腺相关病毒介导心肌肌浆网钙离子ATP酶2a基因转导对慢性心力衰竭大鼠的短期治疗作用

目的研究腺相关病毒为载体的心肌肌浆网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)基因转导对慢性心力衰竭(CHF)大鼠的短期治疗作用。方法将大鼠分为4个组:对照组,CHF组,CHF+eGFP组和CHF+SERCA2a组。采用腹主动脉缩窄术建立慢性心力衰竭大鼠模型,应用经腹心包腔内注射术分别将生理盐水、携带eGFP基因的重组腺相关病毒和携带SERCA2a基因的重组腺相关病毒导入CHF组、CHF+eGFP组和CHF+SERCA2a组大鼠心脏。于导入后10天检测各组大鼠的心脏收缩和舒张功能、SERCA2a蛋白表达水平和活性。结果慢性心力衰竭大鼠心脏内转导入SERCA2a基因10天后,CHF+eGFP组SERCA2a蛋白表达水平和活性较CHF组大鼠明显增加(SERCA2a蛋白表达增加80.7%,活性增加89.9%),但低于对照组大鼠蛋白表达水平(约为对照组的67.6%)和活性水平(约为对照组的77.7%);大鼠的心脏功能随着SERCA2a功能的增强而改善,左室收缩压峰值和左室内压最大下降速率已达到对照组水平,左室舒张末压力和左室内压最大上升速率虽未达到对照组水平,但较CHF组明显改善。结论CHF大鼠心脏SERCA2a蛋白表达水平及活性较对照大鼠明显下降;SERCA2a基因转导对慢性心力衰竭具有良好的短期治疗作用。

基于NCX/SERCA2a平衡假说探讨燧心胶囊对心肌梗死后心衰大鼠的心肌保护作用

目的观察燧心胶囊对心肌梗死后心衰(HF)大鼠的心肌保护作用,并初步探究作用机制。方法将大鼠分为假手术组、模型组及燧心胶囊低、中、高剂量组、阳性药物组(卡托普利),观察大鼠心肌组织形态学和心肌组织梗死体积变化;检测大鼠心室功能、血清中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)水平、心肌组织中钠钙交换蛋白(NCX)、肌浆网钙泵2a(SERCA2a)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Cleaved-Cas-pase-3蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、心肌梗死体积比例、左心室质量指数(LVMI)、心肌细胞凋亡率、AngⅡ、ALD及NCX、Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表达升高,左室收缩期后壁厚度(LVPWDs)、左心室射血分数(LVEF)、左室缩短分数(LVFS)及SERCA2a、Bcl-2蛋白表达降低(P <0.05)。与模型组比较,燧心胶囊各组与阳性药物组LVEDD、LVESD、心肌梗死体积比例、LVMI、心肌细胞凋亡率、AngⅡ、ALD及NCX、Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表达均显著降低,LVPWDs、LVEF、LVFS及SERCA2a、Bcl-2蛋白表达均显著升高(P <0.05)。与阳性药物组比较,燧心低剂量组LVEDD、AngⅡ、ALD及燧心低、中剂量组LVESD、心肌梗死体积比例、心肌细胞凋亡率、Bax、Cleaved-Caspase-3及燧心胶囊各剂量组NCX均显著升高,燧心胶囊各剂量组SERCA2a及燧心低、中剂量组LVEF、Bcl-2均显著降低(P <0.05)。燧心胶囊各剂量组LVEDD、LVESD、心肌梗死体积比例、心肌细胞凋亡率、AngⅡ及NCX、Bax、Cleaved-Caspase-3随剂量增加呈下降趋势,LVEF、SERCA2a、Bcl-2则呈上升趋势。结论燧心胶囊对心肌梗死后心衰大鼠的心肌具有保护作用,其作用可能通过恢复NCX/SERCA2a平衡,从而降低心肌梗死引起的组织损伤和细胞凋亡来实现的。

同一滴度不同方法转染AAV9-SERCA2a基因对大鼠的有效性和毒副作用评价

目的研究同一滴度不同心脏基因转染方法转染携带肌浆网钙ATP酶2a(sarcoplasmic reticulumCa2+ATPase 2a,SERCA2a)基因的9型腺相关病毒(adeno-associated virus serotype 9,AAV9)即AAV9-SERCA2a对SD大鼠心肌的有效性及对机体毒副作用的影响。方法体外成功构建AAV9-SERCA2a-EGFP病毒载体系统,90只雄性SD大鼠随机分为尾静脉注射(tail vein injection,TVI)组、心肌注射(intramyocardial injection,IMI)组、心包腔注射(intrapericardial injection,IPI)组,采用相应方法在体分别转染滴度1×1011vg/mL AAV9-SERCA2a-EGFP、AAV9-EGFP、NS各200μL。转染后30 d,荧光显微镜下观察心肝肾组织绿色荧光表达情况,Western blot检测SER-CA2a基因在大鼠各组织的相对表达量,体表12导联心电图检测心律失常发生率,HE染色观察病理学变化,心脏彩色多普勒超声评价心功能,血液生化学指标检测肝肾功能。结果三组左心室可见大量绿色荧光表达,IMI组荧光局限在注射点,三组肝肾组织均可见微弱荧光;三组心肌SERCA2a蛋白相对表达量显著高于肝肾(P<0.01),TVI组和IMI组心肌SERCA2a蛋白相对表达量明显高于IPI组(P<0.01);TVI组和IPI组心电图正常,IMI组2只大鼠发生室性早搏;三组转染AAV9-EGFP、AAV9-SERCA2a-EGFP与转染NS相比,心功能、组织病理学、血液生化学指标差异均无显著性(P>0.05)。结论三种方法转染滴度1×1011vg/mL AAV9-SERCA2a基因,TVI法和IMI法在心肌的有效性优于IPI法,TVI法和IPI法对机体的毒副作用小于IMI法,综合三种方法的有效性和毒副作用评价,TVI法优于IMI法和IPI法。

应用Ad Easy腺病毒载体系统构建人肌浆网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)

目的:利用Adeasy腺病毒表达系统构建含人肌浆网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒。方法:将人SERCA2a基因全长cDNA(3700bp)插入到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,成功构建pAd-TrackCMVSERCA2a重组质粒,经PmeI酶切线性化,采用电击法转入到已含Adeasy质粒的电感受态菌BJ5183进行重组。挑选同源重组质粒,PacI酶切线性化转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒,荧光检测有绿色荧光蛋白表达。将重组病毒和SD大鼠心肌细胞共培养,western-blot检测SERCA2a可以在大鼠心肌细胞过表达且影响了胞内SERCA2a的活性。结果:成功包装含人SERCA2a基因的重组腺病毒,并可以有效感染SD大鼠心肌细胞。结论:利用新型腺病毒载体在短时间内成功构建了携带有人SERCA2a基因的腺病毒,为以后进一步研究人SERCA2a基因治疗提供了新途径。

钙离子ATP酶2a基因修饰的骨髓干细胞移植治疗大鼠心肌梗死后心力衰竭的研究

目的比较肌浆网钙离子ATP酶2 a(SERCA2 a)基因治疗,骨髓干细胞(MSC)移植以及SERCA2 a基因修饰的细胞移植治疗慢性缺血性心力衰竭的效应,评价MSC作为治疗基因的细胞载体策略的可行性。方法制作心力衰竭大鼠模型并随机分为4组。SERCA2 a基因治疗组(组Ⅰ,7只),MSC细胞移植组(组Ⅱ,7只),基因修饰的细胞移植组(组Ⅲ,8只),腺病毒空载体对照组(组Ⅳ,7只)。检测各组SERCA2 a基因,蛋白表达及活性。超声心动图及有创血流动力学评价心脏功能。HE染色观察心室形态。结果组Ⅰ,组Ⅱ,组Ⅲ比对照组Ⅳ心功能和血流动力学明显改善。治疗后组Ⅱ(2.9 mm±0.2 mm)和组Ⅲ(3.0 mm±0.1 mm)大鼠室壁厚度增加,心室腔减小。治疗后14d组Ⅰ,组Ⅱ与组Ⅲ射血分数(EF)为26.6%±3.9%,20.6%±5.0%,25.6%±2.7%。短轴缩短率(FS)分别为13.3%±2.0%,10.1%±2.5%,12.1%±1.0%(P<0.05)。治疗后21 d组Ⅰ,组Ⅱ与组ⅢEF分别为19.7%±5.0%,21.4%±5.2%,26.6%±4.1%,FS分别为9.7%±2.5%,10.7%±2.6%,12.8%±2.2%(P<0.05)。组Ⅳ治疗后14 d EF无变化,治疗后21 d EF下降了6.6%±4.0%。组Ⅰ和组ⅢSERCA2 a基因,蛋白表达及酶活性均高于组Ⅱ和组Ⅳ(P<0.01)。结论MSC移植和SERCA2 a基因修饰的细胞移植组大鼠呈现稳定持续的心功能改善作用。MSC可以作为治疗基因的有效转移载体。

银杏叶提取物对D-半乳糖诱导心肌细胞老化的肌浆网钙摄取及SERCA活性的影响

目的探讨银杏叶提取物EGB761对D-半乳糖诱导的心肌细胞老化肌浆网钙摄取能力及肌浆网Ca2+-ATP酶(SERCA)活性的影响。方法实验分正常对照组(C组)、D-半乳糖组(5 g/L)(A组)、D-半乳糖+EGB761组(B组)。用荧光钙离子指示剂Fura-2/AM,激光共聚焦显微镜(LSCM)测定心肌细胞肌浆网钙摄取能力及改良的p-NPP法测定SERCA活性。结果与C组相比,A组心肌细胞舒张期钙离子浓度明显升高(0.71±0.08 vs.0.59±0.06)(P<0.05);舒张期钙离子回摄时间明显延长[(1000.95±129.34)ms vs.(775.15±121.68)ms](P<0.05);咖啡因刺激后,钙离子增幅明显减少(0.11±0.02 vs.0.53±0.19)(P<0.05),细胞内SERCA活性明显降低。与A组相比,B组舒张期钙离子浓度明显降低,舒张期钙离子回摄时间明显缩短;咖啡因刺激后,钙离子瞬变增幅明显增高,细胞内SERCA活性明显提高。结论银杏叶提取物EGB761对D-半乳糖诱导老化的心肌细胞肌浆网钙摄取功能和SERCA活性有一定程度的提高。

蒙药苏格木勒-3汤对异丙肾上腺素诱导HL-1心肌细胞钙超载损伤的影响

目的探讨苏格木勒-3汤治疗心力衰竭的可能作用机制。方法 HL-1心肌细胞按每孔1×10~5个细胞接种于96孔板,常规培养24h后进行分组:空白对照组的不加任何处理的正常心肌细胞;模型组加入终浓度为25μg/ml的异丙肾上腺素每孔100μl处理24h;苏格木勒-3汤高、中、低剂量组加入终浓度为25μg/ml异丙肾上腺素每孔100μl处理24h后分别加入75、50、25μg/ml苏格木勒-3汤水提液每孔100μl处理24h;苏格木勒-3汤对照组加入75μg/ml苏格木勒-3汤水提液每孔100μl处理24h。每组5个复孔。MTT法检测各组HL-1心肌细胞存活率,荧光显微镜检测细胞中钙离子浓度,Western blotting法检测HL-1心肌细胞中肌浆网钙ATP酶2a (SERCA2a)蛋白表达。结果与空白对照组比较,模型组HL-1心肌细胞存活率、SERCA2a蛋白表达下降(P<0.01)。与模型组比较,苏格木勒-3汤高、中剂量组HL-1心肌细胞存活率增高,苏格木勒-3汤高、中、低剂量组HL-1心肌细胞SERCA2a蛋白表达量均增加(P<0.01)。荧光显微镜下显示,模型组HL-1心肌细胞内钙离子浓度的荧光强度增加;与模型组比较,苏格木勒-3汤中、高剂量组对HL-1心肌细胞内钙离子浓度的荧光强度逐渐下降。结论蒙药苏格木勒-3汤对HL-1心肌细胞钙超载具有抑制作用,其机制可能与提高心肌细胞中SERCA2a蛋白表达有关。

左旋氨氯地平对缺氧心肌细胞钙超负荷的作用

目的观察左旋氨氯地平对缺氧心肌细胞钙离子超负荷的保护性作用。方法体外增养心肌细胞并建立心肌细胞缺氧模型,采用Fura2/am荧光探针在荧光分光光度计下直接测定各组心肌细胞内的游离钙离子浓度,通过RT-PCR方法分析细胞质膜上钙离子ATP酶的表达,并同时用WesternBlot方法测定肌浆网上钙泵的量。结果在左旋氨氯地平干预下缺氧心肌细胞的游离钙离子浓度显著降低(359.06±75.00nmol/L),同时增强了缺氧条件下的细胞质膜钙离子ATP酶的表达及肌浆网上钙泵的含量。结论左旋氨氯地平可以通过提高钙泵的表达来增强心肌细胞在缺氧条件下对钙超负荷的抵抗能力。

益心舒胶囊对心力衰竭大鼠心肌细胞钙调控蛋白的影响

在确定益心舒胶囊(Yixinshu Capsules,YXS)治疗心力衰竭(heart failure,HF)的基础上,从心肌细胞钙调控蛋白的角度探究YXS促进心衰大鼠心脏功能恢复的分子机制。将SD大鼠的左冠状动脉前降支结扎4周制备心肌缺血所致的心力衰竭动物模型,将大鼠随机分为假手术组(Sham,生理盐水)、模型组(HF,生理盐水)、益心舒胶囊高剂量组(HF+YXS-H,1 600 mg·kg-1·d-1)、益心舒胶囊低剂量组(HF+YXS-L,800 mg·kg-1·d-1)和阳性药缬沙坦组(HF+VST,8 mg·kg-1·d-1),连续灌胃6周后,处死大鼠,取心肌组织,采用实时定量PCR(RT-PCR)及蛋白质印迹(Western blot)法测定与心肌细胞钙调控相关基因及蛋白的表达。结果显示,与模型组相比,YXS治疗后增强心肌钙调控相关基因Atp2a2,Ryr2,CACNA1C和PRKACA转录水平,并提高p-Ryr2,CACNA1C及SERCA2a蛋白水平,而降低NCX1水平。另一方面,YXS治疗明显降低RIP3及其底物CaMKⅡ蛋白磷酸化水平,并增强了PLB磷酸化表达。综上所述,YXS治疗调节心肌钙调控相关基因及蛋白的表达,同时通过抑制RIP3及其底物CaMKⅡ蛋白磷酸化的水平,并促进PLB上的Ser16残基磷酸化,增加了SERCA2a蛋白表达,表明YXS可能通过CaMKⅡ/PLB/SERCA2a通路调节心肌钙稳态,提高肌浆网钙泵摄钙能力,使细胞内游离Ca2+趋于稳定,从而促进心衰大鼠心脏功能的恢复。该研究揭示了YXS在心力衰竭治疗中可能的作用机制,特别是从干预钙调控蛋白的角度,促进了YXS的临床应用。