人心肌肌钙蛋白I-C融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

提取人心肌组织总RNA,RT PCR扩增出人心肌肌钙蛋白I(cardiactroponinI,cTnI)和肌钙蛋白C(TnC)基因,利用人工合成的可编码 19个中性氨基酸残基为主的DNA序列(Linker),将cTnI和TnC基因连接,插入到质粒pET15b中,将鉴定正确的重组pET15b质粒转化入大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS中,用异丙基 β D$C硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达.结果在大肠杆菌中成功实现了全长cTnI C融合蛋白(cTnI linker TnC)的稳定可溶性高表达,在摇瓶中表达量可达 2 1mg/L.利用目的蛋白N端的组氨酸 标签"(His tag),经一步Ni2 + Sepharose柱亲和层析纯化,得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯蛋白质.经初步研究,cTnI C具有较好的免疫原性和稳定性,有望成为cTnI测定系统可溯源的候选参考物质。

心肌肌钙蛋白Ⅰ自身抗体间接酶联免疫吸附分析法的建立

目的建立以重组心肌肌钙蛋白I-C(cTnI-C)融合蛋白为包被抗原的间接酶联免疫吸附分析法(ELISA),检测人血循环中的抗cTnI自身抗体,为判断心肌损伤的预后提供依据。方法采用自行构建表达的cTnI-C融合蛋白作为包被抗原,以棋盘法优化实验条件,建立检测人血清cTnI自身抗体的间接ELISA方法。采用建立的间接ELISA法在121例急性心肌梗死(AMI)中筛查抗cTnI自身抗体,并用蛋白印迹法(WB)进行确证。结果 121例AMI血清抗cTnI抗体的阳性率为10.74%,ELISA试验的灵敏度100%,特异性95.37%,Kappa值为0.815。结论以cTnI-C融合蛋白作为包被蛋白建立的间接ELISA法具有良好的敏感度、特异性,可用于人血清抗cTnI自身抗体的筛查。

cTnI-C质控物制备与评价

目的:研制人心肌肌钙蛋白I-C(cTnI-C)质控物,并评价cTnI-C质控物的免疫反应性、均一性和稳定性。方法:使用重组的cTnI-C复合蛋白制备质控品,筛选合适基质和冻干保护剂,获得稳定的cTnI-C质控物。结果:胎牛血清基质更有利于cTnI-C质控物的稳定,添加3%海藻糖可显著提高cTnI-C质控物的热稳定性,质控物瓶间均一性无显著差异(F<2.39),37℃加速条件下可保存14 d,2~8℃贮存有效期为13个月,复溶后在2~8℃下可保存7 d。结论:本研究制备的cTnI-C质控物的免疫反应性、均一性和稳定性良好,可作为cTnI检测系统的校准物和质控物原料,提高临床实验室cTnI检测质量。