微电极阵芯片技术在心肌电生理研究中应用的可行性

目的探讨60极微电极阵芯片(MEA)技术在整体心脏、心肌组织片和培养心肌等电生理研究中的应用。方法①80只豚鼠,开胸取心脏并以2.5ml/min速度Langendorff灌流心脏20min,信号稳定后采样;②60只SD大鼠,开胸取心,剪取5mm×5mm大小的心脏组织片,置于MEA盘,台氏液间歇灌流5min,用5μV×1ms的刺激脉冲连续刺激,刺激间隔为1s,比较心房和心室组织片场电位(FPs)形态和传导时间;③20窝出生后3天以内的昆明小白鼠,消化分离心肌细胞,培养于MEA盘内,进行组织信号采样。结果①大鼠整体心脏灌流30～90min内能够记录到稳定的自主节律下的FPs信号,心室肌场电位时程(FPdur)210±78ms;心房肌FPdur164±58ms;房室传导时间320±150ms;并能记录到FPs激动顺序图。②心肌组织靶点取样,台氏液间歇灌流和电刺激下,组织的兴奋性可以稳定保持2h。心室肌组织片FPdur115.80±11.61ms,心房组织片FPdur83.71±6.48ms,刺激信号在心房组织片的传导时间66.46±6.73ms,心室组织片传导时间47.40±5.62ms;③小鼠乳鼠心脏原代培养心肌24h时后开始有散在、不同步的细胞克隆搏动和点状FPs信号,72h后细胞融合,开始记录到基本同步的群动和多位点FPs信号,培养心肌自发搏动频率150±100次/分。结论 MEA技术可以稳定记录小动物整体灌流心脏,心脏定点取样组织片,培养心肌细胞60极场电位和电传导特性。

心肌组织工程补片对心肌梗死大鼠心室肌电活动及自主神经重构的影响

目的探讨心肌组织工程补片对心肌梗死(简称心梗)大鼠心室肌电活动及自主神经重构的影响。方法将成年SD大鼠45只随机分成三组:假手术组、心梗组、移植组,每组15只。假手术组仅开胸,不结扎冠状动脉。后2组制作心梗动物模型,移植组大鼠制作心梗大鼠模型1周后再次开胸,暴露心脏左室前壁,将组织工程心肌片层用1号丝线将其四角缝合至心梗区,使之与梗死区紧密相贴。造模后5周,测量各组梗死周边区与非梗死区有效不应期(ERP)。免疫组化法控测各组生长相关蛋白(GAP43)、酪氨酸羟化酶(TH)和乙酰胆碱转移酶(ChAT)。结果①与假手术组比较,心梗组梗死周边区ERP显著缩短(P<0.01);与心梗组比较,移植组梗死周边区ERP较心梗组延长(P<0.01)。②心梗组和移植组GAP43阳性神经密度明显增加(均P<0.01)。心梗组TH和ChAT阳性神经密度不均一明显增加(均P<0.01),移植组TH和ChAT阳性神经密度不均一未见明显改变(均P>0.01)。结论工程化心肌补片与宿主整合促进受损心肌电生理特性的恢复及自主神经再生修复。

PKH26与BrdU体外双重标记兔BMSCs在心肌补片中的实验研究

目的观察PKH26与BrdU体外双重标记兔BMSCs的生物学特性,并体外构建组织工程心肌补片。方法取6月龄新西兰大白兔分离培养BMSCs,并用细胞膜荧光染料PKH26和细胞核标记物BrdU对BMSCs进行标记,通过倒置相差显微镜、荧光显微镜、流式细胞仪、MTT法观察细胞生长状态和荧光标记前后细胞生物学特性的变化;ALP、茜素红、油红O染色及骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白等免疫细胞化学技术检测,观察和评价标记前后BMSCs体外分化为成骨细胞和成脂细胞的能力。将标记细胞与小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)复合后共培养5～7d构建组织工程心肌补片,在倒置相差显微镜、荧光显微镜和扫描电镜下观察细胞在SIS上的生长情况,并做活体及石蜡包埋HE染色观察。结果标记后细胞生长状态良好,基本生长特性无明显改变;荧光显微镜下可见标记后细胞膜上红色荧光呈颗粒状分布;细胞表面干细胞标志性抗原表达与标记前无明显差异。标记后的BMSCs成骨诱导后,ALP、茜素红染色阳性,细胞表达骨钙素及Ⅰ型胶原蛋白;成脂诱导后,细胞胞浆内出现明显的脂滴。标记细胞与SIS共培养5～7d后,标记细胞生长状态良好,在材料上呈现出多层细胞结构。活体及石蜡包埋后HE染色可见细胞生长状态良好。结论兔BMSCs能被PKH26和BrdU稳定标记;标记的细胞在体外具有自我更新和多向分化的能力;标记的BMSCs与SIS体外复合培养可以构建组织工程心肌补片。