FOXM1促进心肌细胞H9C2细胞增殖、迁移和侵袭探究

探讨FOXM1促进心肌细胞H9C2细胞增殖,迁移和侵袭。方法:选取大鼠心肌细胞H9C2,将细胞分成3组:分别为空白对照组、阴性对照组以及siRNA-FOXM1阳性对照组;利用实时荧光定量PCR方法对细胞中FOXM1、VEGF以及bFGF的mRNA水平进行检测,通过CCK8法对细胞增殖进行检测;通过细胞划痕实验对细胞迁移能力进行检测;通过Transwell对细胞的侵袭能力进行检测;通过Western blot法对各细胞内的VEGF以及bFGF蛋白的表达进行检测。结果:相比较阴性以及空白对照组,对FOXM1的表达进行干扰之后,其mRNA以及蛋白的表达明显的下降(P<0.05);对FOXM1的表达进行抑制之后,H9C2细胞内部的bFGF以及VEGF的mRNA以及蛋白的表达也出现了明显的下降(P<0.05)。结论:FOXM1能够促进心肌细胞H9C2的增殖、迁移以及侵袭,对FOXM1进行抑制能够使得H9C2增殖、迁移以及侵袭受到抑制,具体的机制可能与VEGF以及bFGF表达有着密切的关系。

苦参碱对H_(2)O_(2)诱导的大鼠心肌细胞H9c2氧化损伤的保护作用及分子机制

目的探讨苦参碱对H_(2)O_(2)诱导的大鼠心肌细胞H9c2氧化损伤的保护作用及可能的作用机制。方法大鼠心肌细胞H9c2分为空白组(正常培养)、苦参碱组(正常培养+50μmol/L苦参碱培养24 h)、H_(2)O_(2)模型组(200μmol/L H_(2)O_(2)预处理3 h)、H_(2)O_(2)+苦参碱组(200μmol/L H_(2)O_(2)预处理3 h后加入50μmol/L苦参碱培养24 h)、H_(2)O_(2)+苦参碱+AM组(200μmol/L H_(2)O_(2)预处理3 h后加入50μmol/L苦参碱和5μmol/L AM培养24 h)。采用CCK-8法、流式细胞术检测细胞活性和凋亡情况;荧光法检测细胞内活性氧簇(ROS)水平和线粒体膜电位变化;用试剂盒检测各组细胞培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)水平以及细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性。Western blot检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路相关蛋白表达。结果与空白组相比,H_(2)O_(2)模型组细胞存活率降低,细胞凋亡率、ROS生成量、线粒体膜电位JC-1单体阳性细胞百分比及细胞培养上清中LDH和MDA水平增加,且细胞中SOD、CAT和GSH-Px活性降低,此外(p-P38 MAPK)/(P38MAPK)比值和(p-JNK)/(JNK)比值上调(P<0.05);然而苦参碱组上述指标与空白组相比无统计学差异(P>0.05)。与H_(2)O_(2)模型组相比,H_(2)O_(2)+苦参碱组细胞存活率升高,细胞凋亡率、ROS生成量、线粒体膜电位JC-1单体阳性细胞百分比以及细胞培养上清中LDH和MDA水平减少,且细胞中SOD、CAT和GSH-Px活性升高,此外(p-P38 MAPK)/(P38 MAPK)比值和(p-JNK)/(JNK)比值下调(P<0.05);然而与H_(2)O_(2)+苦参碱组相比,H_(2)O_(2)+苦参碱+AM组上述各种指标则被逆转(P<0.05)。结论苦参碱通过减少ROS的产生、增强抗氧化酶系统、维持线粒体功能等,对H9c2心肌细胞氧化应激损伤具有一定的保护作用,且作用机制与调控MAPK信号通路有关。

小檗碱对棕榈酸诱导大鼠心肌细胞H9c2脂毒性损伤的影响

目的:探讨小檗碱对棕榈酸(PA)诱导大鼠心肌细胞H9c2脂毒性损伤的影响。方法:在正常培养的H9c2细胞中,采用细胞计数试剂盒(CCK8)检测细胞存活率;采用ELISA试剂盒检测细胞裂解液中氧化还原指标:丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH);采用免疫印迹法Western blot检测细胞内能量感受器磷酸化AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)/AMPK及肝激酶B1(LKB1)、沉默调节蛋白1(SIRT1)和成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)的蛋白表达。结果:PA在100μmol·L^(-1)浓度时,处理H9c2细胞24 h以上产生明显细胞毒性,与正常对照组(不含PA)比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。使用5μmol·L^(-1)小檗碱预处理H9c2细胞4 h可以逆转PA对H9c2中MDA、SOD和GSH的影响,同时细胞存活率明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。同时,在给予小檗碱治疗后,p-AMPK/AMPK、LKB1、SIRT 1和FGF-21蛋白的表达水平亦显著增加(P<0.05)。但使用FGF21的干扰RNA(siRNA)后,小檗碱激活AMPK的现象几乎被逆转,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:小檗碱可显著改善PA诱导的心肌细胞脂毒性,其机制可能与经典的FGF-21/AMPK信号通路有关。

TGF-β2对心肌细胞H9C2转录因子表达的影响及其组蛋白H3乙酰化调控机制

目的探讨转化生长因子-β2(transforming growth factor beta2,TGF-β2)对心肌细胞H9C2转录因子Mef2c和GATA4的影响及其与组蛋白H3乙酰化的关系。方法比较TGF-β2对细胞生长的影响。利用Real-time PCR检测心肌细胞的心脏相关转录因子Mef2c和GATA4 mRNA的相对表达量,筛选合适的TGF-β2干预浓度。采用Western blot检测心肌细胞乙酰化组蛋白H3(acetylated histone H3,acH3)的表达差异。染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)Real-time PCR检测Mef2c和GATA4启动子区与acH3结合DNA的相对表达水平。比色分析法检测TGF-β2对心肌细胞的总体组蛋白乙酰化酶(HATs)活性的影响。结果①TGF-β2干预组相对于对照组心肌细胞的增殖能力增强(P<0.05)。②心肌细胞的心脏相关转录因子Mef2c和GATA4 mRNA的相对表达量随着TGF-β2浓度的升高呈现先升高后降低的趋势,在5μg/L的浓度时均达到最高,Mef2c mRNA相对表达量是对照组的1.8倍,GATA4 mRNA是对照组的2.3倍(P<0.05)。③TGF-β2干预72 h后acH3蛋白表达量是对照组的4倍(P<0.05),HATs活性是对照组的1.34倍(P<0.05)。④TGF-β2干预组Mef2c和GATA4启动子区组蛋白H3的乙酰化水平分别是对照组的2.56和2.16倍(P<0.05)。结论 5μg/L TGF-β2可以促进心肌细胞H9C2的分裂与增殖,并上调心脏相关转录因子Mef2c和GATA4的表达,组蛋白H3乙酰化水平的升高可能是Mef2c和GATA4表达上调的机制之一。

当归挥发油对缺氧/复氧损伤大鼠心肌细胞H9C2自噬的调控作用研究

目的:探讨当归挥发油对缺氧/复氧(H/R)损伤大鼠心肌细胞H9C2自噬的调控作用。方法:以大鼠心肌细胞H9C2为对象,在CCK-8法筛选当归挥发油最佳给药浓度和给药时间的基础上,采用酶联免疫吸附测定法检测当归挥发油作用后细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性;以自噬抑制剂(3-甲基腺嘌呤,5 mmol/L)为阳性对照,采用MDC法和Western blotting法分别检测药物作用后细胞中MDC的平均荧光强度以及自噬相关蛋白[Beclin-1、微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、LC3Ⅰ]的表达情况。结果:经0.6μmol/L当归挥发油作用6 h后,与空白组比较,H/R组细胞上清液中LDH活性和细胞中MDC平均荧光强度、Beclin-1表达水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均显著升高,细胞中p62表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01);与H/R组比较,H/R+药物组细胞上清液中LDH活性,H/R+药物组和H/R+自噬抑制剂组细胞中MDC平均荧光强度、Beclin-1表达水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均显著降低,细胞中p62表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论:当归挥发油可通过调控自噬相关蛋白的表达来降低H/R损伤心肌细胞的自噬水平。

丹参酮ⅡA对大鼠心肌细胞H9C2氧化损伤的保护作用

目的:探究丹参酮ⅡA对大鼠心肌细胞H9C2氧化损伤的保护作用。方法:建立H2O2诱导大鼠心肌细胞H9C2氧化损伤模型。将体外培养的H9C2细胞随机分为空白对照组、DMSO溶剂对照组、H2O2模型组、丹参酮ⅡA高、中、低剂量组。用MTT法测定心肌细胞存活率,并检测培养液上清中乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)以及丙二醛(MDA)的水平。结果:与空白对照组相比,H2O2模型组细胞存活率显著降低,LDH、MDA水平升高,SOD水平降低;与H2O2模型组相比,丹参酮ⅡA高剂量组心肌细胞存活率显著增高,LDH和MDA水平降低,SOD水平升高(P<0.01)。结论:丹参酮ⅡA能够减轻心肌细胞氧化损伤。

红花黄色素对心肌细胞H9C2的保护研究

目的探讨红花黄色素调控缺氧/复氧后心肌细胞对H9C2氧化应激的潜在机制。方法红花黄色素处理缺氧/复氧后心肌细胞H9C2后,检测其氧化应激指标丙二醛(MDA),过氧化氢酶(CAT),超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的水平。实时荧光定量PCR检测氧化应激关键基因的表达水平。RNA-seq检测红花黄色素处理后心肌细胞H9C2的miRNA表达差异。表达差异miRNA检测氧化应激关键基因的表达水平。结果红花黄色素处理缺氧/复氧后心肌细胞H9C2后,MDA的水平下降(P<0.05),SOD、CAT、GSH-Px的水平上升(P<0.05)。红花黄色素处理缺氧/复氧后心肌细胞H9C2后,氧化应激关键基因MPO的表达水平下降(P<0.05),SOD2,CAT,谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达水平上升(P<0.05)。过表达hsa-miR-887-5p时MPO的表达水平下降(P<0.05)、过表达hsa-miR-382-5p时SOD2的表达水平下降(P<0.05)、过表达hsa-miR-639时CAT2的表达水平下降(P<0.05)、过表达hsa-miR-761时GPX4的表达水平下降(P<0.05)。结论红花黄色素通过调控hsa-miR-382-5p、hsa-miR-887-5p、hsa-miR-639、hsa-miR-761的表达水平,分别靶向SOD2,MPO,CAT,GPX4 mRNA的3端非编码区,之后调控其表达水平,最终调节缺氧/复氧后心肌细胞H9C2的氧化应激。

苓桂术甘汤含药血清对TGF-β_1诱导的大鼠心肌细胞H9c2中TNF-α、IL-6和IL-1β的影响

目的观察苓桂术甘汤(Linggui Zhugan decoction,LGZGD)含药血清对转化生长因子-β_1(Transforming growth factor,TGF-β_1)诱导的大鼠心肌细胞H9c2损伤的保护作用。方法分别使用10%的空白大鼠血清、LGZGD小、中、大剂量组含药血清和大鼠心肌细胞H9c2共培养,12 h后加入20 ng·m L^(-1)的TGF-β_1建立大鼠心肌细胞损伤模型,继续培养12 h后采用ELISA法检测细胞中TNF-α、IL-6和IL^(-1)β的含量。结果与正常组比,TGF-β_1组TNF-α、IL-6和IL^(-1)β的含量明显升高(P<0.01),与TGF-β_1组比,LGZGD 4.2,8.4 g·kg^(-1)组的TNF-α的含量显著下降,分别由(323.839±35.614)下降至(191.399±43.203)和(175.030±19.589)ng·L^(-1)(P<0.05、P<0.01);LGZGD 4.2,8.4g·kg^(-1)组的IL-6的含量由(67.171±13.506)下降至(40.490±7.899)(30.548±2.226)ng·L^(-1)(P<0.05、P<0.01),LGZGD2.1,4.2,8.4 g·kg^(-1)组的IL^(-1)β含量由(23.463±3.053)下降至(14.793±4.244)、(14.600±3.517)和(9.253±2.720)ng·L^(-1)(P<0.05、P<0.01)。结论 LGZGD含药血清对TGF-β_1诱导的大鼠心肌细胞H9c2的损伤有显著的保护作用。

miR-19b对H_2O_2诱导的大鼠心肌细胞H9c2氧化应激损伤的保护作用及机制研究

目的研究microRNA(miR)-19b是否在H2O2诱导的心肌细胞的氧化应激损伤中具有保护作用。方法将大鼠H9c2心肌细胞株分为6组,空白对照组(L1),H2O2组(L2),H2O2+miR-19b mimic阴性对照(NC)组(L3),H2O2+miR-19b mimic组(L4),H2O2+miR-19b inhibitor组(L5),H2O2+miR-19b inhibitor NC组(L6)。NC组细胞转染随机合成的miRNA片段作为阴性对照。采用CCK8和流式细胞术检测细胞活性和凋亡情况,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测miR-19b的表达量,并利用试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)水平,Western blot法检测核因子相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶-1(HO-1)表达水平。结果与L1组比较,L2组和L3组中miR-19b表达量、H9c2细胞活性和细胞内SOD、GSH水平均显著降低(P<0.01),细胞凋亡率和细胞内LDH、MDA水平、Nrf2和HO-1表达水平均显著增加(P<0.01)。与L2组及L3组比较,L4组中miR-19b表达量、H9c2细胞活性和细胞内SOD、GSH水平、Nrf2和HO-1表达水平均显著增加(P<0.01),细胞凋亡率和细胞内LDH、MDA水平均显著降低(P<0.01),L5组中miR-19b表达量和H9c2细胞活性和细胞内SOD、GSH水平、Nrf2和HO-1表达水平均显著降低(P<0.01),细胞凋亡率和细胞内LDH、MDA水平均显著增加(P<0.01),L6组miR-19b表达量、H9c2细胞活性、细胞凋亡率、细胞内SOD、GSH、LDH、MDA水平以及Nrf2和HO-1表达水平均未见统计学差异(P>0.05)。结论miR-19b高表达可显著抑制H9c2细胞的氧化应激损伤,发挥心肌细胞保护作用。

三参通脉合剂通过上调microRNA-146a改善大鼠心肌细胞H9C2的氧化损伤

目的 探讨三参通脉(Sanshentongmai, SSTM)合剂调节微小RNA-146a(microRNA-146a)对大鼠心肌细胞H9C2氧化损伤的影响及作用机制。方法 体外培养大鼠心肌细胞H9C2,过氧化氢(H_(2)O_(2))作为氧化剂制作H9C2氧化应激模型。通过三参通脉干预,观察H_(2)O_(2)诱导的H9C2细胞氧化损伤的变化以及microRNA-146a的表达,探讨三参通脉对H9C2的保护作用及其作用机制。将体外培养的H9C2分为空白组、H_(2)O_(2)氧化损伤模型组(简称模型组)、H_(2)O_(2)模型+三参通脉药物(500μg/mL,处理72 h)组(简称模型加药组)。通过细胞计数试剂盒CCK8检测细胞活力,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测血清N端脑钠肽前体(N-terminal pro-brain natriuretic peptide, NtproBNP)、一氧化氮(nitric oxide, NO)、超敏C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein, Hs-CRP)和血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ)水平,实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测系统检测microRNA-146a表达水平。结果 通过CCK8法检测细胞活力,发现在药物质量浓度为500μg/mL时,细胞增殖改善达到顶峰,故选用此浓度为干预浓度。ELISA检测的心衰相关指标:Nt-proBNP、NO、Hs-CRP、angiotensinⅡ水平中,与空白组比较,模型加药物组中Nt-proBNP、angiotensinⅡ表达上调(P<0.05),NO表达下调(P<0.05),Hs-CRP与空白组比较表达差异无统计学意义,说明三参通脉可以有效改善大鼠心肌细胞H9C2氧化损伤。最后,RT-PCR法检测microRNA-146a在各组的表达可以看出,15μmol/L H_(2)O_(2)处理可以明显降低microRNA-146a表达,而模型加药组中microRNA-146a表达较模型组升高(P<0.05),与空白组对比差异无统计学意义。结论 三参通脉可以明显抵抗H_(2)O_(2)诱导的H9C2细胞氧化损伤,可能是通过上调microRNA-146a从而发挥心肌保护作用。

交趾黄檀新黄酮类成分及其抗H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤活性研究

目的研究交趾黄檀Dalbergia cochinchinensis Pierre ex Laness的新黄酮类成分及其抗H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤活性。方法交趾黄檀70%乙醇提取物采用硅胶、Sephadex LH-20、反相制备HPLC进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。采用CCK-8法检测其对H9c2心肌细胞的活性及对H9c2细胞缺氧/复氧损伤的保护作用,并分析其构效关系。结果从中分离得到12个化合物,分别鉴定为阔叶黄檀酚(1)、5-O-methyllatifolin(2)、mimosifoliol(3)、5-O-methydalbergiphenol(4)、dalbergiphenol(5)、cearoin(6)、2,4-dihydroxy-5-methoxy-benzophenone(7)、2-hydroxy-4,5-dimethoxybenzophenone(8)、melannoin(9)、2,2′,5-trihydroxy-4-methoxybenzophenone(10)、黄檀素(11)、4-甲氧基黄檀醌(12)。黄檀酚及黄檀内酯类化合物对H9c2细胞毒性较小,黄檀酚类化合物抗H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤活性较强。结论化合物8为新天然产物,化合物4、9为首次从该植物中分离得到。黄檀酚类化合物可能是抗H9c2细胞缺氧/复氧损伤的主要新黄酮类成分。

PPARγ低表达对Ang Ⅱ诱导H9c2心肌细胞肥大的影响

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ低表达对血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的H9c2心肌细胞肥大(MCR)的作用及可能机制。方法 采用H9c2心肌细胞,拟高糖培养基与药物AngⅡ构建MCR模型。采用AD-PPARγRNAi重组腺病毒载体,感染到H9c2心肌细胞中,将实验分为对照组、Vehicle组、AD-PPARγRNAi组、MCR组、MCR+Vehicle组、MCR+AD-PPARγRNAi组。形态学上采用苏木素-伊红(HE)染色法观察MCR时形态大小的变化。通过Western印迹法检测PPARγ、肌球蛋白重链(MYH)7B、心钠肽(ANP)蛋白表达情况。结果 HE染色结果显示,MCR组与对照组比较、MCR+Vehicle组与Vehicle组比较、MCR+AD-PPARγRNAi组与AD-PPARγRNAi组比较,H9c2细胞核形态大小均变大。Western印迹结果显示:与对照组比较,MCR组MYH7B、ANP表达明显增加(P<0.05)。AD-PPARγRNAi重组腺病毒感染H9c2心肌细胞后,AD-PPARγRNAi组与对照组和Vehicle组比较,PPARγ表达明显降低,MYH7B、ANP表达明显增加(P<0.05);MCR+AD-PPARγRNAi组与MCR组和MCR+Vehicle组比较,PPARγ表达明显降低,MYH7B、ANP表达明显增加(P<0.05)。结论 经AngⅡ诱导的H9c2心肌细胞MYH7B、ANP表达增加,AD-PPARγRNAi重组腺病毒感染H9c2心肌细胞后PPARγ表达下降且MYH7B、ANP表达增加。推测由AngⅡ诱导MCR后PPARγ低表达干预可能影响心肌细胞进一步增厚,且PPARγ高表达可能逆转心肌肥厚。

丙泊酚后处理在高糖环境下改善H9c2心肌细胞缺氧/复氧诱导的凋亡和自噬

目的探讨丙泊酚后处理(propofol postconditioning,P-Post C)在高糖环境下对H9c2心肌细胞缺血/复氧诱导的凋亡和自噬的改善作用。方法2023年4月于上海市奉贤区中心医院开展实验,将大鼠心脏来源的H9c2细胞暴露于高糖48 h,然后在不存在或存在不同浓度的P-Post C后处理的情况下,在缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)。细胞分组:NC组、HG组、NC+H/R组、HG+H/R组、HG+H/R+P12.5组、HG+H/R+P25组、HG+H/R+P50组、HG+H/R+P100组和HG+H/R+P25+Brusatol组。确定丙泊酚的浓度后,在使用或不使用Nrf2/HO-1通路抑制剂的情况下,对H9c2细胞进行H/R和P-Post C处理,以探索它们在P-Post C介导的高糖下对凋亡和自噬细胞死亡的保护中的作用。结果结果显示,含或不含H/R的高糖降低了H9c2细胞的活力,增加了乳酸脱氢酶的释放和活性氧的产生,所有这些都被P-Post C显著逆转,尤其是在25μmol/L(P25)浓度下(P<0.05)。此外,发现丙泊酚(P25)降低H9c2细胞的凋亡和自噬,同时增加Nrf2和HO-1的表达(P<0.05)。丙泊酚(P25)对H/R损伤的保护作用通过使用Nrf2/HO-1通路抑制剂而逆转(P<0.05)。结论P-Post C通过上调高糖状态下的Nrf2/HO-1通路活性,减轻了H/R损伤诱导的H9c2心脏细胞凋亡和自噬。

金银花提取物对脂多糖诱导H9c2心肌细胞的炎症、氧化损伤和凋亡的作用机制

本研究旨在探究金银花提取物对脂多糖诱导下H9c2心肌细胞炎症、氧化损伤和凋亡的作用机制。方法 使用H9c2心肌细胞作为研究对象,分为对照组、脂多糖诱导组和金银花提取物处理组。然后通过对炎症相关因子表达水平、氧化损伤标志物和凋亡相关因子表达水平的检测结果对细胞的炎症反应、氧化损伤和凋亡情况进行进一步的评估。结果 与脂多糖诱导组相比,金银花提取物处理组显示出明显的抑制炎症反应、减轻氧化损伤和凋亡的作用。金银花提取物处理组中炎症相关因子表达水平显著降低,氧化损伤标志物水平较低,并且凋亡相关因子表达水平明显减少。结论 金银花提取物对脂多糖诱导的H9c2心肌细胞具有抗炎、抗氧化和抗凋亡的作用。通过研究结果可以得出,金银花提取物可能成为预防和治疗心肌细胞炎症、氧化损伤以及凋亡相关疾病的潜在药物。

滋膵通脉饮对高糖诱导大鼠H9c2心肌细胞自噬和凋亡的影响及机制

目的 探讨滋膵通脉饮对高糖诱导的大鼠H9c2心肌细胞自噬和凋亡的影响及机制。方法 将20只无特定病原级Sprague Dawley大鼠按随机数字表法分为空白血浆组和滋膵通脉饮组,每组10只。滋膵通脉饮组大鼠每天给予10 mL·kg^(-1)滋膵通脉饮灌胃,空白血浆组大鼠给予等剂量灭菌超纯水灌胃,连续灌胃7 d,采集腹主动脉血,分离血浆备用。取对数生长期H9c2心肌细胞,按随机数字表法分为正常对照组、空白对照组和滋膵通脉饮组,分别加入稀释后的胎牛血清、空白血浆组血浆及滋膵通脉饮组血浆,每组设置体积分数5%、10%、15%的浓度梯度,应用细胞计数试剂盒-8法检测各组H9c2心肌细胞增殖情况,筛选最佳含药血浆浓度。取对数生长H9c2细胞,按随机数字表法分为正常对照组、高糖诱导组、高糖诱导+中药含药血浆组、高糖诱导+恩格列净组,正常对照组细胞不加任何药物干预,高糖诱导组细胞加33.3 mmol·L^(-1) D-葡萄糖和体积分数10%空白血浆组血浆,高糖诱导+中药含药血浆组细胞加33.3 mmol·L^(-1) D-葡萄糖和体积分数10%滋膵通脉饮组血浆,高糖诱导+恩格列净组细胞加33.3 mmol·L^(-1)的D-葡萄糖和0.01μmol·L^(-1)恩格列净;给药24 h后,使用细胞毒性比色法检测各组细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放率,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组细胞中自噬和凋亡相关蛋白p62、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Bcl-2的表达。结果 体积分数5%、15%浓度时,滋膵通脉饮组H9c2细胞增殖能力显著低于正常对照组和空白对照组(P<0.05);正常对照组与空白对照组H9c2细胞增殖能力比较差异无统计学意义(P>0.05)。体积分数10%浓度时,正常对照组、空白对照组和滋膵通脉饮组H9c2细胞增殖能力比较差异无统计学意义(F=0.110,P>0.05)。正常对照组、高糖诱导+中药含药血浆组和高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞凋亡率显著低于高糖诱导组(t=43.527、23.836、21.617,P<0.01);高糖诱导+恩格列净组和高糖诱导+中药含药血浆组H9c2细胞凋亡率显著高于正常对照组(t=14.933、11.723,P<0.05);高糖诱导+中药含药血浆组与高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞凋亡率比较差异无统计学意义(t=1.995,P>0.05)。正常对照组、高糖诱导+中药含药血浆组和高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞LDH释放率显著低于高糖诱导组(t=58.660、31.408、26.557,P<0.01);高糖诱导+恩格列净组和高糖诱导+中药含药血浆组H9c2细胞LDH释放率显著高于正常对照组(t=14.167、11.740,P<0.05);高糖诱导+中药含药血浆组与高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞LDH释放率比较差异无统计学意义(t=1.801,P>0.05)。正常对照组、高糖诱导+中药含药血浆组和高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞中p62、Bax表达水平显著低于高糖诱导组,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcl-2表达水平显著高于高糖诱导组(P<0.05);高糖诱导组H9c2细胞中Bcl-2/Bax显著低于正常对照组和高糖诱导+中药含药血浆组(P<0.05);高糖诱导组与高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞中Bcl-2/Bax比较差异无统计学意义(P>0.05);高糖诱导+恩格列净组和高糖诱导+中药含药血浆组H9c2细胞中p62、Bax显著高于正常对照组,Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcl-2/Bax显著低于正常对照组(P<0.05)。高糖诱导+中药含药血浆组与高糖诱导+恩格列净组p62、Bax、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcl-2表达水平及Bcl-2/Bax比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 滋膵通脉饮可激活高糖诱导H9c2心肌细胞自噬,抑制H9c2细胞凋亡,减轻心肌细胞损伤。

滋膵通脉饮通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路减轻高糖诱导的H9c2心肌细胞损伤的实验研究

目的:通过对高糖诱导的H9c2心肌细胞自噬和凋亡可能涉及的信号通路(PI3K-Akt-mTOR)进行研究,探讨滋膵通脉饮抑制心肌细胞凋亡的作用机制。方法:SD大鼠随机分为空白血浆组、滋膵通脉饮组,每组10只。连续灌胃7d,制备相应的含药血浆。滋膵通脉饮组药物浓度为4.4g/mL,灌胃量为10mL·kg^(-1)·d^(-1);空白血浆组采用等剂量的灭菌超纯水灌胃(给药体积为10mL/kg)。把H9c2心肌细胞分为正常组、空白血浆组和含药血浆组,分别加入胎牛血清,空白血浆和含药血浆,每组均设置5%、10%、15%的浓度梯度。通过CCK-8法比较各组H9c2心肌细胞增殖情况,计算细胞存活率,筛选含药血浆。将高糖诱导的H9c2心肌细胞随机分成3组:模型组、滋膵通脉饮含药血浆组和恩格列净组,加上正常组,共4组,给药24h后,IF检测LC3B在H9c2心肌细胞的表达。Western blot法检测PI3K-Akt-mTOR信号通路蛋白和凋亡相关蛋白Caspase-3的表达。结果:含药血浆及空白血浆在10%的药物浓度水平对细胞增殖无明显影响,作为本次含药血浆实验干预的浓度。与正常组比较,模型组心肌细胞LC3BⅡ/LC3BⅠ表达明显降低,PI3K、P-Akt、mTOR和Caspase-3的蛋白表达明显升高(P<0.05);与模型组比较,滋膵通脉饮含药血浆组与恩格列净组LC3BⅡ/LC3BⅠ表达明显升高,PI3K、P-Akt、mTOR和Caspase的蛋白表达明显降低(P<0.05);滋膵通脉饮含药血浆组与恩格列净组LC3BⅡ/LC3BⅠ表达、PI3K、P-Akt、mTOR和Caspase-3的蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:滋膵通脉饮可激活心肌细胞自噬而抑制心肌细胞凋亡,这可能与抑制PI3K/P-Akt/mTOR信号通路有关。

SFRP1减轻血管紧张素Ⅱ诱导H9C2心肌细胞损伤的机制

目的研究分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)1减轻血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导H9C2心肌细胞损伤的机制。方法体外培养和扩增足量H9C2心肌细胞系,给予1μmol/L AngⅡ刺激H9C2心肌细胞建立一个体外心肌肥大模型。采用腺相关病毒9型(AAV9)-SFRP1对其进行过表达处理,用细胞计数试剂盒(CCK)8活力测定细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,Western印迹分析相关蛋白表达率,检测心肌肥大指标细胞面积。结果AngⅡ诱导后,H9C2细胞凋亡率明显升高,增殖率明显降低,给予过表达SFRP1后细胞凋亡率显著降低,增殖率明显升高(P<0.05)。过表达SFRP1可明显逆转AngⅡ诱导对H9C2细胞的B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)、细胞色素(Cyt)c和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase-3)等蛋白表达促进和Bcl-2蛋白表达抑制作用及对心房钠尿肽(ANP)、脑钠尿肽(BNP)和β-肌球蛋白重链(MHC)等心肌肥大蛋白促进作用(P<0.05)。同时过表达SFRP1可促进ATG5和Beclin1等自噬相关蛋白表达(P<0.05)。结论过表达SFRP1能够促进心肌细胞增殖和抑制凋亡,同时启动心肌肥大进程中自噬程序,清除凋亡心肌细胞,是抑制心肌肥大的重要基因和潜在治疗靶点。

黑果枸杞花青素对低氧诱导的H9c2大鼠心肌细胞凋亡的影响

旨在探究青海柴达木黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murray)花青素(anthocyanidin,AC)对低氧诱导的H9c2大鼠心肌细胞凋亡的影响,作者选用H9c2大鼠心肌细胞为研究对象,设常氧组、低氧组、低氧+黑果枸杞花青素组和低氧+红景天苷(salidroside,Sal)组,采用酶标仪检测其细胞乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)含量、显微镜观察其细胞形态学变化、荧光酶标仪检测其细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量、Hoechst33342/PI双染法检测其细胞凋亡程度、流式细胞术检测其细胞凋亡率、qRT-PCR法和Western blot法分别检测细胞凋亡因子B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl2)及Bcl2相关蛋白(Bcl2-associated X,Bax)在mRNA水平和蛋白水平的表达。结果表明,与常氧组相比,低氧能极显著增加LDH、ROS含量和细胞凋亡率(P<0.01),极显著下调Bcl2、Bcl-2/Bax比值的mRNA和蛋白表达(P<0.01),极显著上调Bax的mRNA和蛋白表达(P<0.01)。在低氧条件下,黑果枸杞花青素可显著减少LDH、ROS含量(P<0.05),细胞凋亡率极显著减少(P<0.01),显著上调Bcl-2和Bcl2/Bax比值的mRNA和蛋白表达(P<0.05),极显著下调Bax的蛋白表达(P<0.01)。综上可知,在低氧条件下,黑果枸杞花青素可通过降低LDH和ROS含量,上调Bcl2和Bcl2/Bax比值在mRNA水平和蛋白水平的表达,下调Bax的蛋白表达来有效延缓低氧诱导的H9c2大鼠心肌细胞的凋亡,对低氧诱导的H9c2大鼠心肌细胞具有保护作用。

基于miR-126-5p/Bcl-2/mPTP通路探究稳心汤对缺氧/复氧诱导H9c2心肌细胞损伤修复的作用机制

目的:观察稳心汤对缺氧/复氧诱导的H9c2心肌细胞损伤的影响,并基于miR-126-5p/Bcl-2/心肌细胞线粒体通透性转换孔(mPTP)调控通路明确其作用机制。方法:使用5%CO_(2)、1%O_(2)、94%N 2培养箱构建H9c2心肌细胞缺氧/复氧模型,并通过细胞转染技术达到miR-126-5p的过表达与抑制。待干预结束后观察心肌细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)释放水平、心肌细胞活性氧(ROS)含量;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测心肌细胞凋亡;流式细胞仪检测心肌细胞线粒体mPTP开放水平;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测细胞色素C(Cyt-C)释放水平与Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平;实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测miR-126-5p及Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的RNA表达水平。结果:与miR-126-5p低表达组比较,miR-126-5p过表达可显著降低LDH释放水平;减少心肌细胞ROS含量;改善心肌细胞凋亡率;提高心肌细胞CalceinAM水平,减少mPTP开放。miR-126-5p过表达可以减少H9c2心肌细胞Cyt-C释放水平,miR-126-5p低表达可部分减少H9c2心肌细胞Cyt-C释放水平。miR-126-5p过表达可上调Bcl-2蛋白与基因表达,下调Caspase-3与Caspase-9蛋白与基因表达。miR-126-5p低表达可部分上调miR-126-5p表达水平与Bcl-2蛋白与基因表达;部分下调Caspase-3与Caspase-9蛋白与基因表达。结论:稳心汤改善缺氧/复氧诱导的H9c2心肌细胞损伤可能与调控miR-126-5p/Bcl-2/mPTP信号通路有关,从而减轻氧化应激反应,降低线粒体膜通透性,抑制心肌细胞凋亡,延缓心肌损伤。

黑果枸杞花青素对H9c2大鼠心肌细胞抗氧化能力、炎性因子及能量代谢作用的影响

试验旨在探究青海柴达木黑果枸杞花青素(AC)对H9c2大鼠心肌细胞氧化应激损伤的影响,选用H9c2大鼠心肌细胞为研究对象,设立常氧组、常氧+AC组、低氧组和低氧+AC组,利用ELISA法检测各组细胞中过氧化物酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、血红素加氧酶-1(HO-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-10(IL-10)以及能量代谢相关因子Na^(+)-K^(+)-ATP酶、Ca^(2+)-ATP酶的变化。结果显示,与常氧组相比,常氧+AC组大鼠心肌细胞MDA、TNF-α、IL-6的含量均显著降低(P<0.05),CAT、HO-1、Na^(+)-K^(+)-ATP酶、Ca^(2+)-ATP酶活性显著升高(P<0.05),GSH-Px、SOD活性和IL-10含量均极显著升高(P<0.01);低氧组大鼠心肌细胞GSH-Px、HO-1、Na^(+)-K^(+)-ATP酶活性显著降低(P<0.05),CAT、SOD、Ca^(2+)-ATP酶活性和IL-10含量均极显著降低(P<0.01),MDA、TNF-α、IL-6含量均极显著升高(P<0.01)。与低氧组相比,低氧+AC组大鼠心肌细胞MDA、TNF-α、IL-6含量均极显著降低(P<0.01),CAT、GSH-Px、SOD、HO-1、Na^(+)-K^(+)-ATP酶、Ca^(2+)-ATP酶活性和IL-10含量均极显著升高(P<0.01)。研究表明,AC能够通过减轻H9c2大鼠心肌细胞氧化应激损伤,增强低氧下心肌细胞的能量代谢,抑制低氧诱导的炎症发生,进而缓解H9c2大鼠心肌细胞的低氧损伤。