背景:研究已证实诱导多能干细胞能够定向分化为心肌细胞,但目前很少有分化心肌细胞成熟度的研究报道。目的:探讨延长诱导分化时间对诱导多能干细胞源性心肌细胞的形态、肌节长度、双核细胞含量、心脏基因表达、心脏蛋白表达和线粒体功...背景:研究已证实诱导多能干细胞能够定向分化为心肌细胞,但目前很少有分化心肌细胞成熟度的研究报道。目的:探讨延长诱导分化时间对诱导多能干细胞源性心肌细胞的形态、肌节长度、双核细胞含量、心脏基因表达、心脏蛋白表达和线粒体功能的影响。方法:使用骨形态发生蛋白4、CHIR 99021和IWR1诱导多能干细胞向心肌细胞分化,分别在第20天和第40天收集分化心肌细胞;采用RT-PCR和免疫荧光检测分化心肌细胞中心脏基因和蛋白的表达水平;LAS X图像分析软件分析分化心肌细胞形态和肌节长度;MitoTracker Green FM线粒体染色检测线粒体总量,JC-1线粒体染色检测线粒体膜电位。结果与结论:与第20天的分化心肌细胞相比,第40天的分化心肌细胞的细胞周长和肌节长度更长、细胞面积更大(P<0.05);多核细胞比例从第20天的16%左右大幅上升至第40天的29%左右(P<0.05);第40天的分化心肌细胞具有与原代心肌细胞更相近的基因表达水平,SERCA2A、Cx-43和α-MHC基因表达水平明显高于第20天的分化心肌细胞(P<0.05);与第20天的分化心肌细胞相比,第40天的分化心肌细胞中TNNT2和α-MHC蛋白表达水平较高,线粒体分布密度更大,且功能性线粒体数量增加(P<0.05)。结果表明:延长诱导分化时间,可以通过增加肌节长度和功能性线粒体数量以及升高心脏基因和蛋白表达水平而提高分化心肌细胞的成熟度。展开更多
目的探讨泛素连接酶肌肉环指状蛋白2(muscle ring finger protein 2,MuRF2)对缺氧心肌细胞活力和自噬的调控作用。方法构建大鼠源MuRF2基因过表达和敲减慢病毒载体,分别感染大鼠心肌细胞H9C2。将H9C2细胞分为阴性对照组(NC)、阳性对照组...目的探讨泛素连接酶肌肉环指状蛋白2(muscle ring finger protein 2,MuRF2)对缺氧心肌细胞活力和自噬的调控作用。方法构建大鼠源MuRF2基因过表达和敲减慢病毒载体,分别感染大鼠心肌细胞H9C2。将H9C2细胞分为阴性对照组(NC)、阳性对照组[MuRF2过表达空载体组(LV-Vector)、MuRF2敲减空载体组(LV-RNAi-Vector)]、Mu RF2过表达组(LV-MuRF2)和MuRF2敲减组(LV-RNAi-MuRF2),缺氧培养(5%CO_(2)、1%O_(2)、94%N_(2))后,采用CCK-8法和ELISA法检测心肌细胞损伤水平,利用透射电子显微镜检测心肌细胞超微结构和自噬水平变化,采用Western blot测定自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和P62的表达水平。结果与对照组相比,缺氧组心肌细胞间隙增大、细胞皱缩、多见漂浮的死亡细胞和细胞碎片,心肌细胞活力下降、肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)含量增加(P均<0.05);电子显微镜下可观察到部分线粒体发生肿胀,并存在嵴断裂、嵴溶解现象,自噬小体散在胞质内;缺氧组LC3-Ⅱ蛋白表达水平升高,P62蛋白表达水平降低(P均<0.05)。缺氧培养后,与NC组和LV-Vector组相比,LV-MuRF2组细胞活力增加,偶见自噬小体,LC3-Ⅱ蛋白表达水平降低、P62蛋白表达水平增高(P均<0.05);与NC组和LV-RNAi-Vector组相比,LV-RNAi-MuRF2组细胞活力降低,可见大量自噬小体,LC3-Ⅱ蛋白表达水平升高、P62蛋白表达水平降低(P均<0.05)。结论泛素连接酶MuRF2可减轻缺氧所致的心肌细胞损伤,其机制可能与抑制心肌细胞线粒体自噬有关。展开更多
文摘背景:研究已证实诱导多能干细胞能够定向分化为心肌细胞,但目前很少有分化心肌细胞成熟度的研究报道。目的:探讨延长诱导分化时间对诱导多能干细胞源性心肌细胞的形态、肌节长度、双核细胞含量、心脏基因表达、心脏蛋白表达和线粒体功能的影响。方法:使用骨形态发生蛋白4、CHIR 99021和IWR1诱导多能干细胞向心肌细胞分化,分别在第20天和第40天收集分化心肌细胞;采用RT-PCR和免疫荧光检测分化心肌细胞中心脏基因和蛋白的表达水平;LAS X图像分析软件分析分化心肌细胞形态和肌节长度;MitoTracker Green FM线粒体染色检测线粒体总量,JC-1线粒体染色检测线粒体膜电位。结果与结论:与第20天的分化心肌细胞相比,第40天的分化心肌细胞的细胞周长和肌节长度更长、细胞面积更大(P<0.05);多核细胞比例从第20天的16%左右大幅上升至第40天的29%左右(P<0.05);第40天的分化心肌细胞具有与原代心肌细胞更相近的基因表达水平,SERCA2A、Cx-43和α-MHC基因表达水平明显高于第20天的分化心肌细胞(P<0.05);与第20天的分化心肌细胞相比,第40天的分化心肌细胞中TNNT2和α-MHC蛋白表达水平较高,线粒体分布密度更大,且功能性线粒体数量增加(P<0.05)。结果表明:延长诱导分化时间,可以通过增加肌节长度和功能性线粒体数量以及升高心脏基因和蛋白表达水平而提高分化心肌细胞的成熟度。
文摘目的探讨泛素连接酶肌肉环指状蛋白2(muscle ring finger protein 2,MuRF2)对缺氧心肌细胞活力和自噬的调控作用。方法构建大鼠源MuRF2基因过表达和敲减慢病毒载体,分别感染大鼠心肌细胞H9C2。将H9C2细胞分为阴性对照组(NC)、阳性对照组[MuRF2过表达空载体组(LV-Vector)、MuRF2敲减空载体组(LV-RNAi-Vector)]、Mu RF2过表达组(LV-MuRF2)和MuRF2敲减组(LV-RNAi-MuRF2),缺氧培养(5%CO_(2)、1%O_(2)、94%N_(2))后,采用CCK-8法和ELISA法检测心肌细胞损伤水平,利用透射电子显微镜检测心肌细胞超微结构和自噬水平变化,采用Western blot测定自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和P62的表达水平。结果与对照组相比,缺氧组心肌细胞间隙增大、细胞皱缩、多见漂浮的死亡细胞和细胞碎片,心肌细胞活力下降、肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)含量增加(P均<0.05);电子显微镜下可观察到部分线粒体发生肿胀,并存在嵴断裂、嵴溶解现象,自噬小体散在胞质内;缺氧组LC3-Ⅱ蛋白表达水平升高,P62蛋白表达水平降低(P均<0.05)。缺氧培养后,与NC组和LV-Vector组相比,LV-MuRF2组细胞活力增加,偶见自噬小体,LC3-Ⅱ蛋白表达水平降低、P62蛋白表达水平增高(P均<0.05);与NC组和LV-RNAi-Vector组相比,LV-RNAi-MuRF2组细胞活力降低,可见大量自噬小体,LC3-Ⅱ蛋白表达水平升高、P62蛋白表达水平降低(P均<0.05)。结论泛素连接酶MuRF2可减轻缺氧所致的心肌细胞损伤,其机制可能与抑制心肌细胞线粒体自噬有关。
