心肌锚定重复序列蛋白基因心脏特异敲除小鼠模型构建与鉴定

目的构建心肌锚定重复序列蛋白(CARP)基因心脏特异敲除小鼠模型,为研究CARP基因与心脏疾病的关系奠定基础。方法构建CARP基因条件打靶载体pL253-CARP-LoxP电转入小鼠胚胎干细胞(ES)细胞,G418和GANC药物筛选阳性细胞克隆,Southern blot确定CARP基因条件打靶载体转染成功。胚胎注射ES细胞入小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠与心脏特异启动子Cre小鼠(α-MHC-Cre)杂交。结果得到6只嵌合体小鼠,与α-MHC-Cre小鼠杂交获得CARP基因心脏特异敲除小鼠(CARP-KO),半定量RT-PCR和Western blot确定CARP基因在CARP-KO小鼠心脏缺失。该小鼠早期胚胎发育和个体生长、心脏发育正常,但心肌肥厚标志基因β-MHC和ANF显著升高(分别为2.25±0.04和1.45±0.03)(P<0.05)。结论成功构建CARP基因心脏特异敲除小鼠,CARP基因缺失对小鼠胚胎发育、个体生长和心脏发育没有显著影响。

心肌锚定重复序列蛋白CARP的研究进展

CARP是新发现的具有锚定重复序列,并在哺乳类动物中呈心肌特异性表达的蛋白,它在肌肉发育过程中对转录调控、肌纤维组装和拉伸信号传递等方面发挥重要的作用。本文综述了CARP基因与蛋白质结构、CARP的表达模式及其表达调控、参与调节CARP的细胞内信号转导通路、CARP在肌肉发育中的作用,以及MARP家族其他成员。

胶原蛋白三螺旋重复序列1调控表皮生长因子受体信号通路促进高血压心肌重构形成及其机制

目的 探讨胶原蛋白三螺旋重复序列1(CTHRC1)调控表皮生长因子受体(EGFR)信号通路在高血压心肌重构形成中的作用及其机制。方法 将SD大鼠随机分为以下3组:野生型对照(WTC)组、AngⅡ+Stuffer组和AngⅡ+CTHRC1组,每组10只。AngⅡ+Stuffer组和AngⅡ+CTHRC1组大鼠分别以1×10^(11)v.g.的剂量通过尾静脉注射Stuffer或CTHRC1进行预处理;注射4周后,大鼠接受渗透微型泵给药AngⅡ[1.5 mg/(kg·d)]持续4周以发展高血压,通过经胸超声心动图无创测量心脏功能,并采用Masson三色染相比,AngⅡ+stuffer组高血压大鼠心脏组织纤维化显著增加(P <0.05)。CTHRC1给药进一步加剧了高血压大鼠这些病理变化(P <0.05)。心脏超声显示,AngⅡ+CTHRC1组大鼠左心室射血分数降低和分数缩短程度较AngⅡ+stuffer组更大(P <0.05)。与对照组相比,AngⅡ色评估心脏纤维化。从2至3日龄SD大鼠的心脏中分离出心脏成纤维细胞(CF),分为:Con组、AngⅡ组、AngⅡ+sh-NC组、AngⅡ+shCTHRC1组和AngⅡ+sh-CTHRC1+Colivelin TFA组。通过CCK8试验、伤口愈合试验评估细胞增殖、迁移,二氢乙锭荧光染色检测活性氧(ROS)水平,蛋白质印迹分析CTHRC1蛋白和EGFR/Stat3信号通路表达。结果 与WTC组比较,AngⅡ组CF的增殖,EGFR、Stat3蛋白表达显著增加(P <0.05),sh-CTHRC1预处理显著逆转了AngⅡ诱导的CF增殖和EGFR、Stat3蛋白表达增加(P <0.05)。AngⅡ组中CF迁移、ROS水平和纤维化相关信号(COL1A1、COL3A1、TGF-β)基因表达较对照组均显著增加(P <0.05);sh-CTHRC1预处理显著逆转了AngⅡ诱导的这些变化(P <0.05)。此外,Colivelin TFA加入很大程度降低了sh-CTHRC1预处理对AngⅡ诱导的有益作用(P <0.05)。结论 CTHRC1过表达导致高血压大鼠心脏纤维化、结构损伤和功能障碍的增加,其作用机制与激活EGFR/Stat3信号通路介导的氧化应激有关。

过表达及RNA干扰糖尿病相关锚定重复序列蛋白基因腺病毒的制备及鉴定

目的构建含糖尿病相关锚定重复序列蛋白(DARP)基因的重组腺病毒过表达及RNA干扰载体。方法应用PCR技术扩增大鼠DARP基因序列,设计并合成shRNA序列,分别插入表达载体GV-314和GV-119,经基因测序鉴定。用重组DARP过表达和shRNA表达穿梭载体与辅助包装质粒pBHGloxΔE1共转染人胚肾细胞HEK293,进行病毒包装、出毒和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度。用重组腺病毒感染大鼠H9c2细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度,Western Blot检测DARP蛋白表达。结果基因测序显示DARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符,转染HEK293细胞包装成功。DARP过表达和shRNA腺病毒明显影响H9c2细胞中DARP蛋白表达水平。结论成功构建了大鼠DARP过表达及特异性shRNA腺病毒表达载体。

华支睾吸虫含串联重复序列的Cs22抗原蛋白的克隆及特征分析

目的通过免疫学筛选华支睾吸虫成虫λ-ZAP cDNA表达文库和EST数据验证,寻找新的抗原基因,并对其免疫学特征进行初步鉴定。方法使用华支睾吸虫病患者混合血清筛选获得阳性噬菌体克隆,测序后与EST数据进行比对,逆转录PCR(RT-PCR)获得Cs22全长基因序列。PCR跳跃技术获得重复序列次数为2和3次的cDNA片段,将含成熟肽和串联重复序列部分分别克隆至原核表达质粒pET28a(+)中,转化至宿主菌后,诱导表达获得重组蛋白rCs22-2r、rCs22-3r、rCs22M-2r和rCs22M-3r,使用组氨酸标签亲和纯化柱(Ni-NTA树脂)纯化。ELISA法鉴定重组蛋白rCs22-2r和rCs22-3r的免疫原性;检测35份华支睾吸虫虫卵粪检阳性的患者血清,15份日本血吸虫病、15份卫氏并殖吸虫病和13份猪囊尾蚴病的患者血清以及31份健康人血清,评价重组蛋白rCs22-2r和rCs22-3r的免疫学诊断价值。使用仅含串联重复多肽序列部分重组蛋白rCs22M-2r和rCs22M-3r,ELISA法分别检测华支睾吸虫病患者和健康人混合血清的特异性抗体,初步确定抗原决定簇位置。结果获得华支睾吸虫Cs22抗原基因的全长序列,其含有EQQDGDEEGMGGDGGRGKEKGKVEGEDGAGEQKEQA 36个氨基酸组成的串联重复多肽序列,共重复13次。生物信息学分析表明,Cs22蛋白为GPI锚定蛋白。ELISA结果显示,重组蛋白rCs22-2r和rCs22-3r具有一定的免疫原性;ELISA检测血清特异性抗体结果显示,华支睾吸虫病患者血清和健康人血清的阳性率均分别为45.7%(16/35)和3.2%(1/31),与日本血吸虫病和猪囊尾蚴病患者血清无交叉反应,与卫氏并殖吸虫病患者血清仅1份有交叉反应。ELISA法检测重组蛋白rCs22M-2r和rCs22M-3r结果显示,两者能区分华支睾吸虫病患者血清与健康人血清。结论获得华支睾吸虫Cs22抗原基因全长序列,其重组抗原蛋白具有一定的免疫学诊断价值,抗原决定簇位于串联重复多肽。

锚蛋白重复结构域1的研究进展

锚蛋白重复结构域1(ANKRD1)也被称为心肌锚定重复序列蛋白(CARP),由ANKRD1编码,是一种应激反应蛋白,为细胞质中的重要组成部分,而且是细胞核转录的重要辅助因子。其在细胞的表达水平,定位甚至病理应激类型不同,可发挥不同的功能。CARP作为肌肉锚蛋白重复蛋白家族的一员,在各种心脏疾病中高表达,但其发挥作用的机制及对相关病理生理学仍不清楚。本文从ANKRD1的结构及其在心脏疾病中的作用进行阐述。

水稻锚蛋白基因家族分析和锚定膜蛋白的表达模式研究

锚蛋白重复序列模体是生物体内最普遍的蛋白质序列模体之一,在多种细胞活动中主要介导蛋白质与蛋白质的相互作用。采用生物信息学的方法,在基因组水平上搜索和鉴定了水稻锚定重复序列蛋白,通过分析蛋白质二级结构,进行水稻锚蛋白基因家族的聚类分析,并在此基础上,用RT-PCR的方法分析水稻锚定膜蛋白的表达模式,为水稻锚蛋白基因的研究提供了理论依据。

XIRP2和HCN4在心肌脂肪浸润致猝死者心脏传导系统表达研究

目的:研究心肌脂肪浸润致猝死的法医病理学特征及传导组织中含心肌动蛋白重复序列蛋白2(XIRP2)和超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(HCN4)蛋白含量表达变化情况,探讨XIRP2和HCN4蛋白作为心肌脂肪浸润致猝死的潜在分子标记物的可能性。方法:收集某司法鉴定中心2015~2022年死因为心肌脂肪浸润致猝死者8例为猝死组,选取死因为外伤致死者10例为对照组进行统计、归纳和分析。通过大体检查、HE染色和Masson三色染色观察组织病理学改变,免疫组织化学染色(IHC)观察XIRP2和HCN4蛋白表达情况。结果:组织病理学检查示心肌脂肪浸润主要侵犯右心室、窦房结、房室结;IHC结果示猝死组较对照组的XIRP2和HCN4蛋白在窦房结、房室结表达升高,在左右束支表达降低(P<0.05)。心肌脂肪浸润猝死者窦房结和房室结XIRP2和HCN4蛋白表达水平高于左右束支(P<0.05),表达趋势与对照组相反。心肌脂肪浸润猝死者HCN4、XIRP2蛋白表达在窦房结与房室结之间差异有统计学意义。传导系统XIRP2与HCN4蛋白表达相关(P<0.05)。结论:心肌脂肪浸润主要表现为右心室合并窦房结、房室结内大量脂肪浸润,可能通过影响传导系统离子通道蛋白表达致心律失常引起猝死,XIRP2和HCN4蛋白在传导系统的表达差异可为该类案件的法医学鉴定提供参考。

氯沙坦钾通过抑制血清心肌锚定重复蛋白过表达逆转高血压心肌肥厚的临床研究

目的探讨氯沙坦钾是否通过抑制血清心肌锚定重复蛋白(CARP)的过表达来逆转高血压心肌肥厚,为高血压心肌肥厚的预防及治疗提供依据。方法于2015年9月至2016年3月选取在天津医科大学第二医院心内科门诊或急诊就诊的原发性高血压左室肥厚患者254例,随机分为氯沙坦钾组和对照组,每组各127例;对照组患者口服硝苯地平30mg,1次/d;氯沙坦钾组患者口服氯沙坦钾50 mg,1次/d;于治疗前、治疗3、6和12个月时测量CARP水平和室间隔厚度(IVST)、左室后壁厚度(LVPWT)及左室舒张末内径(LVDd),并计算左心室质量指数(LVMI)。采用SPSS 20.0统计软件进行t检验、χ~2检验、Pearson相关性分析和重复测量资料方差分析。结果对照组及氯沙坦钾组患者血清CARP水平与IVST、LVPWT、LVDd、LVMI均呈正相关(P<0.05)。氯沙坦钾组与对照组治疗12个月后,IVST、LVPWT、LVDd及LVMI均有所下降,且氯沙坦钾组CARP水平在整个治疗期间呈明显下降趋势(P<0.05)。氯沙坦钾口服剂量为100 mg患者的平均动脉压低于口服剂量为50 mg的患者和对照组患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论高血压患者血清CARP水平能反映心肌肥厚状况,氯沙坦钾可通过抑制CARP的过表达逆转高血压心肌肥厚。

miR-218对血管紧张素II诱导的心肌细胞肥大的影响

探讨miR-218对血管紧张素II(Ang II)诱导的心肌细胞肥大的影响。方法:Ang II处理心肌细胞48h,qPCR检测心房利钠肽(ANF)、miR-218和心肌锚定重复蛋白(Ankrd1)的表达。分别用mimic miR-218和inhibitor miR-218转染原代心肌细胞24h,随后用Ang II处理48h,利用免疫荧光染色技术检测心肌细胞面积。利用双荧光素酶报告基因技术检测miR-218对Ankrd1 3’UTR的调控,Western Blot检测Ankrd1的表达。结果:Ang II处理引起心肌细胞中miR-218表达下调;与对照组相比,mimic miR-218显著抑制了Ang II诱导的心肌细胞肥大,而inhibitor miR-218促进了Ang II诱导的心肌细胞肥大。Ang II处理引起Ankrd1表达增加,miR-218能靶向抑制Ankrd1的表达。结论:miR-218能抑制Ang II诱导的心肌细胞肥大,其作用机制可能与靶向抑制Ankrd1的表达相关。

心锚重复蛋白在急性心肌梗死中的表达及意义

心锚重复蛋白（cardiac ankyrin repeat protein，CARP）也常被称为ANKRDI蛋白（cardiac ankyrin repeat domain 1 protein），其他别名有c-193、MCARP等。它是由Chu等于1995年发现的一个核转录辅助因子，属于锚蛋白重复序列蛋白家族的保守基因，富含于成熟心脏，参与心脏形成和发育、维持心肌结构和功能完整等作用。

CARP抗体制备及表达模式分析

目的:制备心肌锚定重复序列蛋白(CARP)的抗体并分析其表达模式。方法:通过生物信息学对其抗原性进行分析,通过RT-PCR从小鼠的心肌cDNA中扩增了N-端279bp的片段,并克隆到表达载体pET28b中,使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化CARP蛋白,用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。利用制备的抗体,通过Western blot和免疫荧光的方法,分别检测了CARP在各组织和细胞中的表达模式。结果:制备了CARP抗体,进一步验证了CARP表达在蛋白水上呈心肌特异性,在大鼠心肌原代细胞中主要在细胞核中表达。结论:成功制备了CARP抗体,分析了CARP的表达模式,为进一步CARP的功能奠定了基础。

冠心病合并糖尿病患者血清CARP水平与冠脉病变关系的研究

目的:探讨冠心病合并糖尿病患者血清心肌锚定重复蛋白(CARP)水平和冠脉病变的关系。方法:选择住院并接受冠脉造影的患者147例,其中正常对照组(A组)33例,单纯冠心病组(B组)51例,冠心病合并糖尿病组(C组)63例,测定血清CARP、糖化血红蛋白(Hb A1c)水平,冠脉造影计算Gensini评分,探究CARP与它们的相关性。结果:冠心病合并糖尿病组血清CARP水平(24.39±8.31)较单纯冠心病组(14.31±7.77)及对照组(7.90±4.29)明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01);单纯冠心病组(r=0.670,P<0.01)及冠心病合并糖尿病组(r=0.732,P<0.01)血清CARP水平与Gensini评分均呈正相关;冠心病合并糖尿病组血清CARP水平与HbA1c(r=0.590,P<0.05)呈正相关。结论:(1)血清CARP有望成为冠心病合并糖尿病患者冠脉病变严重程度的新型预测标志物。(2)冠心病合并糖尿病患者血清CARP水平与HbAlc呈正相关。

两株抗鸡CARP单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的:制备抗鸡CARP单克隆抗体(McAb)。方法:克隆并原核表达鸡CARPN端110个氨基酸,纯化CARP蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性克隆;并利用ELISA、Western blot方法测定其效价和特异性。结果:获得2株能够稳定分泌抗鸡CARP的McAb杂交瘤细胞株,命名为4A8和4E6,亚型都属于IgG1,轻链为κ链;抗体腹水效价分别为3.2×104、1.28×105。Western blot检测到这两株抗体能够识别鸡CARP蛋白。结论:成功获得了2株能识别鸡CARP的杂交瘤及其分泌的特异性McAb。