心肌片1号对柯萨奇病毒的抑制及对小鼠病毒性心肌炎的治疗作用

北京地区研究认为病毒性心肌炎为多病因性。病毒感染可突然死于急性心肌炎。病毒性心肌炎大多是由于柯萨奇B组病毒引起,其病毒对婴儿及儿童的心肌有亲合力,引起心肌炎。中药剂型心肌片1号其主要功效为活血化瘀,益气养心。临床用于治疗心悸、气短,胸闷以及病毒性心肌炎,收到了良好的疗效。为给临床提供依据,故对心肌片1号抗柯萨奇病毒进行了实验观察。

体外构建组织工程化心肌片层的实验研究

探索以液态胶原作为支架材料,体外构建组织工程化心肌片层的可行性。用含0.04%EDTA的0.25%胰酶分离新生大鼠原代心肌细胞,然后与Ι型胶原M、atrigel和2×DMEM混合,注入方形模具内,制备心肌细胞-胶原复合体,体外培育1周后,施加外力,拉伸刺激条件下继续培养1周。通过光学显微镜下观察H、.E.染色、激光共聚焦和透射电镜观察等对构建的组织工程化心肌片层进行评价。结果表明:心肌片层在培养的第2天出现自发性的跳动,随时间的延长,跳动的区域逐渐增多,并于外力拉伸后的第4天形成一致跳动。激光共聚焦研究结果表明:在构建的工程化心肌组织中,肌原纤维显示排列有序,多数沿拉伸方向伸展,其形态类似于心肌组织。电镜观察显示:拉伸的心肌片层中的心肌细胞含有较多的肌原纤维,肌小节结构和Z带清晰可见。采用新生大鼠心肌细胞与液态Ι型胶原复合方式,可在体外再造出片层状心肌组织,构建的组织工程化心肌片层具有与心肌组织类似的结构和特性。

心肌片通过抑制NF-κB p65信号通路发挥心肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的观察心肌片对缺血再灌注引起的心肌损伤的保护作用,研究其分子作用机制。方法结扎大鼠冠状动脉左前降支40min,再灌注2h,建立心肌缺血再灌注模型。cTnT、CK-MB、IL^(-1)、IL-6、TNF-α、MPO和ICAM-1的活性按照试剂盒说明书测定。采用蛋白质免疫印迹法检测心肌组织细胞浆和细胞核内NF-κB p65蛋白的表达情况。结果与模型组相比,心肌片预处理减轻了心肌损伤,降低了炎症因子水平,而这些保护作用可能与阻断NF-κB p65蛋白核转移有关。结论心肌片通过阻断NF-κB p65蛋白核转移从而减轻缺血再灌注引起的心肌炎症反应。

体外构建工程化心肌片层的实验研究

目的探索在体外构建工程化心肌片层的方法。方法用胶原、M atrigel、2倍DMEM分别与制备的乳鼠原代心肌细胞混合,注入方形槽内形成心肌片层,5 d后行动态力学拉伸继续培养1周。常规HE染色、免疫组化染色等对组织工程化心肌组织,即心肌片层进行评价。结果心肌片层在培养1 d出现点状自发性跳动,随时间的延长跳动的区域逐渐增多,强度逐渐增大,3 d出现不一致的局部跳动,拉伸2 d出现肉眼可见整个片层的一致性的节律性跳动。HE染色显示片层中细胞排列整齐与正常成年大鼠心肌组织类似,免疫组化结果显示有丰富的心肌细胞。电镜显示条带中的心肌细胞含有丰富的肌原纤维,肌节结构和Z线清晰可见。结论该方法可以成功构建类似天然心肌组织的工程化心肌片层。

心肌片对缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响

目的:观测心肌片对缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响及可能机制。方法:H9c2细胞随机分为对照组、模型组、心肌片低中高剂量组,预给药24h后,建立心肌缺血/再灌注损伤(MI/RI)模型。检测细胞存活率,LDH释放水平,蛋白印迹法检测心肌细胞凋亡相关基因Bax,Bcl-2,Caspase-3,Cyt-C蛋白的表达以及AMPK磷酸化水平。结果:与模型组比较,心肌片提高细胞存活率,减少LDH水平,稳定线粒体膜电位,减少Bax,Caspase-3以及Cyt-C蛋白的表达,增加Bcl-2蛋白的表达,提高Bcl-2/Bax的比值(P<0.05)。进一步研究发现,这些保护作用被AMPK抑制剂Compound C取消。结论:心肌片能减轻心肌缺血再灌注损伤,抑制心肌细胞凋亡,其机制可能通过激活AMPK信号通路实现的。

心肌补片:细胞来源、完善策略及最佳制作方法分析

背景:心肌补片是一种修复损伤心肌的有效方式,但目前使用哪种细胞制作心肌补片和如何使心肌补片在体内发挥最大的治疗效果还存在争议。目的:通过综述心肌补片的细胞来源和完善心肌补片的策略来寻找出制作心肌补片的最佳方法。方法:由第一作者应用计算机以“cell sheet,cell patch,cardiomyocytes,cardia progenitor cells,fibroblasts,embryonic stem cell,mesenchymal stem cells”等为英文检索词检索PubMed和Web of Science数据库;以“心肌补片,生物3D打印,心肌”为中文检索词检索中国知网和万方数据库,经过入组筛选后,最终纳入94篇文献进入结果分析。结果与结论:①心肌补片的细胞来源主要分为3类:分别是体细胞、单能干细胞和多能干细胞。心肌补片的细胞来源丰富,但是并不是所有的细胞都适合制作心肌补片,例如,成纤维细胞和骨骼肌母细胞制成的心肌补片会有致心律失常的风险,间充质干细胞在体内的作用时间短并且存在伦理方面的问题。随着诱导式多功能干细胞的发现,为制作心肌补片提供了一个可靠的细胞来源。②心肌补片的制作方法有两种:一种是使用细胞片技术,另一种是使用生物3D打印技术。细胞片技术可完整保留细胞外基质成分,可以最大程度地模拟细胞在体内的生长循环,但是想要通过细胞片技术获得具有三维结构的心肌补片还存在困难。而生物3D打印技术可以通过计算机个性化设计获得具有三维结构的心肌补片。③完善心肌补片的策略主要包括:多种细胞共同培养后制作成心肌补片、改进生物3D打印技术中的墨水配方和支架成分、提高心肌补片的治疗效果、抑制移植后的免疫排斥反应和完善干细胞的分化培养方案。④目前还没有制作心肌补片的最佳细胞来源和制作方法,单靠某一种细胞或者某一种技术所获得的心肌补片常无法达到预期的治疗效果,因此研究者们在制作心肌补片之前需要根据预期的治疗效果来选择合适的策略制作心肌补片。

针织导电心肌补片的构建及力电性能

为制备一种符合天然心肌组织力电性能的心肌补片,以聚己内酯(polycaprolactone, PCL)为原料,通过针织成型技术制备针织(knitting, Kt)补片,同时制备静电纺丝(electrospinning, Es)补片作为对照样,采用多巴胺(dopamine, DOPA)对Kt、Es补片进行表面改性,再通过表面原位聚合聚吡咯(polypyrrole, PPy)构建PPy@Kt、PPy@Es补片。通过立体显微镜、扫描电子显微镜、红外光谱仪、强力仪及数字源表对心肌补片的结构和物理化学性能进行表征,探究2种纺织成型技术对心肌补片力电性能的影响。结果表明:静电纺丝成型的PPy@Es补片沿取向方向模量大且导电稳定性差,而针织成型的PPy@Kt补片表现出更接近心肌组织的模量且具有力学各向异性,同时展现出优异的应变不敏感导电性,可满足心肌补片对动态应变下稳定导电性的要求。

上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心付炜团队利用蝴蝶翅膀和人诱导多能干细胞来源心肌细胞构建心肌补片

2023年4月14日,上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心付炜团队在Bioengineering&Translational Medicine在线发表题为Engineering a conduction-consistent cardiac patch with graphene oxide modified butterfly wings and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes的研究论文。该研究基于人体心脏心肌细胞定向排列和心肌细胞间一致性电传导的重要特征,利用氧化石墨烯修饰蝴蝶翅膀以增强其导电性能,并将经修饰改造的蝴蝶翅膀与人诱导多能干细胞来源心肌细胞结合构建电传导一致性心肌补片。

微电极阵芯片技术在心肌电生理研究中应用的可行性

目的探讨60极微电极阵芯片(MEA)技术在整体心脏、心肌组织片和培养心肌等电生理研究中的应用。方法①80只豚鼠,开胸取心脏并以2.5ml/min速度Langendorff灌流心脏20min,信号稳定后采样;②60只SD大鼠,开胸取心,剪取5mm×5mm大小的心脏组织片,置于MEA盘,台氏液间歇灌流5min,用5μV×1ms的刺激脉冲连续刺激,刺激间隔为1s,比较心房和心室组织片场电位(FPs)形态和传导时间;③20窝出生后3天以内的昆明小白鼠,消化分离心肌细胞,培养于MEA盘内,进行组织信号采样。结果①大鼠整体心脏灌流30～90min内能够记录到稳定的自主节律下的FPs信号,心室肌场电位时程(FPdur)210±78ms;心房肌FPdur164±58ms;房室传导时间320±150ms;并能记录到FPs激动顺序图。②心肌组织靶点取样,台氏液间歇灌流和电刺激下,组织的兴奋性可以稳定保持2h。心室肌组织片FPdur115.80±11.61ms,心房组织片FPdur83.71±6.48ms,刺激信号在心房组织片的传导时间66.46±6.73ms,心室组织片传导时间47.40±5.62ms;③小鼠乳鼠心脏原代培养心肌24h时后开始有散在、不同步的细胞克隆搏动和点状FPs信号,72h后细胞融合,开始记录到基本同步的群动和多位点FPs信号,培养心肌自发搏动频率150±100次/分。结论 MEA技术可以稳定记录小动物整体灌流心脏,心脏定点取样组织片,培养心肌细胞60极场电位和电传导特性。

有序PLCL电纺膜复合人诱导多能干细胞来源心肌细胞构建心肌补片的初步研究

目的探索应用有序PLCL电纺膜复合人诱导多能干细胞来源心肌细胞构建心肌补片的可行性。方法采用静电纺丝装置制备有序PLCL电纺膜,以扫描电镜观察其表面结构,以拉伸试验测定其机械强度。在该材料上种植人诱导多能干细胞来源的心肌细胞,评估其对心肌细胞分化的影响。将电纺膜移植到大鼠心脏表面观察电纺膜体内生物相容性。结果扫描电镜显示,电纺膜表面纤维有序排列。拉伸试验显示,在干燥和湿润情况下电纺膜都具有良好机械性能。细胞试验显示,有序PLCL电纺膜对心肌细胞具有引导作用,在形态上能够促进心肌细胞向更加成熟方向分化,且细胞能高表达成熟相关标志物连接蛋白CX43。体内试验提示,电纺膜可操作性高,具有良好的生物相容性。结论有序PLCL电纺膜具有有序排列的表面微结构、合适的力学性能,在体内外均具有良好的生物相容性,未来有望用于构建组织工程心肌补片,以治疗心肌损伤。

心肌补片的制备与结构功能特点

背景:组织工程心肌补片可以通过体内移植,使种子细胞准确到达梗死心肌区域并进行再生修复,达到改善心功能的治疗效果。目的:回顾制备组织工程心肌补片的构建方法和策略,分析不同构建方法制备心肌补片的结构功能特点。方法:由第一作者检索2000至2014年Web of science核心数据库、PudM ed数据库,检索主题词为"cardiac infarction;cell patch"。结果与结论:制备组织工程心肌补片的方法和策略有:叠加单层细胞片获取复层细胞结构;将胶原凝胶等材料与细胞混合形成复层结构;在支架材料上种植细胞;使细胞齐向排列等。目前关于组织工程心肌补片的研究显示,将细胞片进行体内移植后,种子细胞在心肌梗死区域停留率、存活率与旁分泌作用等,在很大程度上影响细胞片对梗死心肌的再生修复作用。现有的细胞片构建方法中以温敏法构建技术最为成熟、研究使用最为广泛,与此同时,其他构建方法也可不同程度地提高种子细胞的增殖、分化及旁分泌能力,增加细胞片的力学强度与厚度以增加移植可操作性。研究人员常结合多种方法用于制备获取生物学及力学特性良好的组织工程心肌补片。

组织工程心肌补片研究进展

心肌梗死导致的心衰是威胁人类健康的主要心血管疾病,利用干细胞结合支架材料制备的组织工程心肌补片有望成为将来治疗心肌梗死的新希望。目前,关于组织工程心肌补片的研究众多,细胞和支架材料亦多种多样。本文对可能应用于组织工程心肌补片的种子细胞来源、支架材料以及影响组织工程心肌补片存活和功能的各种因素进行综述。

心肌炎片中黄连素的HPLC法测定

用ＨＰＬＣ法测定了心肌炎片中黄连素的含量，使用ＲＰ－１８色谱柱，流动相为乙腈－磷酸盐缓冲液（ｐＨ５．２）－甲醇（５：６：１）。对供试品采用超声波振荡提取，再经氧化铝柱层析除杂后的溶液，进样分析。

复合心肌补片对小鼠梗死心肌的修复效果观察

目的探讨以人心脏瓣膜组织脱细胞基质作为支架的复合骨髓c-kit+干细胞心肌补片(以下称复合心肌补片)对小鼠梗死心肌的修复效果。方法制作复合心肌补片。采用结扎左冠状动脉前降支法制作30只心肌梗死小鼠模型并随机分为复合补片组、补片组及对照组各10只。造模成功3 d时各组小鼠予异氟烷麻醉、固定,开胸暴露心脏。复合补片组将复合心肌补片移植于梗死心肌周边;补片组采用同样方法将脱细胞基质移植于梗死心肌周边;对照组不采取修复措施。采用心脏超声检测移植4周时三组心移植左室射血分数、左室短轴缩短率、心梗面积。结果移植4周时,复合补片组左室射血分数、左室短轴缩短率明显高于补片组及对照组,心梗面积明显小于补片组及对照组,P均<0.05。结论复合心肌补片用于修复梗死心肌效果满意。

低氧微环境对P(3HB-co-4HB)与小鼠骨髓间充质干细胞共培养形成心肌补片影响的实验研究

目的探究低氧微环境对小鼠骨髓间充质干细胞(mouse bone marrow mesenchymal stem cells,mMSCs)与聚3羟基丁酸酯-co-4羟基丁酸酯[3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate,P(3HB-co-4HB)]材料共培养形成心肌补片的影响,为细胞移植术治疗心肌梗死提供一种更有效的心肌补片。方法全骨髓培养法提取小鼠骨髓间充质干细胞(mMSCs),取5代mMSCs流式细胞术鉴定表面抗原。将P(3HB-co-4HB)与小鼠骨髓间充质干细胞共培养制作成细胞补片,随机分为常氧组和低氧组,每组各10个样本,0、12、24 h分别用CCK-8法测定细胞增殖情况;扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察补片存活、黏附、生长情况。加入诱导剂5-氮杂胞苷2周后,免疫荧光检测两组心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达情况。结果在共培养24 h后,CCK-8法测定低氧组OD值(0.349±0.038)显著大于常氧组(0.308±0.025)( n =10, P <0.05),扫描电子显微镜观察到低氧组P(3HB-co-4HB)材料上细胞数量更多,细胞与材料之间的黏附牢固,细胞形态正常。免疫荧光显示低氧组cTnT表达比常氧组更加显著。结论相对于常氧条件,低氧微环境可促进骨髓间充质干细胞在P(3HB-co-4HB)材料上的黏附、存活、增殖、分化,形成一种更有效的心肌补片。

心肌组织工程补片对心肌梗死大鼠心室肌电活动及自主神经重构的影响

目的探讨心肌组织工程补片对心肌梗死(简称心梗)大鼠心室肌电活动及自主神经重构的影响。方法将成年SD大鼠45只随机分成三组:假手术组、心梗组、移植组,每组15只。假手术组仅开胸,不结扎冠状动脉。后2组制作心梗动物模型,移植组大鼠制作心梗大鼠模型1周后再次开胸,暴露心脏左室前壁,将组织工程心肌片层用1号丝线将其四角缝合至心梗区,使之与梗死区紧密相贴。造模后5周,测量各组梗死周边区与非梗死区有效不应期(ERP)。免疫组化法控测各组生长相关蛋白(GAP43)、酪氨酸羟化酶(TH)和乙酰胆碱转移酶(ChAT)。结果①与假手术组比较,心梗组梗死周边区ERP显著缩短(P<0.01);与心梗组比较,移植组梗死周边区ERP较心梗组延长(P<0.01)。②心梗组和移植组GAP43阳性神经密度明显增加(均P<0.01)。心梗组TH和ChAT阳性神经密度不均一明显增加(均P<0.01),移植组TH和ChAT阳性神经密度不均一未见明显改变(均P>0.01)。结论工程化心肌补片与宿主整合促进受损心肌电生理特性的恢复及自主神经再生修复。

DiI标记的大鼠骨髓间充质干细胞与乳鼠心肌细胞在聚己内酯薄膜上接触共培养制作心肌补片的实验研究

目的探讨在聚己内酯薄膜上将DiI标记的骨髓间充质干细胞(BMSCs)与乳鼠心肌细胞接触共培养制作心肌补片的可能机制。方法选取5~6周龄SD大鼠2只,分离培养获得SD大鼠BMSCs,流式细胞术鉴定表面抗原。选取乳鼠15只,分离培养获得乳鼠心肌细胞。BMSCs培养至3代,使用DiI染料标记BMSCs。在聚己内酯薄膜上将DiI标记的BMSCs与心肌细胞接触共培养并设为实验组,对照组中将心肌细胞替换为等量未标记的BMSCs。共培养后24 h在荧光显微镜下观察细胞生长情况,并用扫描电镜观察共培养情况。共培养后7 d对细胞进行免疫荧光染色检测心肌标志物表达,在荧光显微镜下观察聚己内酯薄膜上BMSCs表达心肌标志物的情况。共培养的第1、7天使用流式细胞术分析BMSCs的干细胞分化率。使用钙黄绿素单独对心肌细胞染色,再在聚己内酯薄膜上将其与DiI标记的BMSCs接触共培养,观察细胞间染料转移,并对细胞进行免疫荧光染色,检测缝隙连接蛋白43的表达,观察缝隙连接与接触共培养之间的关系。结果流式细胞术鉴定示BMSCs表面CD90、CD44H强阳性,CD11b/c、CD45阴性。共培养后24 h,荧光显微镜下观察到细胞依附于聚己内酯薄膜上,DiI标记的BMSCs发红光,未标记的心肌细胞不发光;扫描电镜下观察到聚己内酯薄膜上细胞数量多,细胞状态正常。共培养第7天,部分DiI标记的BMSCs表达心肌肌钙蛋白T、α-心肌肌动蛋白。流式细胞术分析示第7天实验组的干细胞分化率高于对照组[(20.12±0.15)%比(3.49±0.20)%,P<0.05]。共培养后第2天,缝隙连接蛋白43免疫荧光染色结果示部分BMSCs可见明显绿色点状荧光;共培养后第3天,染料转移试验示部分BMSCs发出明显绿色荧光。结论DiI标记的BMSCs与心肌细胞在聚己内酯薄膜上接触共培养可以制作心肌补片,并且接触共培养促进分化形成心肌补片的机制可能与缝隙连接以及缝隙连接介导的细胞间信号通路有关。

原位聚合法制备蚕丝导电心肌补片及其性能表征

通过原位聚合法工艺,利用聚吡咯和还原氧化石墨烯对蚕丝织物进行导电整理,制得蚕丝导电心肌补片,并探讨其优化整理工艺。测试结果表明:导电心肌补片表面的导电颗粒随吡咯单体和氧化石墨烯质量浓度上升而增多,其电导率也随之提高;表面电阻随着吡咯单体浓度增加而降低,原位聚合的吡咯单体最佳质量浓度为1 g/L,氧化石墨烯最佳质量浓度为8 g/L;聚吡咯和还原氧化石墨烯可以很好地聚合在蚕丝织物表面;随着原位聚合质量浓度的增加,导电心肌补片的热学性能、降解率有所提高,杨氏模量呈下降趋势。综合分析认为:利用原位聚合法制备蚕丝导电心肌补片具有很好的可行性。

心肌泰胶囊治疗病毒性心肌炎的实验研究

目的:观察心肌泰胶囊对柯萨奇病毒的抑制作用及其所诱导的大鼠心肌炎的治疗作用。方法:采用细胞病变抑制法(CPE)观察心肌泰胶囊及心肌片1号的抗柯萨奇病毒B_3作用,并用小鼠腹腔注射氢化可的松加柯萨奇病毒B_3液制作心肌炎模型,观察心肌泰胶囊的治疗作用。结果:心肌泰胶囊对柯萨奇B_3有明显的抑制作用,可明显减少心肌炎小鼠的死亡率,改善一般状况,减轻心肌病理性损伤,结论:心肌泰胶囊对柯萨奇B_3病毒确有抑制作用,是治疗心肌炎的有效药物。