芦荟素减轻大鼠心肌细胞缺氧损伤:抑制氧化应激和铁死亡

背景:心肌细胞缺氧损伤与氧化应激和铁死亡密切有关。既往研究表明芦荟素具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种作用。目的:探讨芦荟素对缺氧诱导的H9C2细胞氧化应激及铁死亡的影响。方法:利用H9C2细胞构建缺氧模型,首先通过检测细胞活性,确定芦荟素无细胞毒性及最佳干预浓度。随后,利用试剂盒、超氧化物阴离子荧光探针及MitoSOX^(TM)Red荧光探针,分别评估芦荟素对缺氧诱导的H9C2细胞乳酸脱氢酶释放、活性氧产生以及线粒体氧化应激的影响。为了验证芦荟素对铁死亡的影响,采用荧光染色和流式细胞术,分别检测细胞内Fe^(2+)的含量和脂质过氧化程度。接着,利用蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR技术,检测铁死亡调节因子(谷胱甘肽过氧化物酶4、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4和核因子E2相关因子2)的表达。最后,通过运用铁死亡诱导剂Erastin,进一步确认铁死亡在芦荟素介导心肌保护过程中的重要作用。结果与结论:(1)与对照组相比,缺氧组H9C2细胞活力显著降低,乳酸脱氢酶释放、活性氧水平、线粒体氧化应激程度、Fe^(2+)含量及脂质过氧化程度显著上升,谷胱甘肽过氧化物酶4、核因子E2相关因子2的mRNA和蛋白表达明显降低,酰基辅酶A合成酶长链家族成员4的mRNA和蛋白表达显著升高(均P<0.05);(2)与缺氧组比较,芦荟素低、高剂量组逆转了上述指标变化(均P<0.05);(3)与缺氧+芦荟素组相比,缺氧+芦荟素+Erastin组H9C2细胞活力明显下降,乳酸脱氢酶释放显著升高(均P<0.01)。结果表明,芦荟素对缺氧处理的H9C2细胞具有保护作用,且呈剂量依赖性,主要通过抑制氧化应激和铁死亡实现的。

乙醛脱氢酶2抑制剂daidzin对大鼠心肌细胞缺氧损伤作用的机制

目的检测乙醛脱氢酶2(ALDH2)被daidzin抑制时对大鼠心肌细胞在缺氧状态下发生凋亡和信号转导的影响,验证乙醛脱氢酶2 (ALDH2)在此过程中所起的作用．方法在确定daidzin的最佳抑制浓度后,运用心肌细胞缺氧模型,比较大鼠心肌细胞在单独缺氧和经ALDH2特异性抑制剂daidzin预处理24 h后缺氧的凋亡和MAPK信号通路的改变。酶活性检测采用乙醛代谢法、ROS的检测用C400测定,凋亡的测定通过用Hoechest 33324、免疫荧光标记的流式细胞仪和TUNEL试剂盒检测,MAPK信号通路酶(ERK1／2、JNK、P38)磷酸化的改变用Western印迹法检测。结果60μmol/Ldaidzin浓度是ALDH2酶活性被抑制而细胞无凋亡发生的最佳工作浓度。在daidzin (60μmol／L)预处理24 h后再经缺氧诱导,比单独缺氧引起的心肌细胞凋亡更为明显:表现为在Hoechest 33324染色中,细胞核溶解和核碎裂(P<0．05),在FACS和TUNEL的检测中,凋亡细胞明显增加(P<0．05),经凋亡后的死亡细胞有增加趋势但差异无统计学意义,同时与MAPK信号通路有关的磷酸化ERK1／2、JNX和P38的酶活性均表达增强。结论daidzin使ALDH2酶活性降低可增加心肌细胞对缺氧导致凋亡的易感性,其机制是与细胞ROS和凋亡的增加及MAPK信号通路的激活有关。ALDH2对缺氧引起的细胞凋亡损伤具有保护作用。

碱性成纤维细胞生长因子拮抗大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的机制

目的 :研究碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor ,bFGF)拮抗大鼠心肌细胞缺氧 /复氧(hypoxia/reoxygenation ,H/R)损伤的机制。 方法 :H/R处理的大鼠心肌细胞的孵育液中 ,对照组不加任何处理因素 ,其它各组分别加bFGF(10 μg·L-1)、bFGF与丝裂素活化蛋白激酶 (mitogen activatedproteinkinase,MAPK)抑制剂PD980 5 9(5 0 μmol·L-1)、蛋白激酶C(proteinkinaseC ,PKC)抑制剂H7(40 μmol·L-1)、一氧化氮合酶 (nitricoxidesynthase ,NOS)抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯 (NG nitro L argininemethylester,L NAME ,5 0 μmol·L-1)。孵育完毕 ,测定细胞活力、ATP含量及孵育液中乳酸脱氢酶 (lactatedehydrogenase,LDH)含量。 结果 :H/R组心肌细胞活力较对照组降低 32 % (P <0 .0 1) ,细胞ATP含量减少 5 8% (P <0 .0 1) ,孵育液中LDH活性增加 5 .8倍 (P <0 .0 1) ;bFGF组心肌细胞活力较H/R组增高 17% (P <0 .0 1) ,细胞ATP含量增加 45 % (P <0 .0 1) ,孵育液中LDH活性降低 31% (P <0 .0 1) ,细胞PKC、MAPK活性分别增加 32 % (P <0 .0 1)和 10 % (P <0 .0 5 )。PD980 5 9、H7、PD980 5 9+H7及L NAME各组心肌细胞活力较bFGF组分别降低 13%、17%、2 4%和 2 7% (均P <0 .0 1) ,细胞ATP含量分别减少

大蒜素预处理对乳鼠心肌细胞缺氧复氧延迟保护作用的研究

目的 :研究大蒜素预处理对乳鼠心肌细胞缺氧复氧的延迟保护作用及其机制。方法 :采用细胞存活率、乳酸脱氢酶 (LDH)活性、丙二醛 (MDA)含量作为心肌细胞受损指标。观察终浓度分别为 5、1 0、2 0、5 0 μg/ml的大蒜素预处理以及预处理 1 2、2 4、3 6h后对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的影响 ,并观察蛋白激酶C(PKC)抑制剂H 7、丝裂素激活蛋白激酶 (MAPKs)抑制剂PD 980 5 9对大蒜素预处理的作用。结果 :大蒜素能提高细胞存活率 ,减少LDH漏出和MDA生成。其中 2 0 μg/ml浓度作用较强。大蒜素预处理 1 2h后即产生延迟保护作用 ,2 4h最强 ,3 6h消失。H 7、PD 980 5 9能够完全清除大蒜素预处理的心肌保护作用。结论 :大蒜素可以模拟缺血预处理延迟保护作用 ,其机制涉及PKC及MAPKs信号途径。

七氟醚对培养心肌细胞缺氧损伤的保护作用

七氟醚学作为新型的吸入麻醉药。其对心肌缺血再灌注动物及冠心患者有着明显的心肌保护作用[1,2]。本课题选用氰化钠造成培养心肌细胞缺氧（细胞内缺氧）模型，排除了血流动力学及其因素在缺氧损伤的影响,

枸杞糖肽对心肌细胞缺氧性损伤的保护作用

目的观察枸杞糖肽对心肌细胞缺氧性损伤的保护作用,建立心肌细胞缺氧损伤病理模型。方法从细胞形态学、细胞存活率、心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)外漏释放及细胞凋亡等方面,观察枸杞糖肽对缺氧损伤心肌细胞的保护作用。结果枸杞糖肽能明显抑制缺氧所致的心肌细胞死亡(P<0.05,P<0.01)、细胞内LDH的漏出(P<0.05,P<0.01),并能降低缺氧诱导的心肌细胞凋亡。结论枸杞糖肽对心肌细胞缺氧性损伤具有明显的保护作用。

心肌康注射液对体外培养乳鼠心肌细胞缺氧缺糖性损伤保护作用的实验研究

目的:探讨心肌康注射液对乳鼠心肌细胞缺氧缺糖性损伤的保护作用。方法:实验分正常组、模型组、心肌康1.5 g/L组、心肌康3.0 g/L组4组,细胞培养3 d后,分别进行相应的处理,观察心肌细胞的搏动频率,分光光度法测定心肌细胞LDH(乳酸脱氢酶)含量,细胞化学染色观察心肌细胞LDH及SDH(琥珀酸脱氢酶)活性。结果:与正常组比较,模型组心肌细胞搏动频率明显减少;心肌康注射液2组心肌细胞搏动频率明显增加,与模型组比较,差异具统计学意义(P<0.05)。与正常组比较,模型组心肌细胞LDH及SDH活性明显降低,LDH含量明显升高;心肌康2组心肌细胞LDH及SDH活性较模型组显著增强,LDH含量明显降低,统计学处理差异显著(P<0.05)。结论:心肌康注射液对心肌细胞缺氧缺糖性损伤具有保护作用。

地奥心血康对培养H9c2心肌细胞缺氧／复氧损伤的保护机制

心肌缺血再灌注损伤是近年来的研究热点，中药在保护心肌缺血再灌注损伤作用机制的研究进展较快。我国药典2010年版收入的地奥心血康是薯蓣科植物黄山药、穿龙薯蓣的根茎提取物。研究表明，其具有活血化瘀、行气止痛、宣痹通阳、补益气血等功能，

穿心草(口山)酮对心肌细胞缺氧-再给氧损伤的保护作用

以Laarse’s方法建立心肌细胞缺氧-再给氧模型,缺糖缺氧60 min,再给氧30 min,结果发现心肌释放LDH含量显著增加,细胞膜流动性下降,再给氧组上述各指标改变加剧。山酮能明显提高心肌细胞的成活率,减少乳酸脱氢酶的释放,增加细胞膜流动性,减少心肌细胞膜的损伤。证明有明显抗心肌细胞缺氧-再给氧损伤作用。

七氟醚后处理对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用研究

目的探讨七氟醚后处理对抗心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤过程中,缺氧诱导因子-1α/巨噬细胞移动抑制因子(HIF-1α/MIF)信号轴发挥的调控作用及相关作用机制。方法运用大鼠心肌细胞(H9C2)建立H/R损伤模型,分为空白对照组(NOR组)、缺氧/复氧组(H/R组)、七氟醚后处理组(SPostC组)、HIF-1α抑制剂组(YC-1组)。采用乳酸脱氢酶(LDH)及细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞存活率;流式细胞仪检测细胞凋亡;活性氧(ROS)和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)试剂盒检测细胞能量代谢;通过Western blot检测HIF-1α、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)和磷酸化AMPKα(p-AMPKα)的蛋白表达水平。结果(1)与NOR组和H/R组相比,SPostC组显著上调了HIF-1α的表达、抑制细胞凋亡、减少ROS生成、增加ATP含量和减少LDH含量,经比较差异具有统计学意义(P<0.05);(2)与H/R组相比,SPostC组和YC-1组中HIF-1α的表达水平分别与MIF和AMPK的蛋白表达呈正相关(P<0.05);(3)与SPostC组相比,YC-1组抑制HIF-1α的表达,MIF、AMPKα和p-AMPKα呈低表达,经比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论七氟醚后处理通过上调HIF-1α/MIF信号轴对抗心肌细胞H/R损伤。

硒对培养乳鼠心肌细胞缺氧—再给氧损伤影响的实验研究

硒与克山病发病率、冠心病死亡率呈负相关,临床上已用硒和vitE合剂治疗心绞痛。有人在整体心脏模型中证实了硒对缺血缺氧心脏具有保护作用。但无法排除全身体液、激素水平变化及心脏内各类型细胞的相互影响。本实验通过建立培养乳鼠心肌细胞缺氧—再给氧损伤模型,研究不同剂量的硒对心肌细胞缺氧—再给氧损伤的作用,这有利于临床硒的合理应用。

β-榄香烯调控miR-130b-5p/NF-κB信号通路对心肌细胞缺氧复氧损伤的影响及机制

目的 探讨β-榄香烯对缺氧复氧诱导的心肌H9C2细胞损伤的影响和可能机制。方法 体外培养H9C2细胞,分别给予不同处理,构建缺氧复氧损伤模型。分别转染miR-NC、miR-130b-5p mimics、anti-miR-NC、antimiR-130b-5p至H9C2细胞后进行β-榄香烯预处理和缺氧复氧处理。采用CCK-8法、流式细胞术分别检测β-榄香烯、miR-130b-5p表达对缺氧复氧诱导的H9C2活力和凋亡的影响,采用试剂盒检测细胞培养液中IL-6、IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,采用Western blotting法检测磷酸化的核因子κB-p65(p-p65)、磷酸化的核因子κB抑制蛋白α(p-IκBα)表达。结果 缺氧复氧处理后H9C2细胞活力降低,细胞凋亡率、细胞培养液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高(P均<0.05)。β-榄香烯处理后缺氧复氧诱导的H9C2细胞活力升高,细胞凋亡率、细胞培养液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低(P均<0.05)。过表达miR-130b-5p后缺氧复氧诱导的H9C2细胞活力升高,细胞凋亡率、细胞培养液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低(P均<0.05),而抑制miR-130b-5p表达则加剧缺氧复氧诱导的H9C2损伤(P均<0.05)。缺氧复氧处理后H9C2细胞p-p65和p-IκBα表达升高(P均<0.05)。抑制miR-130b-5p表达加剧缺氧复氧对H9C2细胞p-p65和p-IκBα表达的影响(P均<0.05),并减弱β-榄香烯处理对缺氧复氧诱导的H9C2细胞p-p65和p-IκBα表达的影响(P均<0.05)。结论 β-榄香烯能减轻心肌细胞缺氧复氧损伤,其机制与上调miR-130b-5p表达、抑制NF-κB信号通路有关。

沙棘籽粕原花青素的提取与抗心肌细胞缺氧活性研究

研究沙棘籽粕中原花青素的提取与抗心肌缺氧活性。用乙酸乙酯萃取沙棘籽粕的乙醇提取物得原花青素乙酸乙酯萃取物,再经Sephadex LH-20柱层析50%乙醇洗脱得沙棘籽粕原花青素50%乙醇洗脱物。以乳鼠心肌细胞缺氧/复氧为模型,分别给予不同剂量的原花青素干预,采用MTT法检测心肌细胞的存活率。结果表明,乙酸乙酯萃取物和50%乙醇洗脱物能显著提高缺氧/复氧心肌细胞的存活率,对心肌细胞损伤有很好的保护作用。

培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型与黄芩苷的影响

目的:观察黄芩苷对纯化培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其作用机制。方法:实验于2006-11/2007-01在郑州大学医学院药理实验室完成。①实验分组:选用出生1～3d的SD大鼠20只,雌雄不拘,培养乳鼠心肌细胞建立缺氧/复氧损伤模型。实验分为5组:正常对照组以正常细胞培养,加入等数量的培养基,不加入任何药物,缺氧/复氧损伤模型组,缺氧/复氧损伤+0.1mg/L黄芩苷组,缺氧/复氧损伤+1mg/L黄芩苷组,缺氧/复氧损伤+10mg/L黄芩苷组。②实验评估:采用乳酸脱氢酶试剂盒测其释放量;采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶活力;硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛含量;四唑盐比色法测定心肌细胞活力。结果:①丙二醛含量和乳酸脱氢酶活力:缺氧/复氧损伤组明显高于正常对照组(P<0.01),缺氧/复氧+10,1,0.1mg/L浓度黄芩苷组明显低于缺氧/复氧损伤组(P<0.01)。②心肌细胞超氧化物歧化酶活性:缺氧/复氧损伤组明显低于正常对照组(P<0.01),黄芩苷+10,1,0.1mg/L浓度黄芩苷组明显高于缺氧/复氧损伤组(P<0.01)。③心肌细胞活力:缺氧/复氧损伤组心肌细胞活力明显低于正常对照组,缺氧/复氧+10,1,0.1mg/L浓度黄芩苷组明显高于缺氧/复氧损伤组(P<0.01)。结论:黄芩苷具有对缺氧/复氧损伤所致心肌细胞的保护作用,可能与其抗氧化、抗自由基有关。

基于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白通路探讨大株红景天注射液对缺氧H9C2心肌细胞损伤的影响

目的探讨大株红景天注射液对缺氧H9C2心肌细胞的影响及保护机制。方法取H9C2心肌细胞缺氧造模,实验分为正常组、模型组、大株红景天注射液组(简称:SI组)、尼可地尔组。采用RT-qPCR检测磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的mRNA;免疫蛋白印记法检测PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的蛋白表达;流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果与模型组比较,SI组及尼可地尔组PI3K、AKT、mTOR的mRNA表达均显著降低(P<0.05)。与模型组比较,SI组和尼可地尔组PI3K、AKT、mTOR蛋白表达无明显差异(P>0.05)。经磷酸化处理后,与模型组比较,SI组和尼可地尔组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的蛋白表达显著下降(P<0.05);与尼可地尔组相比,SI组p-PI3K、p-AKT的蛋白表达下降(P<0.05),p-mTOR的蛋白含量无明显差异(P>0.05)。结论大株红景天注射液通过下调PI3K/AKT/mTOR通路,起到了抑制缺氧心肌细胞过度自噬,改善心肌细胞损伤的作用。

异丙酚对鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤中的保护作用

心肌缺血/再灌注损伤是围术期经常面临的一种病理生理变化,静脉麻醉药异丙酚结构上的特殊性使其对各种因素(如缺血/再灌注)所致的氧化应激的诸多环节均有阻断作用,异丙酚的抗氧化性可能为其心肌保护作用的机制之一.本文研究了异丙酚预处理对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及该作用是否与其抗氧化性有关.

枸杞糖肽对缺氧及KCl诱导的心肌细胞钙超载的影响

目的:研究枸杞糖肽(LbGp)对低氧心肌细胞内钙浓度([Ca2+]i)的影响,以及对KCl诱导的心肌细胞钙超载的影响。方法:采用SD大鼠乳鼠进行心肌细胞培养,建立心肌缺氧模型,实验分3组:正常对照组;缺氧模型组:细胞缺氧6h;枸杞糖肽预处理组:加入枸杞糖肽,再行缺氧6h。MTT法检测细胞活力。以Fluo/AM荧光指示剂负载,通过激光扫描共聚焦显微系统和Flou3/AM荧光指示剂标记技术,观察枸杞糖肽对缺氧心肌细胞游离钙含量的影响。加入终浓度60mmol·L-1KCl溶液,动态观察KCl刺激后心肌细胞[Ca2+]i的动态变化及LbGp预处理后对KCl诱导的钙超载的影响。结果:心肌细胞缺氧时间延长,损伤随之加剧,缺氧枸杞糖肽组心肌细胞荧光密度均较模型组显著降低(P<0.01),50μg·mL-1LbGp最为明显,[Ca2+]i明显减少。枸杞糖肽组加入KCl溶液后[Ca2+]i荧光强度曲线升高,但与模型组比较,幅度明显减小,25,50,100μg·mL-1LbGp且呈现量效关系。结论:低氧导致心肌细胞钙超载,而枸杞糖肽能减轻钙超载。亦能对抗KCl诱导的心肌细胞钙超载。机制之一是枸杞糖肽作用于L型钙通道。

PKC信号传导通路在缺氧心肌细胞表达VEGF中的作用

目的 :明确缺氧对心肌细胞表达血管内皮生长因子 (VEGF)的影响及蛋白激酶C(PKC)信号传导通路在其中的作用。方法 :将原代培养大鼠心肌细胞模型分组 :①正常缺氧 4组 :A组正常对照 ;B组缺氧 6h ;C组缺氧 12h ;D组缺氧 2 4h。②PKC激动剂 4组 :A组缺氧 2 4h对照 ;B组加入PMA 10ng/ml缺氧 2 4h ;C组加入PMA 10 0ng/ml缺氧 2 4h ;D组加入PMA 10 0 0ng/ml缺氧 2 4h。③PKC抑制剂 2组 :A组缺氧 2 4h对照 ;B组加入Chelerythrine 10mmol/L缺氧 2 4h。免疫组化方法检测各组心肌细胞中VEGF的表达 ,经计算机图像处理 ,定量分析。结果 :缺氧刺激心肌细胞VEGF表达上调 ,PMA与Chelerythrine分别增强及减弱VEGF在缺氧心肌细胞中的表达。结论 :缺氧是心肌细胞表达VEGF的强烈刺激因素之一。缺氧诱导VEGF在心肌细胞中的表达 ,其信号传导途径部分是通过PKC通路实现的。