肌组织裂解液模拟心肌微环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞方向分化的研究甚少。目的:观察心肌组织裂解液对大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞方向分化的影响。方法:选用生长良好的第2代骨髓间充质干细胞,加入诱导液连续培养5周,连续观察细胞形态学特征的变化规律,采用α-Actin进行免疫细胞化学染色观察干细胞是否向肌细胞方向分化,收集诱导后的细胞行苏木精-伊红染色观察是否存在闰盘,并通过电镜观察其超微结构。结果与结论:加入诱导液后大部分细胞呈"竹节样",α-Actin免疫细胞化学染色阳性,表明间充质干细胞向肌细胞方向分化;苏木精-伊红染色可见闰盘,透射电镜下见排列整齐明暗相间的肌丝,扫描电镜下可见胞浆内有纤维状结构,说明"竹节样"细胞具有心肌细胞的典型形态结构特点。连续诱导12d多个区域出现成片的、具有自律性搏动的多核肌管结构。心肌组织裂解液可模拟心肌细胞的微环境,诱导骨髓间充质干细胞分化为具有典型形态结构特征和相应功能活动的心肌样细胞。

人羊膜间充质细胞具有向心肌样细胞分化的特性

探讨人羊膜间充质细胞(human amniotic mesenchymal cells,hAMCs)向心肌细胞分化的能力。采用胶原酶消化法分离hAMCs,用流式细胞仪进行表型鉴定;用5-氮杂胞苷和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导hAMCs向心肌细胞分化,免疫荧光染色法检测诱导后细胞中特异蛋白结蛋白和α-辅肌动蛋白的表达,RT-PCR检测心肌特异性转录因子Nkx2.5、GATA-4和心肌特异性收缩蛋白α-肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain,α-MHC)mRNA的表达。结果显示:(1)hAMCs原代培养至第6d,贴壁细胞汇合度可达80%,呈漩涡状生长。传代后hAMCs增殖迅速,3～4d细胞汇合度可达100%,细胞呈梭形或多角形。(2)hAMCs表达CD44和波形蛋白,不表达CK19。(3)hAMCs经诱导分化8～10d后细胞排列紧密,多为长梭形。hAMCs诱导2w和4w表达α-辅肌动蛋白和心肌特异性转录因子Nkx2.5。(4)诱导前后的hAMCs均表达结蛋白和GATA-4,但均未见α-MHC表达。说明hAMCs具有向心肌样细胞分化的能力,可望成为细胞心肌成形术(cellular cardiomyoplasty,CCM)的候选细胞。

人脐带间充质干细胞经体内定植并向心肌样细胞分化的研究

目的探讨人脐带间充质干细胞(MSCs)移植到大鼠心肌后能否存活并向心肌样细胞分化,为心肌细胞的移植探索新的细胞来源。方法从人脐带华尔通氏胶分离、培养MSCs,检测人脐带来源的MSCs的细胞表面标记。用5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)标记人脐带间充质干细胞,标记细胞移植到梗塞大鼠心肌,观察移植后2周细胞能否存活,移植细胞能否向心肌样细胞分化,表达心肌细胞标记物troponinI及troponinT。结果人脐带间充质干细胞移植到心肌梗塞模型大鼠心肌后细胞能存活,并表达心肌细胞标记物troponinI及troponinT。结论人脐带间充质干细胞移植至体内能存活并分化为心肌样细胞,人脐带间充质干细胞可能作为心肌细胞移植的来源。

microRNA-1诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的研究microRNA-1(miRNA-1)能否诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化。方法构建大鼠miRNA-1表达载体,分离扩增培养及鉴定大鼠MSCs。脂质体法转染大鼠第4代MSCs,实时定量RT-PCR(qRT-PCR)检测转染miRNA-1质粒后MSCs的miRNA-1表达水平。分别于转染2、4和6 d后用RT-PCR检测心肌重要转录因子GATA4、NKx2.5和MEF2C的mRNA表达,免疫荧光检测心肌特异蛋白I(cTnI)的表达。结果 90%以上的MSCs表达MSCs重要标志物CD29、CD44;未检测到造血前体细胞标志抗原CD34、白细胞标志抗原CD45的表达。转染miRNA-1质粒后,miRNA-1表达水平明显上调。转染miRNA-1质粒2、4和6 d后,GATA4、NKx2.5和MEF2C的mRNA表达逐渐增强。第4和6天后可见cTnI阳性表达细胞。结论 miRNA-1能诱导大鼠MSCs向心肌样细胞分化。

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的探讨用5-氮胞苷(5-aza)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的最佳条件。方法用Percoll密度梯度离心法分离培养、纯化大鼠MSCs,取第3代MSCs随机分为A、B、C 3组,分别加入5、10、20μm ol/L5-aza;每组分别孵育12、24、48 h,继续培养28 d。相差显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测细胞肌动蛋白(α-ac-tin)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达,并通过W estern印迹法对细胞cTnT进行定量分析。结果MSCs经5-aza诱导培养28 d后,电镜下见细胞胞浆有散在肌丝样结构,免疫组化检测α-actin和cTnT表达均呈阳性;5μm ol/L的5-aza孵育48 h、10μm ol/L孵育24 h培养28 d的细胞cTnT表达量与10μm ol/L的5-aza孵育48 h、20μm ol/L 3种孵育时间各组比较无显著性差异,且细胞生物学特性未受到明显影响。结论MSCs在体外经5-aza诱导后可分化为心肌样细胞;5μm ol/L的5-aza孵育48 h和10μm ol/L的5-aza诱导24 h是MSCs体外诱导分化心肌样细胞的理想条件。

不同浓度Wnt-11诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞定向分化的实验研究

目的探讨Wnt-11体外诱导骨髓间充质干细胞(BMMSCs)分化为心肌样细胞的最适浓度。方法采用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMMSCs,取第2代BMMSCs培养48h后进行定向诱导,根据Wnt-11终浓度的不同分为A组(100ng/mL),B组(200ng/mL),C组(400ng/mL)和D组(空白对照组),诱导72h后更换为完全培养液继续培养4周,D组仅用完全培养液培养。倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态学变化。运用流式细胞仪检测技术对BMMSCs表面联合标记物进行鉴定。各组细胞培养至第4周时,运用免疫细胞化学染色技术检测结蛋白(Desmin)、间隙连接蛋白43(Connexin43)及心肌肌钙蛋白I(cTnI)的表达情况。运用透射电镜观察分化细胞的超微结构变化。实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测各组细胞在诱导后培养第1、2、4周时心肌早期转录因子GATA-4、Nkx2.5及α-MHC的表达。结果 1原代BMMSCs于第2周形成集落,多呈梭形、星形,少数形状不规则。传代后细胞体积变大,诱导后细胞多为长梭形,呈一致性生长。2流式细胞仪检测技术对BMMSCs表面联合标记物的鉴定结果显示CD29、CD45、CD90的阳性表达率分别为97.9%、0.4%和99.5%。3免疫细胞化学染色技术检测结果显示:诱导后常规培养至第4周,A组、B组、C组细胞胞质均呈阳性表达Desmin、Connexin43和cTnI,而D组细胞呈弱阳性或阴性表达,B组细胞的阳性表达率均最高,差异具有统计学意义(P<0.05)。4透射电镜结果显示:各诱导组细胞于诱导后常规培养至第4周,胞质内可见平行排列的肌丝及亚细胞结构如线粒体、粗面内质网和核糖体。5RT-qPCR检测结果显示:BMMSCs经诱导后,常规培养第1周时各诱导组细胞均表达GATA-4及Nkx2.5基因,在第2周时表达减弱,在第4周时表达增强,就基因表达而言,三个诱导组相比较,B组明显优于其他两组(P<0.05)。α-MHC基因在诱导后常规培养期间均不表达。对照组细胞在常规培养期间GATA-4及Nkx2.5基因的表达量为1,而不表达α-MHC基因。结论 Wnt-11可在体外诱导SD大鼠BMMSCs定向分化为心肌样细胞,其诱导分化最适浓度为200ng/mL。

不同诱导条件对体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响

目的:已证实骨髓间充质干细胞体内移植能改善心脏功能,但其机制尚不清楚。观察不同诱导条件对骨髓间充质干细胞体外分化为心肌样细胞的影响。方法:实验于2005-05/2006-04在南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所完成。①实验材料:健康供体骨髓(自愿捐赠),孕16周水囊引产胎儿(胎儿家属同意捐赠)。②实验方法:取健康供体骨髓,采用淋巴细胞分离液并结合骨髓间充质干细胞贴壁特性分离细胞。取第4代骨髓间充质干细胞进行诱导实验,分为生物诱导组和化学诱导组。生物诱导组分别采用胚胎心肌细胞与骨髓间充质干细胞直接混合培养、胚胎心肌细胞与骨髓间充质干细胞间接混合培养及胚胎心肌细胞匀浆液诱导培养,化学诱导组用5,10,15μmol/L5-aza分别处理12,24,48h进行诱导。③实验评估:采用免疫细胞荧光染色法检测胞浆中的肌节肌动蛋白。结果:①骨髓间充质干细胞只有在其与胚胎心肌细胞直接混合培养时,才能分化为心肌样细胞,而在其他生物诱导模型下却未见其分化为心肌样细胞。②化学诱导组骨髓间充质干细胞经免疫细胞荧光染色鉴定后,均未见胞浆中有肌节肌动蛋白表达,证实经5-aza诱导处理后,未见骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞。结论:①胚胎心肌细胞可诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞,机械因素是促进骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞必不可少的因素之一。②骨髓间充质干细胞经5-aza诱导是否分化为心肌样细胞未能获得证实。

心脏营养素-1对骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的作用

目的观察心脏营养素-1(CT-1)是否能促进经诱导分化剂5-氮杂胞苷(5-aza)诱导的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)分化为心肌样细胞,并研究其相关机制。方法自成年大鼠骨髓中分离BMMSCs,分别以普通培养基(A组)、加入含CT-1的培养基(B组)培养、经5-aza诱导后加入普通培养基(C组)及5-aza加入含CT-1的培养基(D组)培养。观察细胞形态的改变,并通过免疫组化分析分化后细胞表达心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)的情况。电镜观察分化后细胞的超微结构及实时荧光定量检测α-actin、β-myosin heavy chain(β-MHC)、Nkx2.5、GATA4基因表达。结果C、D组的BMMSCs在培养4周后均形成心肌样细胞形态,并且均表达cTnT;D组BMMSCs分化的心肌样细胞形成了肌管样结构;D组α-actin、β-MHC、Nkx2.5、GATA4基因表达明显高于C组。结论CT-1可能通过对GATA4、Nkx2.5基因表达的调控而促进5-aza诱导的BMMSCs分化为心肌样细胞。

1,25-维生素-D3体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的最适浓度

目的探讨1,25-维生素D3(1,25-vitamin-D3)体外诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化的最适浓度。方法采用全骨髓贴壁法结合密度梯度离心法分离培养SD大鼠BMSCs,应用3、6、12、24 nmol/L 1,25-vitamin-D3对第2代BMSCs进行定向诱导,倒置相差显微镜下动态观察细胞生长状况。运用流式细胞仪对BMSCs进行鉴定。应用免疫细胞化学、免疫荧光及Western blotting法检测诱导后4周的BMSCs原肌球蛋白(TPM)、间隙连接蛋白43(Cx43)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达情况。运用透射电子显微镜观察分化细胞与心肌细胞类似的超微结构。在诱导后1、2和4周这3个时间点,以Real-time PCR法检测细胞心肌早期转录因子GATA结合蛋白4(GATA4)、Nkx2.5的表达。结果 1.倒置相差显微镜下观察,原代细胞培养72 h后,大部分细胞呈短梭形;培养1周后,细胞呈现出多样化的形态;诱导4周的BMSCs,相邻细胞间联系紧密,排列具有明显的方向性。不同浓度1,25-vitamin-D3诱导后的BMSCs,其数量及形态存在差异。2.流式细胞术的鉴定结果显示,CD29、CD45、CD90的阳性表达率分别为97.4%、3.3%和91.4%。3.免疫细胞化学、免疫荧光及Western blotting法检测不同浓度1,25-vitamin-D3诱导4周后的BMSCs均可见TPM、Cx43及cTnT的阳性表达,其中6 nmol/L组的表达均最高,而未诱导组细胞呈弱阳性或阴性表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.透射电子显微镜观察,细胞诱导培养至4周,胞质内可见较多平行排列的肌丝及线粒体、核糖体、粗面内质网等细胞器。5.Real-time PCR检测结果显示,GATA4及Nkx2.5基因于诱导后1周表达增强,2周表达减弱,4周表达增强;4个诱导组相比较,6 nmol/L组明显优于其他3组(P<0.05)。结论 1,25-vitamin-D3可以诱导BMSCs获得心肌分化表型,其诱导分化最适浓度为6 nmol/L。

与胎儿心肌细胞共同培养诱导人胚胎干细胞发生心肌样分化

目的了解与胎儿心肌细胞共同培养对人胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）向心肌方向分化的影响。方法通过酶消化法从流产胎儿中分离培养出胎儿心肌细胞及成纤维细胞，将后者用丝裂霉素处理后制备成滋养层；收集辅助生育中心施行试管婴儿后所剩余的健康胚胎，取内细胞团接种在滋养层上分离培养出人ESCs。用荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridzation，FISH）方法来检测上述两种细胞的XY染色体，选用不同性别的胎儿心肌细胞与2—5代人ESCs以1：2的比例混合，然后以5×10^4／cm^2的密度接种于培养皿中进行共同培养，诱导其向心肌方向的分化。将未与胎儿心肌细胞混合的人ESCs以相同密度接种于培养皿中作为阴性对照。至第5天收集共同培养的细胞，进行双重染色，即FISH染色及心肌特异性蛋白Desmin或cTnⅠ免疫组化染色。结果在与胎儿心肌细胞共同培养5d后，40％～50％的人ESCs在心肌细胞的诱导下表达心肌特异性蛋白Desmin或cTnⅠ，而没有进行共同培养的人ESCs不表达上述蛋白。结论与胎儿心肌细胞的共同培养能诱导人ESCs发生向心肌方向的分化，人ESCs有望成为心肌干细胞移植的细胞材料。

丁酸钠诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

背景:组蛋白乙酰化是诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的机制之一。目的:观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠对体外培养的骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响,并分析其诱导分化的机制。方法:分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行鉴定。取第2代骨髓间充质干细胞,应用1mmol/L丁酸钠诱导其向心肌样细胞分化。结果与结论:实验分离培养的骨髓间充质干细胞高表达CD90,CD29;低表达CD45,CD31。加入丁酸钠后细胞增殖能力及组蛋白去乙酰化酶活性明显降低,但未发生明显凋亡现象,表明丁酸钠具有低毒性的特征。real-timePCR检测显示,经丁酸钠诱导后细胞GATA-4,MEF-2c,β-MHC等心肌细胞早期标志基因表达率明显增高(P<0.05)。Westernblot检测发现,经丁酸钠诱导后细胞心肌细胞特异性蛋白连接蛋白43和肌钙蛋白T的表达明显增高。免疫荧光测得的肌钙蛋白T表达结果与Westernblot一致。说明丁酸钠能够有效诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,其机制可能与抑制组蛋白去乙酰化酶活性,增强组蛋白的乙酰化有关。

心肌直接接触诱导骨髓间充质干细胞成心肌样分化

目的应用新生大鼠心肌细胞(CM)与骨髓间充质干细胞(MSCs)体外共培养的方法模拟心肌内环境,研究模拟环境下MSCs分化为CM的相关因素及其适宜条件。方法利用CM与MSCS不同比例直接接触和非直接接触共培养的方法模拟心肌微环境,分析MSCS形态和结构蛋白表达等方面的变化。结果直接接触共培养的MSCS与CM同步搏动,表达心肌特异性肌钙蛋白T,且MSCs与CM等比例培养时分化率最高;而在缺乏直接接触条件下,单纯的CM条件培养液无法单独诱导MSCS的横向分化。结论与CM间的直接接触为诱导MSCS分化为CM的必需条件,共培养的细胞密度对于诱导分化率有影响,条件培养液则非关键因素。

脂肪基质干细胞诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的研究脂肪基质干细胞(ASCs)的分离、纯化、扩增以及在体外定向分化为心肌样细胞的能力。方法获取并培养正常人的ASCs,倒置显微镜下观察其形态;流式细胞仪检测其免疫表型。5-氮胞苷诱导ASCs在体外分化为心肌样细胞,倒置显微镜观察心肌样细胞的形态,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测心肌相关基因ANP、cTnT、cT-nI和αMHC的表达;免疫荧光法检测cTnT和结蛋白的表达;Western blot法检测Connexin 43的表达。结果ASCs呈纤维样贴壁生长,体外培养易扩增;ASCs表达相关抗原CD29和CD105,不表达CD31、CD34、CD45和HLA-DR;ASCs经5-氮胞苷的作用可呈现典型的心肌样细胞形态,ANP、cTnT、cTnI和αMHC基因及cTnT、结蛋白和Connexin 43均呈阳性表达。结论脂肪组织中分离培养的ASCs具有体外大量扩增并保持低分化状态的特性,以及定向分化为心肌样细胞的能力,有望成为治疗心肌梗死的种子细胞。

5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的:研究体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(mensenchymal stem cells,MSCs)经5-氮胞苷(5-aza)诱导定向分化为心肌样细胞形态学及分子生物学特征。方法:SD大鼠股骨骨髓经密度梯度离心及贴壁分离培养传代MSCs,体外用5-aza定向诱导向心肌样细胞分化。相差显微镜观察心肌样细胞形态学变化。免疫组化检测肌钙蛋白T(cTnT)、α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达。结果:密度梯度离心及贴壁法分离培养的MSCs生长稳定,增殖快。5-aza诱导后,部分细胞形态发生变化,有肌管样结构形成。随诱导后培养时间延长MSCs中cTnT、α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达逐渐增强。结论:密度梯度离心及贴壁分离培养可获得大量纯度较高的骨髓间充质干细胞。经5-aza诱导骨髓间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞。

5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的 :比较 5 -氮胞苷 ( 5 -azacytidine ,5 -aza)于不同浓度、不同孵育时间对骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSC)向心肌样细胞分化的影响 ;观察诱导后不同时间点心肌标志物的表达情况。方法 :体外分离培养Wistar大鼠MSC ,传代纯化后进行诱导实验。浓度分组 (C1-C4 ) :分别以 3、5、10、2 0 μmol/L5 -aza处理 2 4h ,之后更换新鲜培养基继续培养。时间分组 (T1-T5 ) :以 10 μmol/L分别孵育 6h、12h、2 4h、4 8h、72h ,之后更换新鲜培养基继续培养。各组均于首次加药 4周后行免疫细胞化学染色检测。RT -PCR检测 10 μmol/L5 -aza处理后 2、4、8周细胞GATA4mRNA、cTnTmRNA的表达情况。结果 :经 5 -aza诱导处理后 4周 ,C1-C4组Desmin及α -SarcomericActin染色阳性率各组比较均无统计学差异 (P >0 .0 5 ) ;而T1-T5各组其阳性率比较存在统计学差异 (P <0 .0 1)。RT -PCR显示 ,诱导后 2周 ,GATA4mRNA开始表达 ,持续至 8周 ;cTnTmRNA在诱导后 2周无表达、4周时弱表达 ,8周时更为显著。结论 :成年人鼠MSC在适当浓度 5 -aza处理后可以向心肌样细胞分化 ,在 3μmol/L～ 2 0 μmol/L范围内 ,5 -aza浓度的变化对MSC的分化率影响较小 ;在 4 8h内 ,适当延长 5 -aza的孵育时间可能增加MSC向心肌样细胞的转?